響應(yīng)面法優(yōu)化高效聚磷菌P2除磷條件的研究

方春玉，周健，明紅梅，趙興秀，陳蒙恩，姚霞

（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

響應(yīng)面法優(yōu)化高效聚磷菌P2除磷條件的研究

方春玉，周健，明紅梅，趙興秀，陳蒙恩，姚霞

（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

采用濁度法對高效聚磷菌P2的生長趨勢進(jìn)行了測定，通過單因素設(shè)計，探究了培養(yǎng)溫度、初始pH值、培養(yǎng)時間及微量元素添加量對高效聚磷菌P2除磷性能的影響，利用Plackett-Burman設(shè)計從影響除磷率的6個因素中篩選出3個主效因素，最后通過Box-Behnken設(shè)計對除磷條件進(jìn)行優(yōu)化，以期最大限度的提高聚磷菌P2除磷效率。結(jié)果表明，高效聚磷菌P2在24 h后生長趨勢達(dá)到穩(wěn)定，且持續(xù)時間較長；響應(yīng)面法優(yōu)化菌株P(guān)2的除磷最優(yōu)條件為初始化學(xué)需氧量（COD）494.5 mg/L、初始pH值7.4、接種量5%、初始磷含量50 mg/L、培養(yǎng)溫度35℃、培養(yǎng)時間10.5 h，此條件下對磷酸鹽的積累能力最強(qiáng)，對磷酸鹽的去除率可達(dá)到92.51%。

聚磷菌；響應(yīng)面法；除磷條件

微生物除磷是通過具有超量攝磷功能的聚磷類微生物的超量吸磷能力實現(xiàn)的[1-3]，在通常的生物處理系統(tǒng)中，一方面磷作為活性污泥中微生物生長所需元素之一而得以部分去除[4]；另一方面在活性污泥中還存在著一類具有超量吸磷能力的微生物（聚磷菌）將污水中的磷酸鹽吸附而去除。聚磷菌處理廢水效率與這類微生物所要求的環(huán)境條件關(guān)系密切，只有在最適合其生長繁殖和有效利用營養(yǎng)基質(zhì)的條件下，才能發(fā)揮其最大潛能。由于在白酒廢水處理的末端，廢水中有機(jī)物含量較低，再加上與其他菌落的競爭等因素，致使污水處理系統(tǒng)中的聚磷菌不能發(fā)揮最大除磷功效。為使廢水達(dá)標(biāo)排放，許多污水處理廠往往采取投加除磷劑的方法，這樣就會在后期的氧化塘中產(chǎn)生大量的化學(xué)污泥。當(dāng)產(chǎn)生的化學(xué)污泥足夠多時則需定期進(jìn)行人工除污，進(jìn)而增加了額外的人力成本與經(jīng)濟(jì)費用。因此，在上一階段的污水處理中能否實現(xiàn)高效除磷成為解決這一系列問題的關(guān)鍵。

本研究用聚磷菌P2處理含磷的白酒廢水，采用響應(yīng)面法的數(shù)學(xué)方法進(jìn)行實驗設(shè)計，從而快捷有效的找出菌株P(guān)2的最優(yōu)除磷條件，從而達(dá)到聚磷菌高效除磷的目的，為聚磷菌P2的在含磷廢水中的高效應(yīng)用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種來源

高效聚磷菌P2：瀘州老窖股份有限公司羅漢污水處理站周期循環(huán)活性污泥（cyclicactivatedsludgesystem，CASS）反應(yīng)池污泥中分離。

1.1.2試驗用水

實驗用水為取自羅漢污水處理站中間水池廢水添加一定量的化學(xué)試劑，添加比例及水質(zhì)特征見表1所示。

表1　配制廢水成分及最終水質(zhì)特征Table 1 Composition and quality characteristics of configuration waste water

1.1.3培養(yǎng)基

聚磷培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 82 mg，無水乙酸鈉1.0 g，（NH4）2SO40.2 g，CaCl260 mg，KH2PO474 mg，微量元素溶液2 mL，蒸餾水1 000 mL、pH 7.0～7.2。

專性培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.2 g，CH3COONa 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.1 g，CaCl20.06 g，微量元素溶液2 mL，加水至1 000 mL，pH7.0～7.2。

