煙葉表面微生物類(lèi)群兩種檢測(cè)方法的比較研究

龔 俊, 劉玉配, 李媛媛,2

(1.華東師范大學(xué)生態(tài)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院浙江天童國(guó)家森林生態(tài)系統(tǒng)野外觀測(cè)研究站,上海 200241; 2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司,上海 200082)

煙葉表面微生物類(lèi)群兩種檢測(cè)方法的比較研究

龔 俊1, 劉玉配1, 李媛媛1,2

(1.華東師范大學(xué)生態(tài)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院浙江天童國(guó)家森林生態(tài)系統(tǒng)野外觀測(cè)研究站,上海 200241; 2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司,上海 200082)

為研究克隆文庫(kù)法和高通量測(cè)序兩種方法對(duì)煙葉表面微生物類(lèi)群的檢測(cè)效果,確定檢測(cè)煙葉表面微生物多樣性的最優(yōu)方法,檢測(cè)了基于細(xì)菌16S rDNA和真菌ITS區(qū)域的烤煙表面微生物類(lèi)群的多樣性.結(jié)果顯示,高通量測(cè)序得到的序列數(shù)量比克隆文庫(kù)法多,兩種方法檢測(cè)到細(xì)菌的OTU數(shù)目相近,但高通量檢測(cè)的真菌OTU數(shù)目較多;稀疏曲線(xiàn)顯示高通量測(cè)序的數(shù)據(jù)飽和度更高;預(yù)計(jì)的群落多樣性(Chao1指數(shù)和Ace指數(shù))克隆文庫(kù)法均高于高通量測(cè)序法,實(shí)際的群落多樣性(Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù))表明克隆文庫(kù)法檢測(cè)的細(xì)菌多樣性略高,而高通量測(cè)序檢測(cè)的真菌多樣性略高;在檢測(cè)到的細(xì)菌和真菌種類(lèi)上,高通量測(cè)序略多于克隆文庫(kù)法,兩種方法檢測(cè)的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類(lèi)群基本一致,為假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬,但真菌類(lèi)群相差較大,且高通量測(cè)序檢測(cè)到大量新的真菌序列.總體上,高通量測(cè)序方法具有通量大、產(chǎn)出數(shù)據(jù)多的優(yōu)勢(shì),可更全面、更準(zhǔn)確地反映煙葉表面微生物群落結(jié)構(gòu).

克隆文庫(kù); 高通量測(cè)序; 細(xì)菌; 真菌; 煙葉

0 引 言

煙葉陳化是煙草加工過(guò)程中改善煙葉品質(zhì)的一個(gè)重要環(huán)節(jié),其實(shí)質(zhì)是在一定環(huán)境條件下,煙葉內(nèi)部理化特性發(fā)生緩慢而充分的變化.目前認(rèn)為煙葉發(fā)酵機(jī)理主要包括酶作用、微生物作用和化學(xué)作用三個(gè)方面[1].其中煙葉表面微生物不僅自身的生命活動(dòng)作用于煙葉的整個(gè)陳化過(guò)程,還通過(guò)代謝產(chǎn)生的生物酶參與煙葉的生理生化反應(yīng),促進(jìn)煙葉生物大分子化合物的轉(zhuǎn)化及致香成分的產(chǎn)生和積累,同時(shí)降低煙草中的有害物質(zhì),使煙葉品質(zhì)得到提高[2].因此,對(duì)煙葉表面微生物類(lèi)群的研究可客觀深入地了解煙葉化學(xué)成分的變化規(guī)律.

早期對(duì)煙葉發(fā)酵過(guò)程中微生物群落多樣性的研究主要通過(guò)平板分離并培養(yǎng)可培養(yǎng)微生物來(lái)確定優(yōu)勢(shì)菌群[3-4].但存在不同微生物的增殖差異問(wèn)題,并且99%的微生物不能在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)出來(lái)[5-6],因而難以客觀反映煙葉表面微生物類(lèi)群狀況.隨著分子生物學(xué)快速發(fā)展,利用變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)和限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)等分子技術(shù)鑒定煙葉發(fā)酵過(guò)程中微生物種類(lèi)的研究也越來(lái)越多[6-7].然而,這些方法通過(guò)觀察挑選電泳條帶進(jìn)行測(cè)序分析,局限于條帶的濃度,得到的結(jié)果不完全[8],因此也不能充分反映煙葉表面的微生物種類(lèi).

