HPLC-ELSD法測(cè)定新疆藥桑葉中1-脫氧野尻霉素的含量

王賀，張貴會(huì)，楊玲

（塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾市843300）

HPLC-ELSD法測(cè)定新疆藥桑葉中1-脫氧野尻霉素的含量

王賀，張貴會(huì)，楊玲*

（塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾市843300）

該研究采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)(HPLC-ELSD)法測(cè)定新疆藥桑葉中1-脫氧野尻霉素(1-DNJ)的含量，色譜柱為Waters XBridgeTMHILIC(2.1 mm×100 mm,5 μm)，乙腈-水(85∶15,V/V)為流動(dòng)相，流速0.2 mL/min。結(jié)果表明，1-DNJ在1.2～12.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為98.25%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.16%。該方法快捷簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠，可用于藥桑葉中1-脫氧野尻霉素含量的分析檢測(cè)。

藥桑葉；1-脫氧野尻霉素；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法；測(cè)定

新疆藥桑在植物分類學(xué)上屬桑科（Moraceac）桑屬（MorusL.）黑桑種（Morus nigraL.），主要分布在新疆的南疆地區(qū)，由于該地域獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境形成了極為罕見(jiàn)的22倍染色體的獨(dú)有的桑樹(shù)資源[1-2]。藥桑葉是成熟藥桑樹(shù)的葉片，《本草綱目》中記載：桑葉“汁煎代茗，能止消渴”、“灸熟煎飲，代茶止渴”，歷代醫(yī)學(xué)古籍都有記載桑葉治療消渴癥的描述，消渴癥即是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)俗稱的糖尿病。現(xiàn)代藥理研究表明，桑葉具有降血糖的作用，其降血糖活性成分為多羥基生物堿[3-4]，其中主要成分為1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin,1-DNJ），化學(xué)名稱為3,4,5-三羥基-2-羥甲基四氫吡啶，分子式C6H13NO4，分子質(zhì)量為163。1-DNJ是一種天然糖的結(jié)構(gòu)類似物，極性很大，因結(jié)構(gòu)與糖非常類似，能夠競(jìng)爭(zhēng)性的抑制二糖與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合，阻止麥芽糖、異麥芽糖、蔗糖等二糖水解為單糖被人體吸收，從而明顯降低餐后血糖濃度峰值，因此能用于治療II型糖尿病[5-7]、肥胖癥等疾病。并且其還具有抗病毒及抗艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）[8-9]、抗腫瘤轉(zhuǎn)移等作用[10]，高效低毒，有優(yōu)越的保健食用及藥用價(jià)值。

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporativelightscatteringdetector，ELSD）是通用的高效液相色譜（high perfarmance liquid chromatography，HPLC）質(zhì)量檢測(cè)器，可以直接檢測(cè)無(wú)紫外吸收或熒光官能團(tuán)物質(zhì)。1-DNJ是一種不帶發(fā)色基團(tuán)的小分子含氮化合物，含有大量羥基親水集團(tuán)，在反相色譜柱上保留時(shí)間短。目前多利用熒光試劑芴甲氧羰酰氯（fluo renylmethyl chloroformate，F(xiàn)MOC-Cl）進(jìn)行柱前衍生[11-13]，由于桑葉1-DNJ提取液為淡黃色溶液，少量顏色的存在一定程度上會(huì)對(duì)溶液的吸光度產(chǎn)生影響，而柱前衍生化操作繁瑣，需要嚴(yán)格控制衍生化條件，成本較高。所以本研究采用高效液相色譜法對(duì)新疆藥桑葉中1-DNJ進(jìn)行分析檢測(cè)，旨在為新疆藥桑資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新疆藥桑葉：2014年7月20號(hào)采自新疆庫(kù)車(chē)地區(qū)。采后自然晾干后粉碎，過(guò)100目篩于干燥處保存，備用。

1-DNJ對(duì)照品（純度98%）：成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈（色譜純）：迪馬科技有限公司；純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；732型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：山海山浦化工有限公司；無(wú)水乙醇、NaOH（分析純）：天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；HCl（分析純）：四川西隴化工有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀、Waters 2424型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）：美國(guó)Waters公司；Agilent Technologies 6410 Triple QuadL c/Ms三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（配有Agilent Technologies高效液相色譜系統(tǒng)）：美國(guó)安捷倫公司。