1.2儀器與設(shè)備

8220BNWP精密pH計：熱電（上海）科技儀器有限公司；ST8型恒溫高速離心機(jī)：美國賽默飛世爾公司；CTL-BX3C COD速測儀：承德華通自動化工程有限責(zé)任公司；5B-6C總磷測定儀：上海連華實業(yè)有限公司；55i+Ds-SM-U1生物顯微成像系統(tǒng)：日本NIKON公司；SCAN1200影像分析菌落計數(shù)儀：上海智理科學(xué)儀器有限公司；MILLI-Q超純水儀：美國Millipore公司。

1.3試驗方法

1.3.1生長曲線的測定

將菌種活化后，接種到專性培養(yǎng)基中，在30℃、150 r/min條件下好氧振蕩培養(yǎng)12h，制備成種子液制備；取盛有50 mL無菌專性培養(yǎng)液的250 mL三角瓶30個，將其依次編號為1、2、3、4、5、……、30。用移液槍分別吸取2 mL種子液后好氧振蕩培養(yǎng)。每隔6h分別取出一瓶，并立即放入-20℃冰箱中，待培養(yǎng)結(jié)束時一同測定其吸光度值（OD600nm）。

1.3.2單因素試驗

初始pH值對高效聚磷菌P2除磷率的影響[13]：將5%的種子液分別接入5個含有已滅菌聚磷培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，并依次進(jìn)行標(biāo)記，所標(biāo)記的三角瓶中培養(yǎng)基的初始pH值依次為5、6、7、8、9，30℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)結(jié)束后對其除磷率進(jìn)行測定，計算除磷率。

培養(yǎng)溫度對高效聚磷菌P2除磷率的影響：將5%的種子液分別接入5個含有已滅菌聚磷培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，并依次進(jìn)行標(biāo)記，所標(biāo)記的三角瓶其培養(yǎng)溫度依次為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，150r/min搖床振蕩培養(yǎng)12h，培養(yǎng)結(jié)束后對其磷含量進(jìn)行測定。

培養(yǎng)時間對高效聚磷菌P2除磷率的影響：將5%的種子液分別接入5個含有已滅菌聚磷培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，并依次對其進(jìn)行標(biāo)記，30℃、150 r/min搖床振蕩分別培養(yǎng)6 h、12 h、18 h、24 h、30 h，培養(yǎng)結(jié)束后對其磷含量進(jìn)行測定，計算除磷率。

微量元素添加量對高效聚磷菌P2除磷率的影響：將5%的種子液分別接入5個含有已滅菌聚磷培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，并依次進(jìn)行標(biāo)記，每個三角瓶中微量元素添加量依次為0、1 mL/L、2 mL/L、3 mL/L、4 mL/L、5 mL/L，30℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)結(jié)束后對其磷含量進(jìn)行測定，計算除磷率。

初始COD含量對除磷率的影響：將5%的種子液分別接入5個含有已滅菌聚磷培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，培養(yǎng)基的初始COD值分別為200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L、800 mg/L，在30℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)結(jié)束后對其磷含量進(jìn)行測定，計算除磷率。

1.3.3響應(yīng)面法優(yōu)化高效聚磷菌P2的除磷條件

PB設(shè)計篩選影響高效聚磷菌除磷特性的顯著影響因子：以除磷率（Y）為響應(yīng)值，通過Plackett-Burman設(shè)計，從影響除磷率的6個影響因素（培養(yǎng)溫度、初始pH值、初始COD含量、菌種接種量、初始磷含量、時間）中篩選出主效因素。每個因素取2個水平：即“1”水平和“-1”水平，以盡快而有效地篩選出最為重要的幾個因素[14]。試驗因素及水平見表2。

表2　Plackett-Burman試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman tests design

最陡爬坡試驗的設(shè)計：根據(jù)Plackett-Burman試驗設(shè)計找出主效因素后進(jìn)行最陡爬坡試驗，依據(jù)各因素效應(yīng)值大小確定其步長，以便快速逼近最佳響應(yīng)區(qū)，并建立有效的響應(yīng)面擬合方程[15]。

Box-Behnken試驗設(shè)計：以PB試驗確定的主效因素為設(shè)計因素，最陡爬坡試驗確定的最優(yōu)水平作為中心點設(shè)計Box-Behnken試驗[16]，試驗因素的設(shè)計水平及編碼見表3。

表3　Box-Benhnken試驗設(shè)計的因素及水平Table 3 Factors and levels in Box-Benhnken tests design

1.3.4測定方法[12]

