• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一株鵝源多殺性巴氏桿菌強毒株的分離鑒定及其血清型鑒定相關(guān)基因的克隆

    2016-11-28 03:29:36楊澤曉劉常鈺姚學萍鄔旭龍李桂黎蒙正群劉亞東
    浙江農(nóng)業(yè)學報 2016年6期
    關(guān)鍵詞:殺性莢膜血清型

    楊澤曉,劉常鈺,王 印,姚學萍,鄔旭龍,王 波,李桂黎,蒙正群,劉亞東

    (1.四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院, 四川 溫江 611130; 2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室,四川 溫江 611130)

    ?

    一株鵝源多殺性巴氏桿菌強毒株的分離鑒定及其血清型鑒定相關(guān)基因的克隆

    楊澤曉1,2,劉常鈺1,王 印1,2,姚學萍1,鄔旭龍1,王 波1,李桂黎1,蒙正群1,劉亞東1

    (1.四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院, 四川 溫江 611130; 2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室,四川 溫江 611130)

    為探索某鵝場鵝巴氏桿菌病疫情發(fā)生的原因,采集初診為鵝巴氏桿菌感染病例的肝臟、心臟等樣品進行細菌分離純化,經(jīng)過染色鏡檢、培養(yǎng)特性、生化試驗、種與血清型PCR鑒定、致病性試驗和藥敏試驗等進行鑒定,并根據(jù)GenBank中多殺性巴氏桿菌血清型相關(guān)基因設(shè)計引物進行其血清型相關(guān)基因的克隆分析。結(jié)果顯示,分離到1株莢膜A型鵝源多殺性巴氏桿菌,屬于多殺亞種,血清型Ⅰ型,具有較強致病性,對實驗小鼠最小致死量為5 cfu。該分離菌株具有多重耐藥性,僅對頭孢三嗪、頭孢噻吩、頭孢他啶、頭孢唑肟和氟苯尼考5種藥物敏感。成功克隆的該分離菌株莢膜合成相關(guān)基因hyaD-hyaC的開放閱讀框4 155 bp,與已發(fā)布基因序列同源性高達99%;血清型Ⅰ型PCR的擴增基因片段303 bp,與巴氏桿菌C48-1株擴增基因片段序列完全相同。綜上,該株血清型Ⅰ型莢膜A型的鵝源多殺性巴氏桿菌強毒株,是鵝場疫情發(fā)生的病原,克隆的莢膜合成相關(guān)基因和菌體血清型特異性基因遺傳相對穩(wěn)定。

    鵝;多殺性巴氏桿菌;血清型; PCR鑒定

    鵝巴氏桿菌病(goose pasteurellosis)又稱鵝霍亂,是由多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida, Pm)引起的一種高度接觸性、敗血性傳染病[1-2]。隨著近些年我國養(yǎng)鵝業(yè)的不斷發(fā)展,有關(guān)鵝巴氏桿菌病的報道不斷增多[3-4]。

    鵝巴氏桿菌病的發(fā)生機理尚不清楚,傳播途徑復雜多樣,流行也無明顯季節(jié)性,常會受到天氣劇變、臺風、合群、長途運輸?shù)韧饨缫蛩氐挠绊?,該病一旦流行,很難查出傳染源,且往往會反復發(fā)生[5]。該病發(fā)病急、死亡快,其發(fā)病率和死亡率因飼養(yǎng)管理、病原毒力等方面不同而存在差異。據(jù)不完全統(tǒng)計,發(fā)病率可高達35%,死亡率高達70%,如果出現(xiàn)混合感染,死亡率可能更高[6-7]。加上Pm的血清型比較復雜,不同血清型間又缺乏交叉免疫保護作用,以及Pm菌株耐藥現(xiàn)象,Pm感染的控制難度在不斷增加[8],嚴重威脅著我國養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展。

    劉加波等[9]采用RAPD技術(shù)對9株禽Pm廣西分離株和3株參考株DNA的多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn),廣西流行Pm菌株呈現(xiàn)多樣性,且與標準Pm強毒株存在差異。近些年我國分離到F型Pm[10],這表明我國Pm感染情況呈現(xiàn)越來復雜的趨勢。2013年7月,四川某鵝場發(fā)生疫情,育成肉鵝出現(xiàn)急性死亡,死亡率15%左右。筆者通過對送檢病死鵝只臨床癥狀、剖檢病變初診,認為屬鵝巴氏桿菌病,然而與畜主陳述曾免疫接種過巴氏桿菌疫苗的流行病學調(diào)查結(jié)果出現(xiàn)了較大偏差。為探索是否出現(xiàn)Pm的變異導致免疫失敗,并明確引發(fā)此次典型鵝霍亂疫情的原因,本研究在對病例剖檢基礎(chǔ)上無菌采集肝臟、心臟等材料進行細菌分離和純化,通過染色鏡檢、培養(yǎng)特性、生化試驗、藥敏試驗、動物致病試驗和分子生物學技術(shù)對分離株進行了鑒定,并對分離菌株的血清型相關(guān)基因進行了克隆分析,以期為鵝巴氏桿菌病的防控提供科學的參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試劑、菌種與試驗動物

    營養(yǎng)瓊脂,標準藥敏試紙和微量生化試管,購自杭州微生物試劑有限公司;DNA marker DL2000和pMD19-T載體購自成都飛克(天泰)科技有限公司;2×TaqPCR Mastermix 、瓊脂糖和TIANgel Midi Purification Kit(DP209)等購自成都安雅生物試劑有限公司;15日齡健康雛鵝6只、體質(zhì)量25 g雌性KM小鼠35只、鵝源大腸埃希菌、Pm參照株 P1059、C48-1由四川農(nóng)業(yè)大學動物檢疫研究室提供。

