大禿馬勃菌絲體多糖的發(fā)酵條件優(yōu)化及其抑菌作用

李作美，吳珊珊，陳佳

（蚌埠學院生物與食品工程系，安徽蚌埠233000）

大禿馬勃菌絲體多糖的發(fā)酵條件優(yōu)化及其抑菌作用

李作美，吳珊珊，陳佳

（蚌埠學院生物與食品工程系，安徽蚌埠233000）

采用單因素試驗及正交試驗對大禿馬勃菌絲體多糖的液態(tài)發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。以細菌作為供試菌種，采用濾紙片法對提取的大禿馬勃菌絲體多糖進行了抑菌實驗。結果表明，大馬勃液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件為發(fā)酵溫度28℃，轉速150 r/min，發(fā)酵時間8 d。在此最佳發(fā)酵條件下，菌體干質量為（7.08±0.51）g/L。抑菌實驗結果顯示，大禿馬勃菌絲體多糖對革蘭氏陽性菌有明顯地抑制作用，并且隨著多糖質量濃度的增大，抑菌作用越強。

大禿馬勃菌絲體；多糖；液態(tài)發(fā)酵；抑菌作用

大禿馬勃菌（Calvatia gigantea）又名灰包、馬糞包，隸屬于擔子菌門（Basidiomycota）、傘菌科（Agaricaceae），廣泛分布于世界各地。在中國主要產(chǎn)于內(nèi)蒙古、遼寧、安徽、甘肅、江蘇、云南等省區(qū)[1]。大禿馬勃菌是食藥用的大型真菌，幼時可以食用，但主要是用作清熱解毒的藥品，其主要有抑菌[2]、止血[3]、殺蟲[4]、抗腫瘤[5]、消腫、解毒[6-7]、清肺、鎮(zhèn)痛、抗炎[8-10]、治咳嗽[11]等作用。大禿馬勃菌的藥用功能主要是因為其含有豐富的生物活性物質，其含有多種氨基酸、麥角甾醇、類脂質、馬勃素、抗壞血酸、無機鹽和金屬離子等。大禿馬勃菌的食用和藥用性國內(nèi)外文獻均有記載。近代學者研究表明，大禿馬勃菌作為一種中藥材，在臨床上已經(jīng)廣泛應用，并且取得了顯著的療效，具有良好的發(fā)展前景。但由于大禿馬勃子實體的生長受到環(huán)境條件制約，產(chǎn)量有限。本試驗采用液態(tài)發(fā)酵法制備大禿馬勃菌絲體，用水提醇沉法提取大禿馬勃菌絲體粗多糖（Calvatia giganteapolysaccharides，CGP），并研究其抑菌作用，通過濾紙片法測定抑菌圈的大小來考察大禿馬勃多糖對細菌的抑菌能力，以便為今后更好地研究大禿馬勃菌絲體粗多糖的藥用功能提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

大禿馬勃菌（Calvatia gigantean）：廣東省微生物菌種保藏中心；枯草桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、變形桿菌（Proteus vulgare）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：均由蚌埠學院生物與食品工程系微生物學實驗室提供。

1.1.2化學試劑

蛋白胨、葡萄糖、硫胺素、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂、硫酸、苯酚等（均為分析純）：南京博岸生物科技有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：20%馬鈴薯汁1 L，葡萄糖20 g/L，磷酸二氫鉀3 g/L，硫酸鎂1.5 g/L，硫胺素8 mg/L，蛋白胨1 g/L，pH 5.6。滅菌溫度121℃，時間20 min。

20%馬鈴薯汁配制：新鮮馬鈴薯進行去皮稱質量200 g，切成小塊煮沸20 min，然后過濾，濾去土豆渣，濾液不足1 000 mL時用水補足。

1.2儀器與設備

LGJ-15D冷凍干燥機：北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；FA214電子分析天平、YXQ-LS-5011立式蒸汽壓力滅菌鍋、7HZ-103B恒溫搖床：博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；TGL-16G低速離心機：上海安亭科學儀器廠；RE-2000旋轉蒸發(fā)器：予華儀器有限責任公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市榮華儀器制造公司。