COD測定：COD快速測定儀；TP：GB11893—1989《總磷的測定鉬酸銨分光光度法》測定；NH4-N：NH4-N測定儀；pH：精密pH計；混合液懸浮固體濃度（mixed liquid suspended solids，MLSS）：量筒直接測量；菌體生長密度：濁度法（OD600nm）。

2　結(jié)果與分析

2.1生長曲線的測定

對菌株進(jìn)行生長曲線的測定，結(jié)果如圖1所示。

圖1　聚磷菌P2生長曲線Fig.1 Growth curve of phosphorus-accumulating bacterium P2

由圖1可知，菌株P(guān)2的生長遲緩期為0～6 h；第6～24小時時菌株生長迅速，表明此時菌株處在對數(shù)期；24 h后曲線的上升趨勢開始變得緩慢；48 h后其細(xì)胞濃度達(dá)到最大，即進(jìn)入穩(wěn)定期。故其作為種子液的最佳時間段為12～24 h。從菌株P(guān)2生長曲線的整體趨勢可知，其穩(wěn)定期時間相對較長，說明菌株P(guān)2能夠在較低COD濃度條件下存活較長時間，即說明菌株P(guān)2對環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)。

2.2單因素試驗

2.2.1不同初始pH值對除磷率的影響

發(fā)酵過程中，改變培養(yǎng)基的初始pH值，考察不同初始pH值條件下菌株P(guān)2的除磷能力，結(jié)果如圖2所示。

圖2　初始pH值對除磷率的影響Fig.2 Effect of initial pH on phosphorus removal efficiency

由圖2可知，菌株P(guān)2的除磷率隨著初始pH值的變大呈先上升后下降趨勢，且在pH=7附近時其除磷率最高，說明菌株P(guān)2的最佳除磷pH值為近中性，較高或較低的pH值都不適宜菌株P(guān)2對磷的吸收。這是因為在較高或較低pH值時菌株P(guān)2的生理活性受到抑制，也可能是起催化作用的酶的合成或其活性受到了抑制。因此，在進(jìn)行污水處理時需要及時監(jiān)測并及時調(diào)節(jié)水質(zhì)pH值=7，以便能夠達(dá)到最大除磷效率。

2.2.2不同培養(yǎng)溫度對除磷率的影響

發(fā)酵過程中，采用不同溫度進(jìn)行培養(yǎng)，檢測菌株P(guān)2的除磷能力，結(jié)果如圖3所示。

圖3　培養(yǎng)溫度對除磷率的影響Fig.3 Effect of culture temperature on phosphorus removal efficiency

由圖3可知，隨著溫度的升高，菌株P(guān)2的除磷率開始上升，但升幅不大，且隨著溫度的升高，菌株P(guān)2的除磷率增加趨勢加大，在30℃附近時達(dá)到最大（接近100%）。之后隨著溫度的升高，菌株P(guān)2的除磷率開始急劇下降，且下降趨勢隨溫度的升高而增大。以上現(xiàn)象說明適當(dāng)提高溫度有助于提高菌株除磷率，但當(dāng)培養(yǎng)溫度過高時，由于菌株活性或體內(nèi)相關(guān)酶或許受到抑制，反而達(dá)不到提高除磷率的目的。因此，在利用菌株P(guān)2進(jìn)行除磷時，溫度宜控制在30℃左右。

2.2.3不同培養(yǎng)時間對除磷率的影響

在不同培養(yǎng)時間下檢測發(fā)酵液中的磷含量，以確定除磷的最佳利用時間，結(jié)果如圖4所示。

圖4　培養(yǎng)時間對除磷率的影響Fig.4 Effect of culture time on phosphorus removal efficiency

由圖4可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，菌株P(guān)2在12 h左右時其除磷率最大，12 h后菌株P(guān)2的除磷率略有下降。這是由于隨著培養(yǎng)時間的延伸，培養(yǎng)液中可利用的COD量逐漸降低，此時聚磷菌P2無法再吸收過量磷元素，甚至部分菌株開始發(fā)生釋磷現(xiàn)象以獲取能量。因此，培養(yǎng)時間宜控制在12 h。

2.2.4不同微量元素溶液添加量對除磷率的影響

在發(fā)酵液中添加不同量的微量元素溶液，考察不同微量元素溶液添加量對除磷率的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5　微量元素溶液添加量對除磷率的影響Fig.5 Effect of trace elements solution addition on phosphorus removal efficiency