    1. 2 引物設(shè)計合成

    根據(jù)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)已公布的Pm基因序列,參考相關(guān)文獻[11-13]進行Pmkmt1基因的種特異性引物(P1/P2)、莢膜型分型引物(針對A,B,D,E,F(xiàn)莢膜型特異性基因hyaD-hyaC,bcbD,dcbF,ecbJ,fcbD擴增的A1/A2,B1/B2,D1/D2,E1/E2,F(xiàn)1/F2,A3/A4,A5/A6)和Pm血清Ⅰ型引物(F/R)篩選設(shè)計(表1),送往北京華大科技有限公司合成,按照合成說明書將其稀釋至10 μmol·L-1,-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 臨床剖檢

    按常規(guī)方法對送檢病鵝進行剖檢,觀察臟器病理變化,并無菌采取病料以進行細菌分離鑒定。

    表1 Pm分離鑒定PCR用擴增引物

    Table 1 The PCR primers for Pm identification

    項目與引物編號引物序列(5’→3’)產(chǎn)物大小/bp參考文獻 Kmt1基因[11]P1ATCCGCTATTTACCCAGTGG456P2GCTGTAAACGAACTCGCCAC 莢膜血清群[12]A1TGCCAAAATCGCAGTCAG1044A2TTGCCATCATTGTCAGTGB1CATTTATCCAAGCTCCACC760B2GCCCGAGAGTTTCAATCCD1TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCCC657D2CATCTACCCACTCAACCATATCAGE1TCCGCAGAAAATTATTGACTC511E2GCTTGCTGCTTGATTTTGTCF1AATCGGAGAACGCAGAAATCAG852F2TTCCGCCGTCAATTACTCTG Pm血清型Ⅰ型[13]FAAGGGGATGGGTTTAGAGCCAGT303RAAGGGGATGGGTTTAGAGCCAGT hyaD-hyaC基因A3ATGAATACATTATCACAAGC2147AF067175A4CTGACTGCGATTTTGGCAA5CACTGACAATGATGGCAA998A6TTAAGCATCACCGCCAAA

    1.4 病原菌分離鑒定

    1.4.1 細菌分離純化

    按照文獻[4]進行綿羊鮮血平板等培養(yǎng)基的制作,將無菌采取的心臟、肝臟、脾臟等病變組織接種于血平板上,37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察細菌生長情況,挑菌后革蘭染色鏡檢,通過平板劃線法進行細菌純化,進行瑞氏染色鏡檢。

    1.4.2 培養(yǎng)特性與生化試驗

    取分離菌株純培養(yǎng)物,接種于鮮血平板、血清平板、普通平板、麥康凱平板,觀察細菌培養(yǎng)特性,并根據(jù)微量生化發(fā)酵管說明書分別接種葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、蕈糖、山梨醇、衛(wèi)矛醇、肌醇、甘露醇、硫化氫、尿素酶、VP、賴氨酸和鳥氨酸等生化管,同時挑單個菌落進行觸酶試驗和氧化酶試驗。

    1.4.3 PCR鑒定

    (1)Pmkmt1基因PCR

    根據(jù)鵝只剖檢病變、細菌染色鏡檢和生化試驗的結(jié)果,以P1/P2為引物,按照文獻[11]中反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進行分離菌株的kmt1基因PCR鑒定,同時以Pm 參照株P(guān)1059、C48-1和鵝致病性大腸埃希菌為對照。

    (2)莢膜血清群PCR鑒定

    以A1/A2,B1/B2,D1/D2,E1/E2和F1/F2為引物,采用文獻[12]中血清群多重PCR方法進行分離菌株莢膜血清群鑒定,同時以Pm 參照株P(guān)1059,C48-1和鵝致病性大腸埃希菌為對照。

    (3)血清型Ⅰ型PCR鑒定

    以分離菌株純培養(yǎng)物為模板,按照參考文獻[13]中PCR方法進行分離菌株的血清型鑒定,同時以Pm 參照株P(guān)1059,C48-1和鵝致病性大腸埃希菌為對照。反應(yīng)體系為2×TaqPCR Master Mix 25.0 μL,引物F和R 各1.5 μL,模板2.0 μL,ddH2O 20.0 μL。反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 40 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,35個循環(huán);72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

    1.4.4 動物試驗

    [10]方法,將分離菌株在血平板上培養(yǎng)24 h后,用無菌生理鹽水沖洗菌苔, 參照麥氏比濁法測定菌液濃度后,稀釋至5×108cfu·mL-1,分別進行鵝致病性試驗和小鼠致病性研究。

    (1)鵝致病試驗

    將6只雛鵝飼養(yǎng)3 d后,隨機分為2組,每組3只。試驗組雛鵝腹腔注射分離菌株稀釋物0.3 mL,對照組雛鵝腹腔注射生理鹽水0.3 mL。連續(xù)7 d觀察雛鵝發(fā)病、死亡情況,并及時采集病死鵝心臟、肝臟、脾臟樣品進行抹片鏡檢和細菌分離鑒定。

    (2)小鼠致病性試驗

    將10只小鼠隨機分為2組,每組5只,試驗組腹腔注射分離菌株稀釋物(每只0.2 mL),對照組注射生理鹽水(每只0.2 mL)。連續(xù)7 d觀察小鼠發(fā)病、死亡情況,并及時采集病死小鼠脾臟樣品進行抹片鏡檢和細菌分離鑒定。