克隆文庫(kù)法通過(guò)構(gòu)建文庫(kù)并選擇一定數(shù)量的克隆進(jìn)行測(cè)序,一定程度上彌補(bǔ)了無(wú)法鑒定不可培養(yǎng)微生物的缺陷,近年來(lái)已較多地用于煙葉表面微生物類(lèi)群鑒定[9-11].隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,一種新的研究環(huán)境微生物群落多樣性的方法——宏基因組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生,基于高通量測(cè)序?qū)Νh(huán)境微生物群落多樣性進(jìn)行研究,可直接對(duì)從環(huán)境中獲得基因組樣品進(jìn)行測(cè)序分析,具有通量大、產(chǎn)出數(shù)據(jù)多、更為高效的優(yōu)勢(shì)[12],但目前鮮見(jiàn)應(yīng)用于煙葉表面微生物的檢測(cè).本研究應(yīng)用克隆文庫(kù)法和高通量測(cè)序兩種方法檢測(cè)烤煙煙葉表面微生物類(lèi)群多樣性,比較兩種方法檢測(cè)結(jié)果的差異,篩選優(yōu)勢(shì)環(huán)境微生物鑒定方法,為后續(xù)環(huán)境微生物區(qū)系及動(dòng)態(tài)變化研究提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2013年10月采集產(chǎn)地為福建、等級(jí)為C/挑的烤煙煙葉樣品,裝入無(wú)菌自封袋中于-72℃保存,以備提取煙葉表面微生物DNA.

1.2 微生物收集

參考Zhao等[6]和Su等[9]的方法收集煙葉表面微生物,具體步驟為：稱(chēng)取40 g煙葉樣品剪碎,置于裝有500 mL滅菌的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中,于27℃、210 r/ min的搖床上振蕩30 min,然后用單層紗布過(guò)濾,可得懸浮在磷酸緩沖液內(nèi)的葉表面大部分微生物.濾液用大容量離心機(jī)10 000×g離心30 min,收集沉淀即為煙葉表面微生物.

1.3 微生物總DNA提取

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(TIANGEN公司)進(jìn)行煙葉表面微生物總DNA的提取,即可得到煙葉表面細(xì)菌和真菌的總DNA.

1.4 克隆文庫(kù)法鑒定微生物類(lèi)群

1.4.1 PCR擴(kuò)增

細(xì)菌16S rDNA序列擴(kuò)增采用引物799F(5′-GGTAGTCCACGCCGTAAACGATG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約715 bp;真菌的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列的擴(kuò)增采用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′),擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約500 bp.PCR反應(yīng)體系如下, 150 ng模板DNA,1.25U Ex Taq聚合酶(Takara公司),1×Ex Taq Buffer(Mg2+plus), 200μmol/L dNTP Mixture,0.2μmol/L引物,補(bǔ)加滅菌ddH2O至50μL.PCR反應(yīng)程序如下,94℃5 min;(94℃1 min,Tm 45 s,72℃1 min)30個(gè)循環(huán);72℃8 min.其中擴(kuò)增16S r DNA序列的退火溫度為53℃,ITS序列為56℃.

1.4.2 克隆文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

PCR產(chǎn)物采用多功能DNA純化回收試劑盒(離心柱型)(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)純化回收.將PCR純化產(chǎn)物與p MD19-TVector(Takara公司)連接后轉(zhuǎn)入TOP10感受態(tài)細(xì)胞中(TIANGEN公司),在氨節(jié)平板上37℃培養(yǎng).挑選白色菌落用M13F和M13R載體引物擴(kuò)增驗(yàn)證陽(yáng)性克隆后,在上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序.

1.5 高通量測(cè)序分析微生物類(lèi)群

高通量測(cè)序在上海美吉生物工程有限公司進(jìn)行.細(xì)菌16S rDNA和真菌ITS測(cè)序均在Roche 454 GS FLX+測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行.細(xì)菌和真菌測(cè)序區(qū)域均與克隆文庫(kù)法相同,細(xì)菌測(cè)序引物是799F和1492R,真菌測(cè)序引物是ITS4和ITS5.