1.3實驗方法

1.3.1大禿馬勃菌菌種活化

將大禿馬勃菌種接入到固體斜面培養(yǎng)基中，放置在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h進行菌種的活化。

1.3.2大禿馬勃菌種子懸浮液的制備

將活化的大禿馬勃菌種接入液體培養(yǎng)基中，放置搖床中進行培養(yǎng)，然后用吸管吸取1 mL已活化好的菌液放入9 mL無菌生理鹽水中，振蕩搖勻，制成菌懸液，備用。

1.3.3大禿馬勃菌絲體粗多糖的制備工藝流程[12]

大禿馬勃菌→搖瓶培養(yǎng)→過濾→菌絲體水洗→60℃烘干→粉碎→熱水浸提→2 000 r/min離心10 min→收集上清液→真空濃縮→乙醇醇沉→2 000 r/min離心10 min→蒸餾水復溶→透析→冷凍干燥→粗多糖

操作要點：

搖瓶培養(yǎng)：在大禿馬勃菌裝液量為180 mL/250 mL、搖床轉速為150 r/min時，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間為8 d，接種量為20%的條件下進行培養(yǎng)，得到大禿馬勃菌絲體。

過濾：采用四層紗布對大禿馬勃菌絲體進行過濾，去濾液。

烘干：濾渣在60℃條件下真空干燥。

粉碎：粉碎過100目篩。

熱水浸提：浸提溫度為80℃，浸提時間為5 h，液料比為20∶1（mL∶g）。

真空濃縮：真空濃縮溫度為60℃，濃縮液呈現(xiàn)黏稠狀為止。

乙醇醇沉：乙醇體積分數(shù)為95%、加入量為濃縮液的2倍、醇沉時間為24 h。

透析：透析袋截留分子質量為14 000 u，采用去離子水進行透析，透析時間為48 h，每8 h更換一次去離子水。

冷凍干燥：溫度為-80℃，時間為3 d。

1.3.4發(fā)酵條件優(yōu)化的單因素試驗

在發(fā)酵溫度分別為22℃、25℃、28℃、31℃、35℃，接種量分別為5%、10%、15%、20%、25%，發(fā)酵時間分別為2 d、4 d、6 d、8 d、10 d，裝液量為180 mL/250 mL，搖床轉速為150 r/min條件下進行發(fā)酵試驗，考察發(fā)酵溫度、接種量及發(fā)酵時間對菌絲體干質量的影響。

1.3.5發(fā)酵條件優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎上，以菌絲體干質量為評價指標，發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時間（B）及接種量（C）為影響因素進行正交試驗，其因素和水平見表1。

表1　發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.6多糖含量的測定

采用硫酸-苯酚法[13]測定樣品中多糖含量。葡萄糖標準曲線的制作：精確稱取烘干至恒質量的葡萄糖0.100 g，加適量蒸餾水溶解，轉移至1 000 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。分別精確吸取葡萄糖標準溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL置于試管中，加水至2.0 mL，再分別加入6%苯酚溶液1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，靜置10 min后搖勻，在室溫條件下顯色30 min，以蒸餾水為參比，在波長490 nm處測定吸光度值。按照葡萄糖標準曲線回歸方程計算樣品中多糖含量。

1.3.7大禿馬勃菌多糖的抑菌性實驗

（1）活化供試菌種和制備菌懸液[14]

將4種供試菌種（枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及變形桿菌）接入到試管斜面進行活化，活化溫度為37℃，活化時間為24 h。然后將活化后的菌種分別接入液態(tài)培養(yǎng)基中，放入轉速為150 r/min的搖床進行培養(yǎng)。將培養(yǎng)后的4種供試菌分別用吸液管吸取1 mL菌液于三角瓶里，再用吸液管吸取9 mL無菌生理鹽水于菌液中，輕輕振蕩并搖均，制成菌懸液，濃度約為103～104CFU/mL，備用。