    (3)小鼠最小致死濃度(MLD)測定

    用無菌生理鹽水對分離菌株稀釋物繼續(xù)進行梯度稀釋,并采用平板法進行cfu計數(shù),使其濃度分別為5 000,500,50和25 cfu·mL-1,將25只小鼠隨機分為5組,每組5只,分別腹腔注射不同濃度菌液或生理鹽水,每只0.2 mL。連續(xù)7 d觀察發(fā)病、死亡情況,并及時采集病死小鼠脾臟樣品進行抹片鏡檢和細菌分離鑒定。

    1.5 藥敏試驗

    按參考文獻[4]操作,采用Kirby-Bauer法檢測分離菌株對30種常用抗菌藥物的敏感性,結(jié)果根據(jù)藥敏試驗抑菌環(huán)直徑判斷標準(WS/T125—1999)進行敏感性的判定。

    1.6 分離菌株血清型鑒定基因的克隆分析

    1.6.1 hyaD-hyaC基因的克隆分析

    (1)hyaD-hyaC基因PCR擴增

    根據(jù)莢膜血清群鑒定結(jié)果,設(shè)計合成莢膜生物合成相關(guān)基因hyaD-hyaC序列的PCR引物(表1),分別以A1/A2,A3/A4,A5/A6為引物進行分離Pm菌株hyaD-hyaC基因的擴增。PCR反應(yīng)體系為 2×TaqPCR Master Mix 25.0 μL,上下游引物各1.5 μL,菌液模板2.0 μL,ddH2O 20.0 μL。反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 70 s,35個循環(huán);72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

    (2)hyaD-hya基因的克隆分析

    根據(jù)TIANgel Midi Purification Kit(DP209)說明書分別純化回收預期大小的PCR產(chǎn)物,送往北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行序列測定,最后將測序結(jié)果用DNAStar軟件拼接后進行BLAST同源性分析。

    1.6.2 血清型Ⅰ型鑒定基因的克隆分析

    按照1.6.1節(jié)中⑵的方法,分別純化回收1.4.3節(jié)Pm分離菌株和C48-1株血清型Ⅰ型PCR鑒定產(chǎn)物,送往北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行序列測定,最后將測序結(jié)果進行BLAST同源性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 病鵝剖檢病變

    剖檢可見,病鵝呈現(xiàn)急性禽霍亂的特征性病理變化,腹膜、氣囊大量點狀出血(圖1-A),心包大量淡黃滲出液,心肌與心冠脂肪有點狀出血(圖1-B);氣管表面充血和有出血點(圖1-C)、肺臟充血和點狀出血;肝臟稍腫大,質(zhì)脆,棕色或者淡黃色,表面有大量白色或淡黃色針尖大小壞死點(圖1-B—D);脾臟淤血腫大,也可見淡黃色或白色大小不等壞死點(圖1-E);消化道尤其十二指腸充血,呈卡他性或出血性炎癥(圖1-F)。

    2.2 病原菌分離鑒定

    按照1.4.1節(jié)和1.4.2節(jié)操作進行病變組織中細菌的分離純化及分離菌株的培養(yǎng)特性觀察和生化試驗,結(jié)果分離到1株兩端鈍圓、兩極濃染、革蘭陰性小桿菌(圖2-A—B);該菌在鮮血平板和血清平板上,37 ℃條件下培養(yǎng)24 h,可以見到大小不一的淡灰白色、濕潤、露珠樣菌落(圖3-A),在白光45度照射下菌落呈現(xiàn)藍綠色熒光和橙色熒光(圖3-B),無溶血性(圖3-A),也可在普通平板上生長,但在麥康凱平板上不能生長。生化試驗結(jié)果顯示該菌株可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、木糖、果糖、山梨醇和蕈糖;觸酶試驗(圖3-A)和氧化酶試驗陽性;不發(fā)酵麥芽糖、菊糖、乳糖、衛(wèi)矛醇、肌醇和甘露醇;硫化氫、尿素酶、VP、賴氨酸和鳥氨酸反應(yīng)陰性。這與多殺性巴氏桿菌多殺亞種培養(yǎng)特性和生化特征[7]相符合。

    按照1.4.3節(jié)操作分別進行了分離菌株kmt1的PCR擴增、Pm莢膜血清型PCR鑒定和血清型Ⅰ型鑒定,結(jié)果如圖4所示。分離菌株與Pm對照菌株P(guān)1059,C48-1的kmt1基因PCR和Pm莢膜血清型PCR均擴增出456 bp(圖4泳道1,2,3)和1 044 bp(圖4泳道5,6,7)預期長度的DNA條帶,而鵝大腸埃希菌對照無特異性擴增(圖4泳道4,8);分離菌株與C48-1的血清型Ⅰ型PCR擴增出303 bp(圖4泳道9,10)預期大小條帶。鵝大腸埃希菌和P1059菌株均無擴增(圖4泳道11,12),因此鑒定該分離菌株為鵝源莢膜A型多殺性巴氏桿菌,血清型Ⅰ型,并將其命名為GHaiNPm2012株。

    A, 氣囊、漿膜出血;B, 心臟點狀出血;C, 氣管出血;D, 肝臟壞死點;E, 脾臟壞死結(jié)節(jié);F, 十二指腸出血圖1 病鵝的剖檢病理變化Fig.1 The pathological anatomy changes of sick geese

    A, 革蘭染色結(jié)果; B, 瑞氏染色結(jié)果圖2 染色鏡檢(1 000×)Fig.2 The morphological examination (1 000 ×)