1.3方法

1.3.1樹(shù)脂處理

732型陽(yáng)離子樹(shù)脂用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液反復(fù)浸泡洗滌至洗出液澄清，無(wú)異味，再分別用2 mol/L HCl溶液浸泡4 h，水洗至中性，2 mol/L NaOH溶液浸泡4 h，水洗至中性，2 mol/L HCl溶液浸泡4 h，水洗至中性備用。

1.3.2溶液的制備

1-DNJ對(duì)照品溶液的制備：精密稱取1-DNJ對(duì)照品1mg，用乙腈-水（50∶50，V/V）溶液溶解并定容至10 mL容量瓶，搖勻，即得質(zhì)量濃度為100 μg/mL 1-DNJ對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：精密稱取藥桑葉1.000 0 g，參考劉一衡等[14]的方法提取，用20 mL體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，超聲功率800 W，溫度60℃提取20 min，提取液濃縮至10 mL，加入3倍體積的體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，4℃靜置過(guò)夜，5 000 r/min離心10 min除去沉淀，上清液濃縮除去乙醇后，溶于10 mL水中，過(guò)732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，以0.5 mol/L的氨水洗脫，洗脫液減壓濃縮，用乙腈-水（50∶50，V/V）溶液定容于5 mL容量瓶中，作為供試品溶液。臨用前溶液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。

1.3.3色譜檢測(cè)條件

HPLC條件：色譜柱為WatersXBridgeTMHILIC（2.1mm× 100 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（85∶15，V/V）；流速：0.2 mL/min；柱溫：30℃；ELSD漂移管溫度52℃；氮?dú)鈮毫Γ?0 psi；增益：60；噴霧器模式：冷卻；進(jìn)樣量：10 μL。

2　結(jié)果與分析

2.1對(duì)照品和樣品中1-DNJ的HPLC色譜圖

采用HPLC-ELSD法分別對(duì)1-DNJ對(duì)照品溶液和供試品溶液按照色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，所得HPLC色譜圖如圖1所示。

因1-DNJ含有較多羥基，且均為氨基糖類，此類化合物在C18柱上保留差，本實(shí)驗(yàn)選用Waters XBridgeTMHILIC（2.1 mm×100 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-水系統(tǒng)對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。由圖1可知，1-脫氧野尻霉素的峰形良好且達(dá)到完全分離。結(jié)果表明樣品中1-DNJ與對(duì)照品保留時(shí)間一致，說(shuō)明桑葉中含有1-DNJ。

2.2線性關(guān)系的考察

取100 μg/mL的1-DNJ對(duì)照品溶液，用乙腈-水（50∶50，V/V）稀釋成質(zhì)量濃度為1.2 μg/mL、2.4 μg/mL、4.8 μg/mL、9.6μg/mL、12.0μg/mL，取各質(zhì)量濃度溶液，依次進(jìn)樣10μL，按1.3.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以1-DNJ對(duì)照品峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以1-DNJ對(duì)照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性加權(quán)回歸，權(quán)重系數(shù)為1/X，得1-DNJ對(duì)照品的線性回歸方程為：Y=3 327 031.944X-2 617 168.667（R2=0.999 01），結(jié)果在1.2～12.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，1-DNJ質(zhì)量濃度和峰面積線性關(guān)系良好。

2.3靈敏度試驗(yàn)

取1-DNJ對(duì)照品溶液，稀釋制成一系列的溶液作為供試品溶液，進(jìn)行高效液相色譜分析，最終確定1-DNJ質(zhì)量濃度0.2 μg/μL。分別進(jìn)樣2 μL、4 μL、5 μL、8 μL和10 μL進(jìn)行高效液相色譜分析，根據(jù)高效液相色譜圖分析可知進(jìn)樣量為5 μL時(shí)峰形較好，所以本實(shí)驗(yàn)確定1-DNJ最低檢測(cè)量為1 μg/mL。