1.6 數(shù)據(jù)處理

克隆文庫(kù)法測(cè)序得到的序列去載體、拼接、比對(duì),采用B2C2[13]檢測(cè)并去除嵌合體序列后得到用于后續(xù)分析使用的優(yōu)化序列,采用mothur軟件[14]對(duì)優(yōu)化序列進(jìn)行操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units,OTU)聚類(lèi),以97%相似性為閡值,得到OTU代表序列.高通量測(cè)序得到的序列用Qiime v1.17[15]去雜過(guò)濾得到有效序列后用uchime-ref方法[16]去除嵌合體序列后得到優(yōu)化序列,在Usearch v7.1中調(diào)用uparse方法[17]對(duì)優(yōu)化序列按相似度97%進(jìn)行聚類(lèi),得到OTU代表序列.計(jì)算兩種方法測(cè)序數(shù)據(jù)的文庫(kù)覆蓋率(Coverage),文庫(kù)覆蓋率是計(jì)算測(cè)序深度的指標(biāo)[23],值越高表示樣品中序列被測(cè)出來(lái)的概率越大,計(jì)算公式為：

其中,n1為只含有一條序列的OTU數(shù),N為樣品中的優(yōu)化序列的數(shù)目.

對(duì)97%相似水平的OTU代表序列采用RDP Classifier方法[18-19]進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析,置信度閡值為95%.用mothur軟件對(duì)97%相似度的OTU做稀有度分析,利用SigmaPlot v12.5制作稀疏曲線(xiàn)圖.用mothur軟件計(jì)算4種多樣性指數(shù)：Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù).Chao1和Ace指數(shù)是利用現(xiàn)有結(jié)果對(duì)整個(gè)群落的OTU多樣性進(jìn)行預(yù)測(cè)的指標(biāo),其越大代表群落多樣性越高;Simpson和Shannon指數(shù)是對(duì)現(xiàn)有結(jié)果進(jìn)行OTU多樣性分析的指標(biāo),Simpson值越大說(shuō)明群落多樣性越低,Shannon指數(shù)值越大說(shuō)明群落多樣性越高.

Chao1指數(shù)[20]表示樣品中所含估計(jì)OTU的數(shù)目,計(jì)算公式為：

其中,SChao1為估計(jì)的OTU數(shù),Sobs為實(shí)際檢測(cè)到的OTU數(shù),n1為含有一條序列的OTU數(shù), n2為含有2條序列的OTU數(shù).

Ace指數(shù)[21-22]是用來(lái)估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù),計(jì)算公式為：

ni為含有i條序列的OTU數(shù)目;Srare為含有或少于“abund”條序列的OTU數(shù)目;Sabund為多于“abund”條序列的OTU數(shù)目;abund為劃分優(yōu)勢(shì)OTU的序列數(shù)量閡值,默認(rèn)10.

2 結(jié) 果

2.1 序列優(yōu)化與OTU聚類(lèi)

細(xì)菌16S rDNA：克隆文庫(kù)法獲得有效序列152條,優(yōu)化后序列共141條,以97%序列相似性為閡值,可聚類(lèi)為79個(gè)OTUs;而高通量測(cè)序獲得有效序列高達(dá)10 017條,優(yōu)化后得到4 861條,可聚類(lèi)為76個(gè)OTUs;兩種測(cè)序方法得到的序列應(yīng)用率分別為92.76%和48.53%(見(jiàn)表1).

真菌ITS：克隆文庫(kù)法獲得有效序列88條,優(yōu)化后共86條序列,以97%序列相似性為閡值,可聚類(lèi)為18個(gè)OTUs;而高通量測(cè)序獲得ITS有效序列5 742條,優(yōu)化后得到4 754條,優(yōu)化序列可分為37個(gè)OTUs.兩種測(cè)序方法得到的序列應(yīng)用率分別為97.73%和82.78%(見(jiàn)表1).

