GC-MS/MS測定鎮(zhèn)江香醋中的氨基甲酸乙酯

唐雙雙，王韋崗

（鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇鎮(zhèn)江212132）

GC-MS/MS測定鎮(zhèn)江香醋中的氨基甲酸乙酯

唐雙雙，王韋崗

（鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇鎮(zhèn)江212132）

鎮(zhèn)江香醋中的氨基甲酸乙酯(EC)通過乙酸乙酯提取，用N-丙基乙二胺(PSA)分散固相萃取的方法凈化，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)法測定。結(jié)果表明，氨基甲酸乙酯(EC)的回收率達(dá)到96.7%，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2為0.999 7，最低檢出限為1 μg/kg。該方法簡單、快速、靈敏，能有效減少雜質(zhì)干擾。測定二十份不同廠家生產(chǎn)的鎮(zhèn)江香醋，均檢出氨基甲酸乙酯（EC）。表明鎮(zhèn)江香醋在生產(chǎn)發(fā)酵過程中，不可避免的會(huì)發(fā)生EC污染，應(yīng)采取措施進(jìn)行控制。

鎮(zhèn)江香醋；氨基甲酸乙酯；氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；分散固相萃取

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是發(fā)酵食物和酒精飲品在發(fā)酵和貯存過程中天然產(chǎn)生的污染物，在發(fā)酵食物中廣泛存在[1-2]，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)評定為2A類對人類可能的致癌物[3]，因此其對健康的影響而受到關(guān)注。醋是中國人日常生活中常用的調(diào)味品，許多人每天都會(huì)食用，而鎮(zhèn)江香醋作為我國的四大名醋，我國食醋行業(yè)唯一的原產(chǎn)地保護(hù)產(chǎn)品，深受廣大消費(fèi)者青睞?，F(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.223—2014《食品中氨基甲酸乙酯的測定》[4]和中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 0285—2012《出口酒中氨基甲酸乙酯殘留量檢測方法氣相色譜-質(zhì)譜法》[5]EC的檢測主要是針對酒類產(chǎn)品和醬油，還無食醋適用的標(biāo)準(zhǔn)。作為一種重要的釀造食醋，其中不可避免的含有EC，雖然每次通過食醋攝入的含量比較低，不會(huì)對健康造成太大影響，但常年累積的總量還可能對健康構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)，有必要對其中EC含量進(jìn)行監(jiān)測。

文獻(xiàn)報(bào)道食品中EC的檢測通常采用氣相色譜（gas chromatography，GC）[6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gaschromatography-mass spectrometer，GC-MS）[7-9]法和高效液相色譜-熒光檢測法（high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FLD）[10]。液相色譜法需要進(jìn)行衍生，而運(yùn)用GC或GC-MS法進(jìn)行直接檢測，當(dāng)遇到復(fù)雜基質(zhì)的時(shí)候，干擾比較大，低濃度時(shí)的定性確證存在爭議[11]，且檢出限高，目標(biāo)物與雜質(zhì)分離度差，造成定量不準(zhǔn)確。采用氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法（gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）[12]和超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra high performance liquid chromatography-electrospray tandem quadrupole mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）[13]法可以解決這類問題。

本研究采用氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/ MS）檢測鎮(zhèn)江香醋中的氨基甲酸乙酯，建立一種測定鎮(zhèn)江香醋中EC的方法。通過本研究可以監(jiān)測鎮(zhèn)江香醋中EC的污染情況，幫助企業(yè)了解食品安全風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)消費(fèi)者合理飲食，控制膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯（色譜純）：美國TEDIA公司；氯化鈉、無水硫酸鈉（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）填料（40～60 μm，60A）：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；鎮(zhèn)江香醋（符合GB/T 18623—2011《地理標(biāo)志產(chǎn)品鎮(zhèn)江香醋》[14]標(biāo)準(zhǔn)要求）：來自不同鎮(zhèn)江香醋生產(chǎn)廠家。

1.2儀器與設(shè)備

7890B/7000C三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；AL204型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TDZ5-WS臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)：長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；HP-5016氮?dú)獯蹈蓛x：上海濟(jì)成分析儀器有限公司；WH-2渦旋混合器：南京楚強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司；DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm）：美國J&W Scientific公司。

1.3方法

1.3.1氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取0.01 g（精確到0.000 1 g）氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，定容到10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；取0.1mL儲(chǔ)備液，用乙酸乙酯定容至100mL，配制成質(zhì)量濃度為1 000 μg/L的中間液；分別吸取0.01 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.60 mL、3.20 mL中間液，用乙酸乙酯定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L、80 μg/L、160 μg/L、320 μg/L的氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3.2樣品前處理