    按照1.4.4節(jié)操作進行Pm分離株的動物致病性試驗,結(jié)果顯示,攻菌試驗組的雛鵝和小鼠都在2 d全部死亡,剖檢以臟器出血性病變?yōu)橹?,取肝臟涂片鏡檢可以觀察到兩極濃染革蘭陰性小桿菌,經(jīng)過細菌分離鑒定重新獲得該菌,對照組無異常表現(xiàn)。這表明該分離菌株GHaiNPm2012株對鵝和小鼠具有較強的致病性,也是該鵝場發(fā)生疫情的病原。

    小鼠最小致死濃度(MLD)測定試驗顯示:生理鹽水對照組小鼠正常,除25 cfu·mL-1攻菌組小鼠死亡2只外,其他攻菌劑量組小鼠均在2 d內(nèi)全部死亡,且取病死小鼠脾臟樣品又重新分離鑒定到該菌,因此,該菌的小鼠MLD為5 cfu。

    A, 血平板培養(yǎng)特性; B, 血清平板菌落熒光圖3 Pm分離株培養(yǎng)特性Fig.3 Cultured characteristics of the Pm isolate

    1,2,3,4分別為Pm isolate,C48-1,P1059和鵝大腸埃希菌的kmt1基因PCR產(chǎn)物;5,6,7,8分別為Pm isolate,C48-1,P1059和鵝大腸埃希菌的莢膜型PCR鑒定產(chǎn)物;9,10,11,12分別為Pm isolate,C48-1,P1059和鵝大腸埃希菌的血清型1型PCR鑒定產(chǎn)物圖4 分離菌株kmt1基因、莢膜型和血清型Ⅰ型的PCR鑒定Fig.4 PCR identification of the kmt1 gene, capsular-serotype and serotype 1 for the Pm isolate

    2.3 藥敏試驗

    按照1.5節(jié)操作進行常用藥物的敏感性試驗,結(jié)果顯示該Pm分離株僅對氟苯尼考、頭孢三嗪、頭孢他啶、頭孢噻吩和頭孢唑肟等5種藥物敏感,對氟哌酸、優(yōu)立新、頭孢噻肟、先鋒必素和先鋒V中度敏感,對鏈霉素、強力霉素、復方新諾明、痢特靈、慶大霉素、復方阿莫西林、萬古霉素和潔霉素等藥物耐受。

    2.4HyaD-hyaC基因的克隆分析

    按照1.6.1節(jié)操作對A型莢膜生物合成相關(guān)基因HyaD-hyaC的PCR,結(jié)果見圖5。擴增出2 147 bp(泳道1)、1 044 bp(泳道2)和998 bp(泳道3)預期大小的3段特異性DNA條帶,通過序列測定,拼接為4 155 bp,包含軟骨素合成酶(1—2 919 bp)與UDP-葡萄糖-6-脫氫酶(2 983—4 155 bp)2個開放閱讀框。經(jīng)BLAST分析顯示與CP008918,CP003328,AF067175等已登錄的基因同源性高達99%,表明成功克隆了GPmHaiN2012的hyaD-hyaC基因,測序結(jié)果已提交GenBank,登錄號為KP0336621。

    1, 引物A3/A4 PCR產(chǎn)物;2, 引物A1/A2 PCR 產(chǎn)物;3, 引物A5/A6 PCR產(chǎn)物圖5 GHaiNPm2012分離株hyaD-hyaC基因的PCRFig.5 The hyaD-hyaC gene PCR results of GHaiNPm2012

    采用MegAlign軟件對克隆序列與CP008918,CP003328,AF067175等序列進行分析,顯示在第49,72,531,1 017,1 089,1 620,1 803和1 908等位點出現(xiàn)18個核苷酸差異,其中第531(A→C),1 017(T→C),1 620(T→C),1 803(T→G)和1 908(T→C)位等5個為新出現(xiàn)變異。推導的氨基酸序列對比分析顯示新出現(xiàn)的突變均在軟骨素合成酶(1—2 919 bp)基因的開放閱讀框內(nèi),531(A→C)的突變導致氨基酸的變異(L→F),其他均為同義突變。

    2.5 血清型1型鑒定基因的克隆分析

    按照1.6.2節(jié)操作分別純化GHaiNPm2012株和C48-1株的血清型1型PCR鑒定產(chǎn)物,并進行測序,2株P(guān)m測序結(jié)果完全一致(圖6),同源性100%。BLAST同源性分析顯示,目前GenBank中尚無該序列的提交,僅與GenBank中昏睡嗜血桿菌序列(登錄號CP000947等)同源性最高(84%)。

    圖6 GHaiNPm2012血清型1型測序結(jié)果Fig.6 The sequencing result of GHaiNPm2012 serotype 1-specific PCR products

    3 討論

    早期,我國關(guān)于禽霍亂的研究主要是在雞霍亂防控方面,隨著近些年我國養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展,鵝霍亂診治相關(guān)報道不斷增加[3-4],但主要是集中在傳統(tǒng)診治方面,在鵝源多殺性巴氏桿菌(Pm)的基礎(chǔ)性研究尤其是血清型檢測等方面并不深入,這可能是受到了規(guī)?;B(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展較晚、Pm血清型較多和血清學鑒定方法自身局限性的影響。本研究在剖檢基礎(chǔ)上,采用常規(guī)微生物學實驗技術(shù)和PCR技術(shù),成功分離鑒定到1株高致病性,并具有較強耐藥性的鵝源多殺性巴氏桿菌多殺亞種菌株,深入進行了Pm莢膜型與血清型Ⅰ型的PCR鑒定,及其莢膜合成相關(guān)基因和血清型Ⅰ型鑒定基因的克隆分析,為鵝巴氏桿菌病的防控及相關(guān)研究提供了科學材料和參考。