表1 序列優(yōu)化及OTU聚類(lèi)結(jié)果Tab.1 Results of trimmed sequences and OTU analysis

高通量測(cè)序法測(cè)得的細(xì)菌和真菌的覆蓋率都為100%.克隆文庫(kù)法細(xì)菌測(cè)序克隆數(shù)為163,其中測(cè)出序列152條,優(yōu)化序列的文庫(kù)覆蓋率為60.99%;真菌測(cè)序克隆數(shù)為91,其中測(cè)出序列88條,優(yōu)化序列的文庫(kù)覆蓋率為83.72%.

2.2 稀疏曲線(xiàn)

運(yùn)用兩種分析方法得到的細(xì)菌和真菌的稀疏曲線(xiàn)如圖1所示.高通量測(cè)序得到的不管是細(xì)菌還是真菌的稀疏曲線(xiàn)都呈現(xiàn)逐漸平緩的趨勢(shì),說(shuō)明數(shù)據(jù)飽和度較好;而克隆文庫(kù)法得到的細(xì)菌和真菌的稀疏曲線(xiàn)都呈陡峭的上升趨勢(shì),表明數(shù)據(jù)飽和度不夠,但序列間差異大,鑒別OTUs的比例高.

2.3 多樣性分析

兩種測(cè)序方法得到的多樣性指數(shù)見(jiàn)表2.克隆文庫(kù)法得到的細(xì)菌的Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)都較大,Simpson指數(shù)較小,說(shuō)明克隆文庫(kù)法得到的細(xì)菌群落預(yù)計(jì)的和實(shí)際的多樣性都較高.克隆文庫(kù)法得到的真菌的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)都較大,說(shuō)明克隆文庫(kù)法得到真菌群落預(yù)計(jì)的多樣性較大,而Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)顯示高通量測(cè)序得到的真菌實(shí)際多樣性更高.

表2 細(xì)菌和真菌的多樣性指數(shù)Tab.2 Diversity indices in bacterial and fungal communities

2.4 群落分類(lèi)情況

將測(cè)序得到的序列歸類(lèi)到各分類(lèi)水平后,統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示.已知和未知種類(lèi)總體上來(lái)看,克隆文庫(kù)法檢測(cè)到細(xì)菌共有3門(mén)6綱11目20科28屬,真菌共有3門(mén)6綱7目10科12屬.高通量測(cè)序共檢測(cè)到細(xì)菌有5門(mén)7綱16目30科44屬,真菌共有3門(mén)8綱13目15科19屬.從兩種方法檢測(cè)的比值來(lái)看,高通量測(cè)序檢測(cè)到的細(xì)菌和真菌種類(lèi)都高于克隆文庫(kù)法,并且一般來(lái)說(shuō)分類(lèi)水平越低,檢測(cè)到的種類(lèi)越多.

表3 兩種測(cè)序方法檢測(cè)到的細(xì)菌和真菌分類(lèi)情況Tab.3 Taxon of bacteria and fungi detected by two different methods

2.5 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與優(yōu)勢(shì)菌群

兩種測(cè)序方法得到的細(xì)菌群落在門(mén)分類(lèi)上的組成見(jiàn)圖2.克隆文庫(kù)法得到的細(xì)菌為3個(gè)門(mén),分別為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria),還有部分序列不能被分類(lèi)的歸為Unclassified;高通量測(cè)序得到的細(xì)菌可分為5個(gè)門(mén),除包括克隆文庫(kù)法得到的3個(gè)門(mén)外還有藍(lán)藻門(mén)(Cyanobacteria)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes),以及不能分類(lèi)的Unclassified,高通量測(cè)序鑒別的細(xì)菌門(mén)類(lèi)多于克隆文庫(kù)法.兩種測(cè)序方法檢測(cè)細(xì)菌門(mén)類(lèi)最多的都是變形菌門(mén),分別占90.78%和81.32%,得到的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)相同.克隆文庫(kù)法有部分細(xì)菌門(mén)如藍(lán)藻門(mén)和擬桿菌門(mén)沒(méi)有檢測(cè)到.