（2）抑菌實驗的設計

濾紙片法測定抑菌作用[14]。用打孔機將圓形濾紙片進行打孔，直徑為6 mm，然后取直徑為6 mm的圓形濾紙片于高壓滅菌鍋中進行濕熱滅菌，備用。按10倍稀釋法用蒸餾水將大禿馬勃菌多糖溶液分別稀釋為3個梯度，質量濃度分別為0.1 mg/mL、0.01 mg/mL及0.001 mg/mL。將濾紙片放入大禿馬勃菌多糖溶液中浸泡3 min。分別倒入15 mL已滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，從已活化好的供試菌液分別用吸管吸取0.1 mL，均勻的涂布在培養(yǎng)基的表面，再取出浸泡在不同質量濃度的大禿馬勃菌多糖溶液中的濾紙片并將其按一定的距離貼在平板上，將每個固體培養(yǎng)皿上貼3片，平均分布，每種菌種都要做3個平行試驗，采用浸泡在無菌水中的濾紙片作空白對照。再將制好的各培養(yǎng)皿放入溫度為37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h[15]。觀察并測定抑菌圈直徑的大小，通過測定抑菌圈的大小來考察抑菌效果。

2　結果與分析

2.1發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1培養(yǎng)溫度對大禿馬勃菌絲體干質量的影響

考察不同發(fā)酵溫度（22℃、25℃、28℃、31℃、34℃）對大禿馬勃菌絲體干質量的影響，結果見圖1。由圖1可知，發(fā)酵溫度為22～25℃時，為了適應新的培養(yǎng)條件，大禿馬勃菌絲體干質量呈現(xiàn)緩慢增長的趨勢；發(fā)酵溫度為28℃時，大禿馬勃菌絲體的生長最快，菌絲體干質量達到最高（6.98±0.51）g/L；發(fā)酵溫度＞28℃之后，菌絲體干質量逐漸減少。因此，選擇發(fā)酵溫度為28℃。

圖1　發(fā)酵溫度對大禿馬勃菌絲體產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature onCalvatia gigantea mycelia production

2.1.2發(fā)酵時間對大禿馬勃菌絲體干質量的影響

圖2　發(fā)酵時間對大禿馬勃菌絲體產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of fermentation time onCalvatia gigantea mycelia production

考察不同發(fā)酵時間（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d）對大禿馬勃菌絲體干質量的影響，結果見圖2。由圖2可知，發(fā)酵時間為2～4 d，菌絲體緩慢生長；發(fā)酵時間為4～6 d，菌絲體快速生長；發(fā)酵時間第8天時，菌絲體干質量達最大值（6.91±0.54）g/L；發(fā)酵時間＞8 d之后，菌絲體產(chǎn)量有所減少，可能是菌絲體開始出現(xiàn)自溶或是衰亡的現(xiàn)象造成的。因此，選擇發(fā)酵時間為8 d。

2.1.3接種量對大禿馬勃菌絲體干質量的影響

考察不同接種量（5%、10%、15%、20%、25%）對大禿馬勃菌絲體干質量的影響，結果見圖3。由圖3可知，接種量為5%～20%時，菌絲體干質量隨接種量增加而增加；接種量為20%時，菌絲體干質量達最大值（7.18±0.48）g/L；接種量＞20%之后，培養(yǎng)液的營養(yǎng)不足，菌絲體不能很好生長，菌絲體干質量有所下降。因此，選擇接種量為20%。

圖3　接種量對大禿馬勃菌絲體產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of inoculum onCalvatia giganteamycelia production

2.2多糖含量的測定

以葡萄糖質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線[16]，結果見圖4。由圖4可知，葡萄糖標準曲線的回歸方程為y=0.004 3x-0.003 0，相關系數(shù)R2為0.998 7，表明二者線性關系良好。樣液的吸光度值代入到回歸方程中進行計算，即可得到樣液中多糖的含量。