    目前,Pm血清型表示有2種方式:第1種是根據(jù)間接血凝試驗方法,將Pm分為A,B,C,D,E和F等6個莢膜血清型(群),同時根據(jù)Pm菌體抗原不同又可以將同一莢膜群Pm分為不同菌體血清型[14]。因此,常用菌體抗原(O抗原,阿拉伯數(shù)字):莢膜抗原(K抗原,大寫字母)來表示Pm的血清型。我國禽霍亂Pm主要屬于莢膜A型(群),以5∶A和8∶A型為主[14]。第2種是用甲醛生理鹽水處理細菌后提取Pm菌體熱穩(wěn)定抗原,利用瓊脂擴散方法(AGP)將Pm分為16個不同血清型[14],即用菌體熱穩(wěn)定抗原型來表示Pm血清型。這就避免了無莢膜Pm株莢膜型檢測困難、莢膜抗原制作過程復雜和普通菌體抗原有交叉反應(yīng)等弱點。我國禽Pm血清型調(diào)查結(jié)果顯示,我國流行的強毒禽霍亂Pm的血清型主要是血清型Ⅰ型[14]。有研究顯示,2種血清型表示方式間存在一定對應(yīng)關(guān)系,如Pm的5∶A型(X-73株、C48-1株)、8∶A型(P1059株)分別和血清型Ⅰ型(X-73株、C48-1株)、血清3型(P1059株)相對應(yīng)[15]。本研究采用PCR技術(shù)鑒定Pm分離菌株GHaiNPm2012為莢膜型A型,血清型1型菌株,與文獻[14]中2株鵝源Pm弱毒疫苗株P(guān)TR-780 (14型)、731(15型)的血清型不同。根據(jù)Pm參照菌株C48-1和P1059的PCR結(jié)果和文獻[15]推測,GHaiNPm2012株應(yīng)該是我國主要流行的Pm血清型(5∶A型),但這與鵝場進行過疫苗接種(常用市售Pm滅活苗疫苗株為5∶A型)相矛盾。然而與國內(nèi)學者利用Pm自家苗進行免疫取得了理想的預防效果的報道[7]相一致的是,在進行確診后利用組織滅活苗(自家苗)和綜合措施對此次疫情進行了控制,并且隨后連續(xù)2 a使用該菌株制備的自家苗均有效預防了該病發(fā)生(未報道)。因此,筆者分析認為鵝場發(fā)生鵝霍亂疫情前使用的滅活苗的疫苗株與GHaiNPm2012的血清型存在差異,考慮到血清型Ⅰ型菌株中可能有亞型存在[14],GHaiNPm2012的血清型更可能是血清型Ⅰ型菌株中的亞型,這一點還有待進一步血清學研究證實。

    本研究在病原菌分離鑒定過程中發(fā)現(xiàn),GHaiNPm2012菌株在血清平板菌落帶藍綠色熒光(Fg),同時發(fā)酵蕈糖和山梨醇,屬于多殺亞種Pm,符合主要針對家畜致病的Pm特征[16],如果排除畜源Pm感染鵝的可能,就提示著該株禽源Pm可能出現(xiàn)了培養(yǎng)特性、生化特征等性狀的改變,這也可能與本次疫情發(fā)生的免疫失敗有著一定的關(guān)聯(lián),因為Pm的一些基因表達可能存在一定的宿主特異性[17]。本研究通過雛鵝致病性試驗確定了疫情的病原為GHaiNPm2012,并測定了其對試驗小鼠的MLD為5 cfu,試驗中25 cfu·mL-1攻菌組小鼠死亡2只,可能與組內(nèi)小鼠個體差異有關(guān),也可能與細菌濃度太低、混合不勻,導致注射菌量差異有關(guān),但通過多次重復,50 cfu·mL-1(10 cfu)組小鼠都在48 h全部致死,表明了GHaiNPm2012菌株具有極強的致病性。同時,對作為Pm重要毒力因子的莢膜的合成相關(guān)酶基因hyaD-hyaC進行了克隆分析,結(jié)果擴增出包含軟骨素合成酶(1—2 919 bp)與UDP-葡萄糖-6-脫氫酶(2 983—4 155 bp)2個開放閱讀框(ORFs) 全長4 155 bp的序列,與GenBank已提交基因同源性高達99%,遺傳相對穩(wěn)定,但MegAlign分析發(fā)現(xiàn)GHaiNPm2012擴增的DNA序列新出現(xiàn)了5處點突變,全部位于軟骨素合成酶(1—2 919 bp)基因ORF內(nèi),除第531(A→C)位突變外,其他4處均為同義突變。這也可能與GHaiNPm2012菌株在長期宿主適應(yīng)中一些性狀改變具有一定相關(guān)性。另外,藥敏試驗顯示,GHaiNPm2012出現(xiàn)了嚴重的耐藥性,對復方新諾明、鏈霉素、強力霉素、慶大霉素、復方阿莫西林等10種以上受試藥物耐受,僅對氟苯尼考、頭孢三嗪、頭孢他啶、頭孢噻吩和頭孢唑肟等5種藥物敏感,這點在Pm病防治過程中應(yīng)該引起重視,一定要科學合理用藥。

    值得一提的是,本研究在國內(nèi)首次采用PCR方法[12]對GHaiNPm2012血清型(菌體熱抗原)Ⅰ型鑒定后克隆了其擴增靶基因片段,測序后BLAST分析未檢測到擴增的303 bp基因片段與GenBank中已提交Pm序列的同源性,與巴氏桿菌科相關(guān)的昏睡嗜血桿菌序列(登錄號CP000947等)同源性最高的也僅有84%,其具體原因尚有待探究。同時試驗中設(shè)立的對照菌株C48-1(Ⅰ型)和P1059(3型)擴增結(jié)果與報道的血清型相符合,且GHaiNPm2012株和C48-1株的血清型Ⅰ型PCR鑒定產(chǎn)物測序結(jié)果完全一致,表明研究中進行Pm血清Ⅰ型鑒定的PCR方法還是比較可靠的,這也為國內(nèi)進行鵝Pm的血清型分析等相關(guān)研究提供了參考依據(jù)。

    參考文獻:

    [1] 宋陽,王兆淼,魯娜. 鵝霍亂多殺性巴氏桿菌分離鑒定及疫苗的制備[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī),2011(21):119-120.