由圖5可知，當(dāng)聚磷培養(yǎng)基中不添加微量元素時，聚磷菌P2的除磷率較低，隨著微量元素添加量的增加，聚磷菌P2的除磷率呈先上升后下降趨勢，說明微量元素含量能夠影響聚磷菌P2對磷元素的吸收。當(dāng)微量元素添加量為2 mL/L左右時P2除磷能力最強(qiáng)，之后隨著微量元素含量的增加呈急劇下降之勢，說明在進(jìn)行污水處理時，可根據(jù)污水成分適當(dāng)?shù)靥砑游⒘吭?，從而進(jìn)一步提高除磷能力。因此，微量元素溶液添加量宜控制在2 mL/L。

2.2.5不同初始COD含量對除磷率的影響

考察不同初始COD含量下，聚磷菌的除磷效率，結(jié)果如圖6所示。

圖6　初始COD值對除磷率的影響Fig.6 Effect of initial COD on phosphorus removal efficiency

由圖6可知，隨著初始COD含量的增加，聚磷菌P2的除磷率呈先上升后下降趨勢，在初始COD含量為500 mg/L時P2除磷能力最強(qiáng)。原因可能是隨著初始COD含量的增加，培養(yǎng)基濃度更高，聚磷菌生長迅速，其除磷效率也不斷增高，但過高的營養(yǎng)基質(zhì)，也會影響除磷效率，菌體在較高COD條件下，生長受到一定的抑制。因此，初始COD含量宜控制在500 mg/L。

2.3響應(yīng)面法設(shè)計試驗

2.3.1 Plackett-Burman設(shè)計結(jié)果與分析

運用Design-Expert 8.0.5軟件對PB試驗的結(jié)果進(jìn)行方差分析，其試驗設(shè)計結(jié)果及效應(yīng)評價分別見表4、表5。

表4　Plackett-Burman試驗設(shè)計及響應(yīng)值Table 4 Plackett-Burman experimental design and response value

根據(jù)表4的Y（%）值，進(jìn)行各因素水平及其效應(yīng)評價，計算結(jié)果如表5所示。

由表5可知，所考察的6個因素對除磷率的影響大小依次為X6＞X1＞X3＞X5＞X4＞X2，其中X1、X3、X6對結(jié)果影響較大，為主效因素。

表5　Plackett-Burman試驗結(jié)果顯著性分析Table 5 Significant evaluation of Plackett-Burman experiments results

2.3.2最陡爬坡試驗結(jié)果及分析

依據(jù)表5結(jié)果，對3個主效因素進(jìn)行最陡爬坡試驗，根據(jù)3個主效因素效應(yīng)大小設(shè)定變化步長及方向。對于不顯著因素，表現(xiàn)為正效應(yīng)的取“1”水平，表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)的取“-1”水平[17]，其梯度變化及試驗結(jié)果見表6。從表6可知，隨著3個主效因素梯度的變化，菌株P(guān)2除磷率呈先上升后下降趨勢，在2號所處水平上達(dá)到最大值，故而判定菌株P(guān)2的最優(yōu)除磷條件在2號附近，故選2號所處的因素水平為中心點進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。

表6　最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Experimental design and results of the steepest ascent test

2.3.3響應(yīng)面試驗結(jié)果及分析

運用Design-Expert 8.0.5軟件對最陡爬坡試驗中所確定的中心點進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken試驗設(shè)計，試驗設(shè)計及結(jié)果見表7。

運用Design-Expert8.0.5版軟件對模型進(jìn)行二次回歸擬合后，得到以下回歸方程：Y=92.40+0.29A+0.039B-2.73C-1.67AB+1.53AC+1.09BC-2.55A2-1.24B2-5.31C2，回歸模型的方差分析見表8。

從表8可知，模型Pr值＜0.001，F(xiàn)值為20.06，說明模型極為顯著。從方差分析的結(jié)果可知，模型的失擬項Pr=0.0605＞0.05，說明該模型選擇比較合理。模型中C、C2對響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.01），AB、AC、A2對響應(yīng)值值影響顯著（P＜0.05）且模型決定系數(shù)R2為96.27%，表明該模型與實際情況擬合良好，可以用于對高效聚磷菌P2的最佳除磷條件進(jìn)行分析和預(yù)測。利用響應(yīng)面回歸分析、回歸方程和Design-Expert 8.0.5軟件繪制三維響應(yīng)曲面圖，結(jié)果見圖7。

表7　Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 7 Design and results of Box-Benhnken experiments

