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    兩種不同方法學檢測精子DNA完整性分析的結果評價

    2016-11-29 06:25:16郝栩婷
    標記免疫分析與臨床 2016年1期
    關鍵詞:方法學完整性精液

    郝栩婷

    (首都醫(yī)科大學附屬北京婦產醫(yī)院檢驗科,北京 100006)

    兩種不同方法學檢測精子DNA完整性分析的結果評價

    郝栩婷

    (首都醫(yī)科大學附屬北京婦產醫(yī)院檢驗科,北京 100006)

    精子; DNA完整性; 方法學評價

    近年來,不孕不育問題已經成為世界性醫(yī)學和社會問題,約有10%~15%的育齡夫婦受到不孕不育的困擾。其中男方因素約占50%(約20%為男方單方因素,30%~40%為男女雙方因素),全世界不孕不育發(fā)病率有逐漸上升趨勢[1]。目前國內評價男性生育功能的指標主要還是精液常規(guī)參數(shù)分析。然而,傳統(tǒng)的精液常規(guī)檢測項目尚不能準確、完全地反映精子質量情況。有學者研究認為,男性不育者中仍有15%的精液常規(guī)分析是正常的,并且30%以上的男性不育患者因病因不清而被診斷為特發(fā)性不育[2]。精子 DNA是遺傳物質的攜帶者,成熟的精子,其DNA鏈緊密纏繞著魚精蛋白,使精子染色質高度緊密完整。當精子受外部應激狀態(tài)(如氧化應激反應、溫度升高等)刺激,就可能損傷精子DNA,從而導致精子DNA完整性受損。精子DNA完整性分析(DFI)檢測作為評價精子DNA損傷的指標逐漸成為男性不育臨床檢測的新選擇,越來越受到臨床醫(yī)生的重視。但是,目前DFI檢測的方法學有很多種,且沒有統(tǒng)一的標準,各實驗間的檢測結果是否能夠通用還需要進一步研究。目前國內檢測 DFI主要有精子染色質擴散實驗(SCD)法和末端轉移酶介導的dUTP末端標記法(TUNEL)兩種,本文針對這兩種方法進行比對研究,旨在探討這兩種方法學結果的可比性。

    材料和方法

    1 研究對象

    選擇2014年10月至2014年12月在我院不孕不育門診就診的80例男性患者作為研究對象,年齡28~52歲,身體健康,無睪丸外傷、家族遺傳性疾病史及性功能障礙病史,體檢無明顯異常。所有研究對象取精前禁欲3~7d,手淫法采集精液于干燥無菌取精杯中,立即送檢。

    2 儀器及試劑

    SCD法儀器使用日本奧林帕斯 CX-21顯微鏡,試劑使用西班牙Halosperm@試劑盒;TUNEL法采用美國BD公司FACSCalibur流式細胞儀,試劑由浙江星博生物公司提供。

    3 方法

    3.1 重復性實驗(批內精密度) 選取同一份樣本,用兩種不同方法同時檢測20次,計算均值、標準差s、變異系數(shù) CV。

    3.2 兩種方法的檢測結果比較 所有樣本均同時使用兩種方法進行檢測,并將記錄數(shù)據進行比較;以DFI結果30%為臨界值[3],分別計算各自的陽性率并進行分析。

    4 統(tǒng)計學分析

    結 果

    (1)重復性實驗結果見表1。由表1可見,使用TUNEL法檢測結果的重復性要優(yōu)于SCD法。

    表1 兩種方法檢測的精密度比較(%)

    (2)兩種方法學檢測結果見表2。兩組檢測結果差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),陽性率的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

    表2 兩種方法的檢測結果比較

    (3)兩種方法學檢測結果一致性見表3。kappa=0.70,兩種方法學的一致性不理想。

    表3 兩種方法結果的一致性比較

    討 論

    從上述實驗數(shù)據中能看出,TUNEL法檢測結果的精密度要明顯優(yōu)于 SCD法。這可能是兩者實驗方法導致的。目前采用 SCD法檢測 DFI尚無自動化儀器操作,只能以手工法進行計數(shù),結果的判斷受到人為的主觀因素影響較大;另外受人力的限制,一次實驗只在鏡下觀測五百個精子,結果有一定的片面性。而TUNEL法通過全自動流式細胞儀檢測,結果的判斷全部由儀器進行,一次實驗能觀測近萬個精子,結果的代表性好,所以 TUNEL法檢測的精密度要優(yōu)于SCD法。

    兩組結果之間的相關性不理想,且兩組檢測結果之間差異較大,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且兩種方法的一致性也不理想。這可能是因為二者檢測原理不同導致的。TUNEL法檢測原理是在保持細胞結構的前提下,通過末端脫氧核苷酸轉移酶(dUTP)將熒光標記物與 DNA斷裂片段末端的游離氫氧根結合,通過流式細胞儀直接測定精子DNA單鏈和雙鏈的數(shù)量;而SCD法檢測原理是通過檢測精子 DNA對酸變性的易感性間接反映精子DNA的完整性,即將液化后的精液與瓊脂糖混合鋪于載玻片上,酸變性和除去核蛋白后,經染色后在顯微鏡下觀察,用有DNA碎片的精子不能產生特征性的光暈的特性來判讀結果[4]。

    兩種方法學檢測的陽性率結果,SCD法略高于TUNEL法,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。有研究顯示[5],SCD法檢測結果較TUNEL法檢測結果更敏感,這點可能是本次實驗樣本量較少有關。

    綜上所述,這兩種方法均能反應出精子 DNA的完整性。由于二者實驗方法及檢測原理的不同,檢測結果目前尚不同通用。

    檢測精子 DNA完整性的方法還有很多,每種方法的檢測原理及實驗方法都不一樣,各種方法也缺乏標準化及檢測標準值[6]。如果實驗室同時使用兩種不同方法進行檢測,有可能會出現(xiàn)同一患者不同的檢測結果。因此建議不要同時使用兩種方法進行檢測,臨床實驗室應根據自身的情況選擇一種適合本實驗室的檢測方法。

    [1]李佳祥,舒金輝,李勁,等.精子DNA完整性檢測在男性不育診斷中的應用價值.中國男科學雜志,2012,26(9):15-23.

    [2]孫靜波,姜宏,何瑞冰.精子DNA完整性與精液參數(shù)的相關性研究.中國男科學雜志,2010,24(4):26-29.

    [3]黃學鋒,金建遠,費前進,等.精子 DNA損傷:獨立的精子質量評價指標.溫州醫(yī)學院學報,2010,40(3):239-242.

    [4]楊譯,姜輝,張海嬌,等.男性不育患者年齡與精子DNA碎片和精液常規(guī)參數(shù)的相關性分析.中國性科學,2012,21(2):17-19.

    [5]Zhang L H,Qiu Y,Wang K H,et al.Measurement of sperm DNA fragmentation using bright-field microscopy:comparison between sperm chromatin dispersion test and terminal uridine nick-end labeling assay.Fertil Steril,2010,94(3):1027-1032.

    [6]孫爍磊.精子DNA損傷的機制及檢測方法研究進展.國際泌尿系統(tǒng)雜志,2008,28(4):480-483.

    (張增武編輯)

    10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.01.035

    2015-09-08;

    2015-10-28

    郝栩婷,主管檢驗師。Tel:13501039505;E-mail:13501039505@163.com

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