圖4　葡萄糖標準曲線Fig.4 Standard curve of glucose

2.3發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗基礎上，選擇發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時間（B）、接種量（C）為影響因子，以菌絲體干質量為評價指標，進行L9（33）正交試驗，結果與分析見表2。

表2　發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

由表2可知，影響菌絲體干質量的順序為發(fā)酵溫度（A）＞發(fā)酵時間（B）＞接種量（C），最佳發(fā)酵條件組合A2B2C2，即發(fā)酵溫度為28℃、發(fā)酵時間為8 d、接種量為20%。在此最佳發(fā)酵條件下，菌絲體干質量為（7.08±0.51）g/L。

2.4 CGP抑菌實驗結果分析

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌及枯草桿菌接種到平板上，在37℃培養(yǎng)24 h?？疾齑蠖d馬勃菌多糖溶液質量濃度分別為0.1 mg/mL和0.01 mg/mL及0.001 mg/mL對4種細菌的抑菌效果，結果見表3。

表3　大禿馬勃菌絲體多糖抑菌效果Table 3 Antibacterial effect ofCalvatia giganteamycelia polysaccharidesmm

由表3可知，大禿馬勃菌多糖對枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及變形桿菌均有一定的抑菌效果，而且對枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果要比大腸桿菌和變形桿菌要強。在大禿馬勃菌多糖溶液為0.001mg/mL時，大腸桿菌和變形桿菌的抑菌圈平均直徑分別為6.64 mm和7.13 mm，而枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑分別為9.21mm和9.97mm。而只有在抑菌圈直徑＞6 mm時才有抑菌效果。在大禿馬勃多糖溶液在0.1 mg/mL時，革蘭氏陰性菌大腸桿菌和變形桿菌的抑菌圈的平均直徑分別為8.55 mm和9.03 mm。而革蘭氏陽性菌枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈的平均直徑分別為12.94 mm和13.56mm。由此可見，大禿馬勃菌多糖抑菌活性的強弱與多糖質量濃度呈現(xiàn)一定的量效關系。

3　結論

結果表明，大禿馬勃菌在裝液量為180 mL/250 mL、搖床轉速為150 r/min時，大禿馬勃液體發(fā)酵的最佳的培養(yǎng)條件為發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時間8 d，接種量20%。在此最佳發(fā)酵條件下，菌絲體干質量為（7.08±0.51）g/L。抑菌實驗結果表明：大禿馬勃菌多糖對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌抑菌效果要強于大腸桿菌和變形桿菌，大禿馬勃多糖對革蘭氏陽性菌的抑制作用要大于革蘭氏陰性菌，并且呈現(xiàn)出一定的量效關系。

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Optimization of fermentation conditions of polysaccharide fromCalvatia gigantea mycelium and its antibacterial effect

LI Zuomei,WU Shanshan,CHEN Jia
(Department of Biology and Food Engineering,Bengbu University,Bengbu 233000,China)

The liquid state fermentation conditions of polysaccharides fromCalvatia giganteamycelia were optimized by single factor and orthogonal experiments.Using the bacteria as test strains,the antibacterial experiments of polysaccharides extracted fromC.giganteamycelia were conducted. The results showed that the optimum liquid state fermentation conditions were temperature 28℃,revolving speed 150 r/min and time 8 d.Under the optimum conditions,the mycelia dry mass was(7.08±0.51)g/L.The results of antibacterial experiments showed that polysaccharides fromC.gigantea mycelia had obviously inhibitory effect on gram-positive bacteria.And with the increasing of polysaccharide concentrations,the antibacterial effect was stronger.

Calvatia giganteanmycelia;polysaccharide;liquid state fermentation;antibacterial effect

TS201.3

0254-5071（2016）08-0120-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.027

2016-03-29

2013年度安徽高等學校省級自然科學研究項目（KJ2013Z202）

李作美（1975-），女，講師，碩士，研究方向為食品生物技術。