表8　回歸方程的方差分析Table 8 Variance analysis of regression equation

響應(yīng)曲面可直觀反映出各因?qū)憫?yīng)值的影響，曲面越陡說明相關(guān)因素之間的交互作用越強(qiáng)[18]。從圖7可以看出，當(dāng)各因素大小從四周逐漸趨向中心點時，曲面圖呈凸起趨勢，即聚磷菌的除磷率趨向最大化，說明存在最大響應(yīng)值。運用Design-Expert 8.0.5軟件對其結(jié)果進(jìn)行分析，當(dāng)預(yù)測的響應(yīng)值最大時，3個因素所對應(yīng)的最佳值為培養(yǎng)時間10.51 h、初始COD含量494.52 mg/L、初始pH值7.37時，在該條件下所預(yù)測的最大除磷率為92.75%。

圖7　培養(yǎng)時間、初始COD含量與初始pH值交互影響對除磷率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of the interaction between culture time,initial COD,and initial pH on phosphorus removal efficiency

2.3.4驗證試驗及結(jié)果

為方便操作，修改最佳條件為培養(yǎng)時間10.5 h、初始COD含量494.5 mg/L、初始pH值7.4，對菌株P(guān)2的除磷能力進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示，高效聚磷菌對磷酸鹽的去除率可達(dá)到92.51%，這與回歸方程所提供的預(yù)測值（92.75%）相接近，證明擬合模型能夠準(zhǔn)確的對菌株P(guān)2的除磷條件進(jìn)行優(yōu)化。

3　結(jié)論

對高效聚磷菌P2的除磷條件進(jìn)行優(yōu)化，在濁度法對菌株P(guān)2的生長趨勢進(jìn)行了測定時發(fā)現(xiàn)，菌株的對數(shù)生長期為6～24 h，24 h后菌株P(guān)2的生長呈下趨勢，48 h后生長趨于停止，但數(shù)量達(dá)到了最大，說明進(jìn)入了穩(wěn)定期。穩(wěn)定期持續(xù)相當(dāng)長一段時間，說明菌株P(guān)2對環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)，尤其在較低COD濃度條件下可以存活較長時間。

通過單因素試驗設(shè)計，找到影響菌株P(guān)2除磷效果的因素及其作用范圍，利用響應(yīng)面法對菌株P(guān)2的除磷條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計。結(jié)果顯示，菌株P(guān)2的最佳除磷條件為培養(yǎng)時間10.5 h、初始COD含量494.5 mg/L、初始pH值7.4、接種量5%、初始總磷50 mg/L、培養(yǎng)溫度35℃，在此條件下除磷率可達(dá)到92.51%。

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Optimization of phosphorus removal conditions with efficient phosphorus-accumulating bacterum P2by response surface methodology

FANG Chunyu,ZHOU Jian,MING Hongmei,ZHAO Xingxiu,CHEN Mengen,YAO Xia
(College of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China)

The growth trend of the efficient phosphorus-accumulating bacterum P2was researched by testing turbidity value.The effect of temperature, initial pH,culture time and trace elements addition on phosphate removal efficiency was researched by single factor experiment.Three main factors were selected from six influencing factors by the design of Plackett-Burman.Finally,the response surface methodology experiment was designed to investigate the optimal phosphorus removal conditions,to maximumly improve phosphorus removal efficiency of strain P2.The results showed that the growth trend of efficient phosphorus-accumulating bacterum P2was stable after 24 h,and sustained for a long time.The response surface methodology results showed that the optimal phosphorus removal condition by strain P2was initial COD concentration 494.5 mg/L,initial pH 7.4,inoculum 5%,initial phosphorus content 50 mg/L,temperature 35℃and time 10.5 h.Under the condition,the accumulation ability of the phosphate was the strongest,and the removal efficiency of phosphate was 92.51%.

phosphorus-accumulating bacterium;response surface methodology;phosphorus removal conditions

Q939.9

0254-5071（2016）08-0104-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.024

2016-02-23

釀酒及生物技術(shù)四川省重點實驗室項目（NJ2014-05）；瀘州老窖科研獎學(xué)金項目（15ljzk06）；四川省大學(xué)生創(chuàng)新基金項目（201510622061）；四川理工學(xué)院培育項目（2015PY02）；自貢市科技局（2015HX15）

方春玉（1977-），女，高級實驗師，碩士，主要從事環(huán)境生物技術(shù)方面的研究工作。