兩種方法得到的細(xì)菌群落在屬分類(lèi)上的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3.克隆文庫(kù)法檢測(cè)到的已知分類(lèi)的屬為14個(gè),高通量測(cè)序?yàn)?6個(gè),其中有11個(gè)屬共同檢測(cè)到.克隆文庫(kù)法檢測(cè)到類(lèi)群最多的3個(gè)屬分別是假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas),分別占9.22%、9.22%和6.38%;高通量測(cè)序檢測(cè)類(lèi)群最多的屬分別是假單胞菌屬、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、不動(dòng)桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬,分別占11.24%、7.66%、6.29%和6.00%.在屬的分類(lèi)水平上,高通量測(cè)序可以檢測(cè)到的細(xì)菌屬種類(lèi)更多,兩種測(cè)序方法得到的優(yōu)勢(shì)菌屬基本一致.

圖2 細(xì)菌群落在門(mén)分類(lèi)水平的結(jié)構(gòu)Fig.2 Bacterial community structure on phylum level

圖3 細(xì)菌群落在屬分類(lèi)水平的結(jié)構(gòu)Fig.3 Bacterial community structure on genus level

2.6 真菌群落結(jié)構(gòu)與優(yōu)勢(shì)菌群

兩種測(cè)序方法得到的真菌群落在門(mén)分類(lèi)上的組成見(jiàn)圖4.真菌中擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、子囊菌門(mén)(Ascomycota)和接合菌門(mén)(Zygomycota)3個(gè)門(mén)在兩種方法中都鑒定出來(lái),都有部分序列不能被分類(lèi)的歸為Unclassified.其中擔(dān)子菌門(mén)種類(lèi)最多,達(dá)60%以上,其次是子囊菌門(mén),最少的是接合菌門(mén).

兩種方法鑒定的真菌群落在屬分類(lèi)上的組成見(jiàn)圖5.克隆文庫(kù)法鑒定了10個(gè)已知分類(lèi)的真菌屬,高通量測(cè)序鑒定了11個(gè)已知分類(lèi)真菌屬,但是兩種方法鑒定為相同的屬只有1個(gè),為曲霉屬(Aspergillus).克隆文庫(kù)法獲得屬的比例都1%,其中比例最高的3個(gè)屬分別是紅酵母屬(Rhodotorula)、假絲酵母屬(Candida)和根霉屬(Rhizopus),分別占62.79%、19.77%和3.49%;高通量測(cè)序獲得的序列大部分都未能分到現(xiàn)有屬中(88.27%),比例1%的只有Meyerozyma屬、散囊菌屬(Eurotium)和翹抱霉屬(Emericella)3個(gè)屬,分別占5.37%、2.42%和2.13%.在屬分類(lèi)水平上,兩種方法鑒定的真菌屬種類(lèi)相差很大.

圖4 真菌群落在門(mén)分類(lèi)水平的結(jié)構(gòu)Fig.4 Fungal community structure on phylum level

圖5 真菌群落在不同屬分類(lèi)水平的結(jié)構(gòu)Fig.5 Fungal community structure on genus level

3 討 論

煙葉發(fā)酵過(guò)程微生物種類(lèi)繁多,也起到了不同的作用.本研究采用克隆文庫(kù)法和高通量測(cè)序法對(duì)煙葉表面微生物種類(lèi)進(jìn)行檢測(cè),在序列數(shù)量和OTU種類(lèi)上兩種方法差異都較大.克隆文庫(kù)法得到的序列數(shù)量與克隆的生長(zhǎng)和測(cè)序數(shù)目有關(guān),獲得幾百條序列已屬大量,而高通量測(cè)序一次反應(yīng)則至少能獲得上千條序列,表明高通量測(cè)序具有通量大、產(chǎn)出數(shù)據(jù)多的優(yōu)勢(shì)[12].但細(xì)菌OTU劃分結(jié)果顯示兩種方法獲得的種類(lèi)數(shù)量相差不多,分別為79(克隆文庫(kù)法)和76(高通量測(cè)序)個(gè),真菌OTU劃分結(jié)果顯示高通量測(cè)序獲得的OTU種類(lèi)(37個(gè))多于克隆文庫(kù)法(18個(gè)).本研究中高通量的OTU的建立采用較新的UPARSE方法,該方法比其他如QIIME和mothur等聚類(lèi)出OTU的數(shù)量少,但在與已知種類(lèi)的序列匹配、誤差率和嵌合子(chimeric)出現(xiàn)的概率等方面都有優(yōu)勢(shì)[17].