    [2] 高明燕,徐步,龔建森,等. 11株禽多殺性巴氏桿菌OmpA基因克隆測序及其序列分析[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學報,2013,25(5):951-956.

    [3] 劉丹丹,王彥紅,劉文博. 鵝感染多殺性巴氏桿菌的診治[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊,2012(1):69.

    [4] 楊澤曉,周香,王印,等. 肉鵝巴氏桿菌病的診治[J]. 動物醫(yī)學進展,2013,34(1):119-122.

    [5] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學 [M].5版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2008

    [6] 劉麗穎,賀文琦,陸慧君,等. 鵝巴氏桿菌病的病原分離鑒定及其病理學觀察[J]. 動物醫(yī)學進展,2007,28(10):33-37

    [7] 宋曉娜,刁有祥,高緒慧,等. 一株鵝源巴氏桿菌強毒株的分離及鑒定[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版) ,2012,43(4):522-528

    [8] 趙衛(wèi)東,張彥明. 伊犁地區(qū)水貂巴氏桿菌病的診斷與防治[J]. 動物醫(yī)學進展,2005,26(9):108-109.

    [9] 劉加波,謝芝勛,唐小飛,等. 應(yīng)用RAPD技術(shù)分析禽多殺性巴氏桿菌廣西分離株的DNA多態(tài)性[J]. 中國獸醫(yī)科技,2004, 34(8):32-35.

    [10] 林星宇,王印,楊澤曉,等. 豬源莢膜血清F型多殺性巴氏桿菌的分離鑒定[J]. 中國獸醫(yī)科學,2015,45(6):567-571

    [11] 李偉杰,趙耘,杜昕波,等. 產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌菌落雙重PCR檢測方法的建立[J]. 中國預防獸醫(yī)學報,2010,32(4):298-300.

    [12] TOWNSEND K M, BOYCE J D, CHUNG J Y, et al. Genetic organization ofPasteurellamultocidacaploci and development of a multiplex capsular PCR typing system [J].JournalofClinicalMicrobiology, 2001,39(3): 924-929.

    [13] ROCKE T E, SMITH S R, MIYAMOTO A, et al. A serotype-specific polymerase chain reaction for identification ofPasteurellamultocidaserotype 1 [J].AvianDiseases, 2002, 46(2): 370-377.

    [14] 林錦鴻,韓有庫,胡東良,等. 我國禽多殺性巴氏桿菌血清型調(diào)查研究[J]. 中國畜禽傳染病,1987,32 (1):1-4.

    [15] 鄭明. 我國111株由家禽分離的多殺性巴氏桿菌的血清型[J]. 畜牧獸醫(yī)學報,1984,15(2):51-55.

    [16] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學[M]. 4版. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2007.

    [17] 李浩,劉陽,李長安. 多殺性巴氏桿菌病研究進展[J]. 畜牧獸醫(yī)雜志,2011,30(2):31-33

    (責任編輯 盧福莊)

    Isolation, identification of a virulent strain goosePasteurellamultocidaand gene cloning of its serotype associated genes

    YANG Ze-xiao1,2, LIU Chang-yu1, WANG Yin1,2, YAO Xue-ping1, WU Xu-long1, WANG Bo1, LI Gui-li1, MENG Zheng-qun1, LIU Ya-dong1

    (1.CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Wenjiang611130,China; 2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince,Wenjiang611130,China)

    Goose pasteurellosis, caused by the bacteriumPasteurellamultocida(Pm), was a major infectious disease of goose in China in recent years. To identify the pathogen of goose disease in a goose-breeding farm, the causes of epidemic situation were investigated. A gram-negative bacillus was isolated and purified from the livers and hearts samples of the sick geese that preliminary diagnosed as pasteurellosis based on clinical symptoms and pathological changes, and it was identified as goosePasteurellamultocidaby morphological and cultured characteristics, biochemical tests, animal pathogenic tests, drug sensitivity tests, species and serotype PCRs and so on. Then its serotype associated genes for serotype PCRs were cloned and analysed. The results showed that the goose Pm isolate had typical morphology and biochemical characteristics ofP.multocidasubsp.multocida, and it belonged to capsular type A and serotype Ⅰ. This Pm isolate had a strong pathogenicity, and its minimus lethal dose (MLD) to mice was 5 cfu. Drug sensitivity tests showed that this isolate was only sensitive to cefatrizine, cefalotin, ceftazidime, ceftizoxime and florfenicol. A capsular biosynthesis associated genehyaD-hyaCabout 4 155 bp in this isolated Pm strain was amplified and sequenced, which shared a 99% homology with the published gene sequences. The serotype Ⅰ PCR target gene fragments about 303 bp of this goose Pm strain and the

    train C48-1 were purified and sequenced, the sequencing results were exactly the same. All these results indicated that the goose Pm isolate which had a strong pathogenic and belonged to capsular type A and serotype Ⅰ, was the pathogen of goose disease to be diagnosed. And the amplifiedhyaD-hyaCgene sequences and serotype Ⅰ PCR target gene fragments of this Pm isolate both exhibited relative stability.