2.4精密度試驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為100 μg/mL的1-DNJ對(duì)照品溶液，按1.3.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣5次（n=5），每次10 μL，記錄1-DNJ對(duì)照品色譜峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，5組平行試驗(yàn)峰面積平均值為17 740 900，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.76%，表明本方法的精密度良好。

表1　精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of precision experiments

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱量藥桑葉粉末適量，按1.3.2的制備方法制得供試品溶液，放置0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，每次進(jìn)樣10 μL，分別進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，1-DNJ色譜峰面積的RSD為2.51%，表明供試品溶液在室溫條件下放置10 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2　穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 2 Results of stability experiments（n=5）

2.6重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批藥桑葉樣品，精密稱取5份，按1.3.2的制備方法制得供試品溶液，按1.3.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，進(jìn)行5次平行試驗(yàn)測(cè)得樣品中1-DNJ的平均含量為1.95 mg/g，RSD為2.68%。表明本方法的重復(fù)性良好。

表3　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 3 Results of repeatability experiments（n=5）

2.7回收率試驗(yàn)

精密量取已測(cè)知含量的藥桑葉樣品5份，分別加入1-DNJ對(duì)照品粉末，按1.3.2制備方法制得供試品溶液，取10 μL進(jìn)樣，按1.3.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果（見(jiàn)表4）可知，1-DNJ在1.30～1.60 mg/g添加范圍內(nèi)的平均回收率為98.25%，RSD為1.16%。

表4　 1-脫氧野尻霉素加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of adding standard recovery rate experiments of 1-DNJ

2.8樣品測(cè)定

取桑葉1.0000g按1.3.2的制備方法制得供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，按1.3.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表5所示。

表5　藥桑葉中1-脫氧野尻霉素含量測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of 1-DNJ contents inMorus nigra L.leaves

由表5可知，本批次藥桑葉中1-脫氧野尻霉素平均含量為1.93 mg/g，RSD為1.80%。買(mǎi)買(mǎi)提依明]等[19測(cè)定藥桑葉中1-脫氧野尻霉素的含量為1.89 mg/g，本實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果稍高的原因可能是采用732型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂處理樣品，主成分經(jīng)過(guò)了富集，消除了其他雜質(zhì)的干擾，能更好地進(jìn)行測(cè)定。

3　結(jié)論

本研究采用HPLC-ELSD法測(cè)定新疆藥桑葉中1-脫氧野尻霉素的含量。精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重現(xiàn)性試驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)的RSD均在合理范圍內(nèi)，方法快捷簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠，具有較高的精密度和準(zhǔn)確性。成熟藥桑葉中1-脫氧野尻霉素平均含量為1.93 mg/g。該方法適用于藥桑葉中1-脫氧野尻霉素含量的分析檢測(cè)，也可用于其他具有類似結(jié)構(gòu)的化合物的分析測(cè)定，為該類型化合物的質(zhì)量控制方法提供依據(jù)；也為新疆藥桑資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考依據(jù)。

[1]中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所.中國(guó)桑樹(shù)品種志[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1993：288.

[2]傅大煦.新疆桑屬植物種質(zhì)資源與藥效成分研究[D].上海：復(fù)旦大學(xué)，2004.

[3]KIM Y M,WANG M H,RHEE H I.A novel α-glucosidase inhibitor from pine bark[J].Carbohyd Res,2004,339(3)：715-7.

[4]夏學(xué)軍，汪仁蕓，劉玉玲.柱前衍生化RP-HPLC法測(cè)定桑枝總生物堿的含量[J].中國(guó)新藥雜志，2008，17（23）：2044-2047.

[5]楊雨，歐陽(yáng)臻，常枉，等.桑葉不同組分降血糖作用研究[J].食品科學(xué)，2007，28（8）：454-456.

[6]李孌，路娟，李永吉，等.桑葉中降糖活性成分篩選及其藥效學(xué)研究[J].中醫(yī)藥信息，2012，29（5）：10-14.

[7]趙保勝，桂海水，朱寅荻，等.桑葉降糖有效部位及其作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2013，27（2）：77-79.