從兩種測(cè)序方法得到的文庫(kù)覆蓋率可以看出高通量測(cè)序得到的文庫(kù)覆蓋率更高,從稀疏曲線(xiàn)中也可以看出高通量測(cè)序得到的數(shù)據(jù)飽和度高,而克隆文庫(kù)法鑒定的序列差異大,遠(yuǎn)未達(dá)到飽和,這一結(jié)果與UPARSE方法分析高通量數(shù)據(jù)時(shí)統(tǒng)計(jì)方法有關(guān).UPARSE進(jìn)行高通量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí),對(duì)測(cè)出的單拷貝序列(只出現(xiàn)1次的單獨(dú)1條序列,singleton)進(jìn)行了優(yōu)化去除[17],大大降低了序列的差異性,使得計(jì)算的文庫(kù)覆蓋率為100%,在稀疏曲線(xiàn)中也呈現(xiàn)飽和,增加了結(jié)果的保守性,而克隆文庫(kù)法由于單拷貝序列的大量出現(xiàn)導(dǎo)致文庫(kù)覆蓋率降低,稀疏曲線(xiàn)無(wú)限增加[24].這也反映在預(yù)計(jì)的群落多樣性指數(shù)(Chao1指數(shù)和Ace指數(shù))上,克隆文庫(kù)法鑒定的細(xì)菌和真菌的預(yù)計(jì)多樣性均高于高通量測(cè)序法,顯示了保守性.而實(shí)際的群落多樣性(Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù))克隆文庫(kù)法得到的細(xì)菌多樣性略高,真菌的多樣性高通量測(cè)序的略高(見(jiàn)表2).類(lèi)似Chao1指數(shù)這類(lèi)多樣性指標(biāo)較多地依賴(lài)于單拷貝序列的數(shù)目,在高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的分析中受到質(zhì)疑[25].

從微生物組成情況可以看出,高通量測(cè)序檢測(cè)到的細(xì)菌和真菌的已知種類(lèi)均多于克隆文庫(kù)法,且分類(lèi)水平越低,檢測(cè)到的微生物種類(lèi)越多,在門(mén)分類(lèi)水平上兩種測(cè)序方法得到的細(xì)菌種類(lèi)差異最小,在科、屬水平上差異最大(見(jiàn)表3).兩種方法檢測(cè)的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(mén)相同,都為變形菌門(mén)(都占80%以上),其次是厚壁菌門(mén),與Su等用克隆文庫(kù)法[9]、Huang等用RFLP法[7]檢測(cè)煙葉表面細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)門(mén)一致.在屬分類(lèi)水平上,本研究?jī)煞N方法得到的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群基本一致,為假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬,高通量測(cè)序還有甲基桿菌屬也屬優(yōu)勢(shì)類(lèi)群.Su等[9]用克隆文庫(kù)法檢測(cè)到津巴布韋煙葉表面細(xì)菌可分為16個(gè)屬,其中有8個(gè)屬與本文檢測(cè)結(jié)果一致,優(yōu)勢(shì)菌屬為泛菌屬和假單胞菌屬,與本文檢測(cè)也基本一致.Huang等[7]采用RFLP法檢測(cè)到未陳化烤煙K326表面細(xì)菌可分為50種,優(yōu)勢(shì)菌屬為芽抱桿菌屬和假單胞菌屬.段焰青等[26]采用平板分離得到煙葉樣品中的細(xì)菌包括芽抱桿菌屬、類(lèi)芽抱桿菌屬、腸桿菌屬和泛菌屬與本文檢測(cè)結(jié)果一致,另有檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)和歐文氏菌屬(Erwinia)未在本研究中發(fā)現(xiàn).