    goose;Pasteurellamultocida; serotype; PCR

    10.3969/j.issn.1004-1524.2016.06.06

    2015-11-05

    四川農(nóng)業(yè)大學雙支計劃項目(00270401);“十二五”國家科技支撐計劃項目(2013BAD12B04)

    楊澤曉(1980—),男,河南南陽人,博士,副教授,從事動物疫病防治與獸醫(yī)公共衛(wèi)生研究。E-mail:yzxyang2003@126.com

    S852.61+2

    A

    1004-1524(2016)06-0935-09

    楊澤曉,劉常鈺,王印,等. 一株鵝源多殺性巴氏桿菌強毒株的分離鑒定及其血清型鑒定相關(guān)基因的克隆[J].浙江農(nóng)業(yè)學報,2016,28(6): 935-943.

    猜你喜歡
    殺性莢膜血清型
    肉牛多殺性巴氏桿菌病的流行病學、臨床癥狀、診斷與防治措施
    多殺性巴氏桿菌細胞分裂相關(guān)基因的篩選
    羊毒素型產(chǎn)氣莢膜梭菌臨床癥狀及病理變化
    肺炎鏈球菌莢膜教學標本的制作方法研究
    一株豬源A型多殺性巴氏桿菌的分離鑒定和藥敏試驗
    通遼地區(qū)牛肉與牛肉制品沙門氏菌血清型調(diào)查
    食品界(2016年4期)2016-02-27 07:36:44
    多殺性巴氏桿菌毒力因子及基因表達的研究進展
    陜西省部分地區(qū)雞源A型產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株的藥敏試驗
    廣東地區(qū)水禽大腸桿菌血清型鑒定
    肺炎鏈球菌血清型鑒定的分子生物學檢測方法
    久久久久久久亚洲中文字幕| 国产成人福利小说| 美女国产视频在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产美女午夜福利| 免费观看精品视频网站| 91久久精品电影网| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲精品国产成人久久av| 在现免费观看毛片| 联通29元200g的流量卡| 在线观看av片永久免费下载| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲最大成人手机在线| 黄色欧美视频在线观看| 精品不卡国产一区二区三区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产黄色小视频在线观看| 99热全是精品| 中文字幕久久专区| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲国产欧美在线一区| 天美传媒精品一区二区| 亚洲久久久久久中文字幕| 内射极品少妇av片p| 日本五十路高清| 丰满乱子伦码专区| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美日本视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美性感艳星| 国产精品久久久久久久久免| 人人妻人人看人人澡| 91久久精品电影网| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| kizo精华| 3wmmmm亚洲av在线观看| 色播亚洲综合网| 欧美极品一区二区三区四区| 欧美最新免费一区二区三区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲国产最新在线播放| 一级爰片在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 成人美女网站在线观看视频| 国内精品美女久久久久久| 美女黄网站色视频| 国产美女午夜福利| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产亚洲5aaaaa淫片| 91久久精品国产一区二区三区| 午夜爱爱视频在线播放| 中文资源天堂在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 十八禁国产超污无遮挡网站| 永久网站在线| 黑人高潮一二区| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产一级毛片七仙女欲春2| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 免费看美女性在线毛片视频| 中文字幕制服av| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 哪个播放器可以免费观看大片| 狠狠狠狠99中文字幕| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 激情 狠狠 欧美| 在线免费观看不下载黄p国产| 麻豆一二三区av精品| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲国产欧美人成| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 边亲边吃奶的免费视频| 国产黄a三级三级三级人| 久99久视频精品免费| a级一级毛片免费在线观看| 91久久精品电影网| 搡老妇女老女人老熟妇| 直男gayav资源| 黄色配什么色好看| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 欧美极品一区二区三区四区| 国产日韩欧美在线精品| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 乱码一卡2卡4卡精品| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 少妇人妻精品综合一区二区| 特大巨黑吊av在线直播| 欧美97在线视频| 看免费成人av毛片| 成人毛片60女人毛片免费| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 最近视频中文字幕2019在线8| 精品人妻熟女av久视频| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产在线男女| 精品国产露脸久久av麻豆 | 国产熟女欧美一区二区| 亚洲自拍偷在线| 国产中年淑女户外野战色| av在线亚洲专区| 欧美激情国产日韩精品一区| 成年女人看的毛片在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产成人精品婷婷| 免费观看的影片在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 少妇的逼水好多| 国内精品美女久久久久久| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲在线观看片| 特级一级黄色大片| 日本黄大片高清| 国产伦精品一区二区三区视频9| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 禁无遮挡网站| 亚洲美女搞黄在线观看| 日韩成人伦理影院| 成年女人看的毛片在线观看| 成人国产麻豆网| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产伦一二天堂av在线观看| 1000部很黄的大片| 我的女老师完整版在线观看| 男女国产视频网站| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| av免费观看日本| 91久久精品国产一区二区成人| 午夜久久久久精精品| 精品一区二区三区人妻视频| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久久久久九九精品影院| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲三级黄色毛片| 久久国产乱子免费精品| 国产精品熟女久久久久浪| a级一级毛片免费在线观看| 国产av在哪里看| 国产免费视频播放在线视频 | 天天一区二区日本电影三级| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 99热这里只有是精品在线观看| 伦理电影大哥的女人| 97超视频在线观看视频| 一级av片app| 免费av不卡在线播放| 国产高清视频在线观看网站| 欧美极品一区二区三区四区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 久久精品久久精品一区二区三区| 免费观看精品视频网站| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 欧美一区二区亚洲| 六月丁香七月| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产美女午夜福利| 如何舔出高潮| 国产在线一区二区三区精 | 久久久久精品久久久久真实原创| 国产精品精品国产色婷婷| 少妇人妻精品综合一区二区| 久久这里有精品视频免费| 亚洲欧美精品自产自拍| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲四区av| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 