稱取2g鎮(zhèn)江香醋樣品放入離心管中，加入0.3g氯化鈉，5mL乙酸乙酯，在渦旋混合器上混勻1min，然后4000r/min離心5 min，吸取上清液過無水硫酸鈉，下層用5 mL乙酸乙酯重復(fù)提取兩次，合并提取液，室溫下用氮?dú)饩従彺抵良s0.5mL（不可以吹干），用乙酸乙酯定容至2mL，加入100mg PSA，漩渦混勻，離心后，取上清液供儀器分析。

1.3.3儀器分析條件

7890B/7000C三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，進(jìn)樣口溫度220℃；色譜柱DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm），初始溫度50℃，保持0 min，以10℃/min升至120℃，保持0 min，再以3℃/min升溫至150℃，保持0 min，最后以20℃/min升至230℃，保持3min；進(jìn)樣量1μL；載氣為高純氦氣（He），流速1 mL/min，不分流進(jìn)樣；接口溫度250℃，離子源230℃，四級(jí)桿Ⅰ150℃，四級(jí)桿Ⅱ150℃；猝滅氣（He）和碰撞氣（N2）流速分別2.25 mL/min和1.5 mL/min；多反應(yīng)監(jiān)測（multi-reaction monitoring，MRM）模式，碰撞能20 eV，監(jiān)測離子對m/z62/44（定量離子對），m/z62/44.9；電離方式：電子電離（electronionization，EI）源，電離能量70eV；溶劑延遲10min。

1.3.4定性定量方法

定性方法：以m/z 62為母離子經(jīng)二次碰撞后得到的碎片離子是m/z 44、m/z 44.9，豐度比為100∶33.5。樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在相同保留時(shí)間處出峰，且對應(yīng)碎片離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)品符合（允許±25%偏差），可定性確證為目標(biāo)分析物。

定量方法：采用外標(biāo)校準(zhǔn)曲線法定量測定。以碎片離子中豐度較高的m/z44為定量離子。進(jìn)樣系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以m/z44的豐度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中定量離子的豐度與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量。

2　結(jié)果與分析

2.1碰撞能優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線

運(yùn)用單四級(jí)桿質(zhì)譜得到EC的特征離子有m/z 44、62、74、89。實(shí)際樣品處理后進(jìn)樣，m/z 44、74存在較大的基體干擾，而m/z 89豐度較低，所以選用豐度大，干擾較小的m/z 62作為母離子，進(jìn)行碰撞能優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。取一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在碰撞能10 eV、20 eV、30 eV、40 eV、50 eV下進(jìn)樣。結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，在碰撞能為20 eV的時(shí)候，能夠得到最大的豐度，碎片離子分別為m/z 44和44.9，豐度比100∶33.5。豐度大可以提高靈敏度，降低檢出限，所以選用20 eV的碰撞能進(jìn)行樣品試驗(yàn)。

表1　碰撞能實(shí)驗(yàn)Table 1 Collision energy experiments

在上述優(yōu)化條件下，將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液依次進(jìn)樣，以氨基甲酸乙酯質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以定量離子m/z 44豐度（y）為縱坐標(biāo)，采用外標(biāo)法繪制氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1，氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品MRM模式下色譜圖見圖2。由圖1可知，氨基甲酸乙酯（EC）在1～320μg/L的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=20.506x+ 19.731，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 7。當(dāng)鎮(zhèn)江香醋樣品的取樣量為2 g時(shí)，檢出限可以達(dá)到1 μg/kg。

圖1　氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ethyl carbamate

圖2　氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of ethyl carbamate standard

2.2前處理?xiàng)l件

鎮(zhèn)江香醋樣品基質(zhì)比較復(fù)雜，要測定其中的氨基甲酸乙酯含量需要先對樣品進(jìn)行凈化處理。多數(shù)文獻(xiàn)采用固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）柱法進(jìn)行凈化[7-8，10-12]。近年來也有文獻(xiàn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)采用基質(zhì)分散固相萃?。╠is persive solid phase extraction，d-SPE）的凈化方法[5，9]。本實(shí)驗(yàn)分別比較了兩種方法，固相萃取法參照GB 5009.223—2014執(zhí)行。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種方法都能達(dá)到良好的凈化效果，可以有效除去醋中大量的氨基酸、有機(jī)酸和色素等成分且回收率相近。但是硅藻土固相萃取法需要使用到正己烷、乙酸乙酯、乙醚等大量有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫，成本較高，操作步驟多。而基質(zhì)分散固相萃取法簡單、快速、重復(fù)性好。所以選用基質(zhì)分散固相萃取法進(jìn)行樣品實(shí)驗(yàn)。

2.3回收率試驗(yàn)