本研究?jī)煞N方法檢測(cè)的真菌優(yōu)勢(shì)門(mén)也一致,都為擔(dān)子菌門(mén)和子囊菌門(mén).但屬的差異甚大,兩種方法只有一個(gè)共同屬,優(yōu)勢(shì)類(lèi)群也不同.本文高通量測(cè)序得到的真菌屬與段焰青等[26]分離得到的曲霉菌屬和鐮刀菌屬一致,克隆文庫(kù)法得到的根霉屬在段焰青等[26]研究中也分離得到了,只有木霉屬(Trichoderma)與本文結(jié)果有差異.另外,在高通量測(cè)序方法中有大量的序列沒(méi)有歸并到已知分類(lèi)的屬中(unclassified,88.27%),表明檢測(cè)到大量在數(shù)據(jù)庫(kù)中還未出現(xiàn)的真菌序列,這種情況在Edgar對(duì)真菌的檢測(cè)中也曾出現(xiàn)[17].

兩種測(cè)序方法得到的微生物多樣性存在一定差異,導(dǎo)致這種差異的原因主要有：①導(dǎo)入目標(biāo)DNA片段的大腸桿菌在培養(yǎng)基上成功生長(zhǎng)存在隨機(jī)性,導(dǎo)致某些微生物種類(lèi)沒(méi)有檢測(cè)到;②克隆文庫(kù)法存在文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序數(shù)量的限制導(dǎo)致獲得序列數(shù)不足,因而不如高通量測(cè)序法更能充分反映環(huán)境中微生物組成;③用于高通量的焦磷酸測(cè)序本身存在的固有測(cè)序誤差也會(huì)導(dǎo)致一些稀有微生物種類(lèi)的出現(xiàn)[12],尤其是由于單核昔酸重復(fù)(均聚體)易出現(xiàn)而導(dǎo)致ITS序列在454測(cè)序中容易出錯(cuò)[27].總體上,高通量測(cè)序具有通量大、產(chǎn)出數(shù)據(jù)多的優(yōu)勢(shì),因而可以更全面、更準(zhǔn)確地反映煙葉表面微生物種類(lèi)和結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),且隨著高通量測(cè)序方法日趨成熟、測(cè)序成本不斷降低,該方法將有望成為今后研究烤煙微生物多樣性的一種常用技術(shù)手段.

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(責(zé)任編輯：張晶)

Comparative analysis of microbial communities on tobacco leaves between clone library and high-throughput sequencing

GONG Jun1, LIU Yu-pei1, LI Yuan-yuan1,2
(1.Tiantong National Eield Observation Station for Eorest Ecosystem,School of Ecological and Environmental Sciences,East China Normal University,Shanghai 200241,China; 2.Shanghai Tobacco Group Corporation,Shanghai 200082,China)

In order to compare the microbial communities on tobacco leaves between clone library method and high-throughput sequencing method,we analyzed the diversity of microbial communities based on bacterial 16S rDNA and fungal ITS on tobacco leaves collected from Fujian province in China.The results showed that more numbers of bacterial and fungal sequences were detected by high-throughput sequencing than clone library.The number of operational taxonomic units(OTUs)clustered from high-throughput sequencing method was almost the same as thatfrom clone library method in bacterial communities,while that was higher from high-throughput sequencing in fungal communities.The rarefaction curves drawn from high-throughput sequencing method tended to approach the saturation plateau.The expected community diversity indices (Chao1 and Ace)were higher in clone library method,whereas the observed community diversity indices(Simpson and Shannon)suggested that higher bacterial diversities were detected through clone library method and higher fungal diversities were detected through high-throughput sequencing method.There were more kinds of bacteria and fungi genera identified through high-throughput sequencing method.The dominant genera of bacteria were similar detected from both of the methods,including Pseudomonas,Acinetobacter and Sphingonomonas.However,the fungal genera detected through these two methods were significantly different.Overall,novel high-throughput sequencing methods outperform clone library approaches in terms of resolution and magnitude.They enable identification and relative quantification of community members of tobacco leaves and offer new insights into environmental microbiology.

clone library; high-throughput sequencing; bacteria; fungi; tobacco leaves

Q33

A

10.3969/j.issn.1000-5641.2016.03.011

1000-5641(2016)03-0092-10

2015-04

煙草行業(yè)卷煙煙氣重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(SZBCW2013-00596)

龔 俊,女,碩士研究生,研究方向?yàn)榉肿由鷳B(tài)學(xué).E-mail：gongjun.2009163.com.

李媛媛,女,博士,副教授,研究方向?yàn)榉肿由鷳B(tài)學(xué).E-mail：yylides.ecnu.edu.cn.