[8]ASANO N,TOMIOKA E,KIZU H,et al.Sugars with nitrogen in the ring isolated from the leaves ofMorus bombycis[J].Carbohyd Res,1994, 253(3)：235-245.

[9]彭忠田，申璀，譚德明，等.脫氧野尻霉素衍生物抗乙型肝炎病毒的體外試驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥房，2007，18（1）：22-24.

[10]歐陽(yáng)臻，陳均.桑葉的化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，24（6）：39-44.

[11]肖洪，黃先智，沈以紅，等.響應(yīng)面法優(yōu)化提高發(fā)酵桑葉茶中1-脫氧野尻霉素含量工藝[J].食品科學(xué)，2014，35（10）：46-51.

[12]劉凡，李平平，廖森泰，等.98份不同桑樹(shù)品種資源的桑葉總生物堿及1-脫氧野尻霉素含量測(cè)定[J].蠶業(yè)科學(xué)，2012，38（2）：185-191.

[13]楊兵，歐陽(yáng)臻，趙明，等.不同生長(zhǎng)季節(jié)桑葉中1-脫氧野尻霉素、蘆丁及多糖含量動(dòng)態(tài)研究[J].中藥材，2012，35（6）：876-879.

[14]劉一衡，楊玲.正交設(shè)計(jì)優(yōu)化新疆藥桑桑葉總生物堿超聲提取工藝[J].食品工業(yè)科技，2013，34（24）：306-308.

[15]VICHASILP C,NAKAGAWA K,SOOKWONG P,et al.Development of high 1-deoxynojirimycin(DNJ)content mulberry tea and use of response surface methodology to optimize tea-making conditions for highestDNJextraction[J].LWT-Food Sci Tech,2012,45(2)：226-232.

[16]ASANO N,YAMASHITA T,YASUDA K,et al.Polyhydroxylated alkaloids isolated from mulberry trees(MorusalbaL.)and silkworms (Bombyx moriL.)[J].J Agr Food Chem,2001,49(9)：4208-4213.

[17]KIM J Y,MU Y,JIN X,et al.Efficient and stereoselective syntheses of DAB-1 and D-fagomine via chiral 1,3-oxazine[J].Tetrahedron,2011, 67(48)：9426-9432.

[18]KIM J W,KIM S U,LEE H S,et al.Determination of 1-deoxynojirimycin inMorus albaL.leaves by derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate followed by reversed-phase high-performance liquid chromatography[J].J Chromatogr A,2003,1002(1-2)：93-99.

[19]買(mǎi)買(mǎi)提依明，吳麗莉，左少純，等.新疆藥桑營(yíng)養(yǎng)功能性成份及藥理作用的分析研究[C].全國(guó)桑樹(shù)種質(zhì)資源及育種和蠶桑綜合利用學(xué)術(shù)研討會(huì).鎮(zhèn)江：中國(guó)蠶學(xué)會(huì).2005：39-43.

Determination of 1-deoxynojirinycin content inMorus nigraL.leaves from Xinjiang by HPLC-ELSD

WANG He,ZHANG Guihui,YANG Ling*
(Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin, College of Life Science,Tarim University,Alaer 843300,China)

Using the Waters XBridgeTM HILIC(2.1 mm×100 mm,5 μm)as the chromatographic column,acetonitrile-water(85∶15,V/V)as mobile phase,flow rate 0.2 ml/min,the content of 1-deoxynojirimycin(1-DNJ)inMorus nigraL.leaves from Xinjiang was determined by HPLC-ELSD.The results showed that 1-DNJ had a good linear relationship in the range of 1.2-12.0 μg/ml.The average recovery rate and relative standard deviation were 98.25%and 1.16%,respectively.The method was simple,fast and reliable,which could be useful to detect the content of 1-deoxynojirimycin in M.nigraL.leaves.

Morus nigraL.leaves;1-deoxynojirinycin;HPLC-ELSD;determination

O652.63

0254-5071（2016）08-0173-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.039

2016-04-25

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31460080）；塔里木大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（TDGRI201519）

王賀（1987-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)與功能研究。

楊玲（1965-），女，教授，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物活性成分研究。