稱取氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為50 μg/mL的溶液，吸取0.1 mL樣品加入到食醋樣品中，使該樣品的總質(zhì)量為100.00 g。該樣品中加標(biāo)質(zhì)量濃度為50 μg/kg。準(zhǔn)確稱取2.00 g樣品，處理后測定，計(jì)算回收率。重復(fù)6次，得到平均回收率。結(jié)果如表2所示。由表2可知，樣品的平均回收率為96.7%，在90%～110%范圍內(nèi)；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為2.37%＜5%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

表2　加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of addition standard recovery experiments

2.4樣品的測定

選取20份不同廠家生產(chǎn)的鎮(zhèn)江香醋樣品進(jìn)行檢測，在上述氣質(zhì)色譜條件下，得到的陽性樣品色譜圖清晰，與雜質(zhì)分離度良好，其中樣品12的色譜圖分析結(jié)果見圖3。根據(jù)樣品譜圖、對照標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間及碎片離子，以m/z 44定量，m/z 44.9定性，在對應(yīng)保留時(shí)間下，豐度比100∶33.5（±25%）判定為陽性樣品，檢測結(jié)果見表3。由表3可知，20份樣品全部含有氨基甲酸乙酯，含量從21.18～73.57 μg/kg。我國目前雖然制定了酒類和醬油中EC檢測的標(biāo)準(zhǔn)，但還沒規(guī)定其限值。國際上多個(gè)國家已經(jīng)制定了部分食品中氨基甲酸乙酯的限量標(biāo)準(zhǔn)。如加拿大規(guī)定了各類酒中的限量值，其中佐餐葡萄酒30 μg/L；美國佐餐葡萄酒15 μg/L，餐后甜葡萄酒60 μg/L。聯(lián)合國糧農(nóng)組織也在2002年規(guī)定飲料中氨基甲酸乙酯的含量不得超過20 μg/L。參照這些國際標(biāo)準(zhǔn)，本次實(shí)驗(yàn)測得鎮(zhèn)江香醋中氨基甲酸乙酯含量都在20 μg/kg以上，表明鎮(zhèn)江香醋中的氨基甲酸乙酯含量較高。

圖3　鎮(zhèn)江香醋樣品中氨基甲酸乙酯MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of ethyl carbamate in Zhenjiang vinegar samples

表3　 20份鎮(zhèn)江香醋樣品氨基甲酸乙酯含量Table 3 Ethyl carbamate content of 20 Zhenjiang vinegar samples

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法測定鎮(zhèn)江香醋中氨基甲酸乙酯含量的方法。該方法回收率96.7%，檢出限1 μg/kg，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 7，表明該方法能滿足鎮(zhèn)江香醋中氨基甲酸乙酯檢測的需要。相比單四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用法，該方法可以有效的減少雜質(zhì)干擾，降低檢出限，增加定量準(zhǔn)確性，同時(shí)該方法也可以推廣到其他釀造食醋中EC的檢測，可以為標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。已經(jīng)有研究分析黃酒等酒類中氨基甲酸乙酯的形成機(jī)理及控制方法[15-16]，而本研究中20份樣品全部檢出氨基甲酸乙酯，表明氨基甲酸乙酯污染在鎮(zhèn)江香醋中普遍存在，所以下一步應(yīng)在食醋當(dāng)中做相應(yīng)的研究，加強(qiáng)生產(chǎn)過程中的監(jiān)控，規(guī)范和改善工藝條件，使該污染盡可能的維持在較低的水平。我國尚無標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定食醋中氨基甲酸乙酯的限量，應(yīng)盡快制定相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)，以標(biāo)準(zhǔn)促生產(chǎn)，才能更好地保護(hù)人身健康。

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Determination of ethyl carbamate in Zhenjiang vinegar by GC-MS/MS

TANG Shuangshuang,WANG Weigang
(Zhenjiang Institute of Supervision and Inspection of Product Quality,Zhenjiang 212132,China)

Ethyl carbamate(EC)in Zhenjiang vinegar was extracted by ethyl acetate,the solution was purified by primary secondary amine dispersion solid-phase extraction method,then was determined by GC-MS/MS.The results showed that the recovery rate of EC was up to 96.7%,correlation coefficientR2of standard curve was 0.999 7,the lowest limit of detection was 1 μg/kg.The method was simple,fast and sensitive,which could effectively reduce the interference of impurities.EC was detected in 20 Zhenjiang vinegar products from different manufacturers,which indicated that EC pollution was unavoidable during the process of Zhenjiang vinegar fermentation,and measures should be taken to control.

Zhenjiang vinegar;ethyl carbamate;GC-MS/MS;dispersive solid phase extraction

TS264

0254-5071（2016）08-0159-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.036

2016-03-30

唐雙雙（1982-），女，工程師，碩士，主要從事食品添加劑及食品中污染物檢測工作。