永久网站在线| 久久久久久久久久黄片| 卡戴珊不雅视频在线播放| 最后的刺客免费高清国语| 午夜精品国产一区二区电影 | 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 精品免费久久久久久久清纯| 国产乱来视频区| 日韩成人伦理影院| 国产男人的电影天堂91| 亚洲国产精品久久男人天堂| 日日啪夜夜撸| 国产精品熟女久久久久浪| 国产伦一二天堂av在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 欧美+日韩+精品| 男女啪啪激烈高潮av片| 最近中文字幕高清免费大全6| 老女人水多毛片| 欧美精品一区二区大全| 免费观看性生交大片5| 亚洲在线自拍视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲综合精品二区| 国产毛片a区久久久久| 国产亚洲91精品色在线| 免费看av在线观看网站| 美女黄网站色视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 看免费成人av毛片| 我要看日韩黄色一级片| 乱码一卡2卡4卡精品| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲国产最新在线播放| 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品人妻久久久影院| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 久久99热这里只有精品18| 人妻少妇偷人精品九色| 国产熟女欧美一区二区| 日韩av在线大香蕉| 高清视频免费观看一区二区 | 国内精品宾馆在线| 欧美激情久久久久久爽电影| 最近视频中文字幕2019在线8| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲性久久影院| 国产亚洲5aaaaa淫片| АⅤ资源中文在线天堂| av女优亚洲男人天堂| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 高清av免费在线| 久久久色成人| 啦啦啦韩国在线观看视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 91久久精品国产一区二区三区| 免费看av在线观看网站| 白带黄色成豆腐渣| 久久久成人免费电影| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 水蜜桃什么品种好| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久久色成人| 中文亚洲av片在线观看爽| 午夜亚洲福利在线播放| 看黄色毛片网站| 99热网站在线观看| 久久99热6这里只有精品| 亚洲成人中文字幕在线播放| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| www.av在线官网国产| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产精品久久久久久精品电影| 日本黄色片子视频| 国产三级中文精品| 成人av在线播放网站| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久精品影院6| 久久久国产成人免费| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲美女视频黄频| 大香蕉97超碰在线| 亚洲人成网站高清观看| 精品熟女少妇av免费看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 久久久久久久久久成人| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产成人精品一,二区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美一区二区国产精品久久精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲av二区三区四区| 97超视频在线观看视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 97超碰精品成人国产| 日本色播在线视频| 好男人在线观看高清免费视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 久久久久九九精品影院| 一级黄色大片毛片| 亚洲五月天丁香| 亚洲性久久影院| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 亚洲久久久久久中文字幕| 只有这里有精品99| 精品人妻熟女av久视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 少妇人妻精品综合一区二区| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产亚洲精品久久久com| 一个人看的www免费观看视频| 成人漫画全彩无遮挡| 国产免费又黄又爽又色| 日韩三级伦理在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 不卡视频在线观看欧美| 男人舔女人下体高潮全视频| 免费搜索国产男女视频| 免费黄色在线免费观看| 秋霞伦理黄片| 免费无遮挡裸体视频| 日韩三级伦理在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产午夜福利久久久久久| 听说在线观看完整版免费高清| 嘟嘟电影网在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 丰满乱子伦码专区| 亚洲欧美精品综合久久99| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 久久久亚洲精品成人影院| 男女国产视频网站| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲第一区二区三区不卡| 色播亚洲综合网| 日韩国内少妇激情av| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 99在线视频只有这里精品首页| 欧美日韩综合久久久久久| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲精品成人久久久久久| 三级国产精品片| ponron亚洲| 毛片女人毛片| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲国产精品成人综合色| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲av电影不卡..在线观看| eeuss影院久久| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 日本五十路高清| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产精品国产高清国产av| 日本av手机在线免费观看| 久久亚洲国产成人精品v| 久久久久久大精品| 18+在线观看网站| 丰满乱子伦码专区| 91精品一卡2卡3卡4卡| 91久久精品国产一区二区三区| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 一边亲一边摸免费视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 青春草亚洲视频在线观看| 赤兔流量卡办理| 国产av不卡久久| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 精品一区二区三区人妻视频| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 91精品伊人久久大香线蕉| 免费看光身美女| 我要搜黄色片| 久久久久久久久久成人| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 尾随美女入室| 午夜亚洲福利在线播放| 大香蕉久久网| 日韩av在线大香蕉| 成人亚洲欧美一区二区av| 天天躁日日操中文字幕| 国产高清不卡午夜福利| 国产亚洲av嫩草精品影院| 精品国产露脸久久av麻豆 | 国产乱来视频区| 午夜福利在线在线| 日本黄色片子视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产乱人视频| 国产精品一及| 桃色一区二区三区在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 一级黄片播放器| 亚洲精品亚洲一区二区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 22中文网久久字幕| 最近的中文字幕免费完整| 国产精品三级大全| 久久久欧美国产精品| 久久久精品94久久精品| 99热6这里只有精品| 男的添女的下面高潮视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲欧美日韩东京热| 免费观看性生交大片5| 午夜免费男女啪啪视频观看| 丰满乱子伦码专区| 伦精品一区二区三区| 免费观看人在逋| 不卡视频在线观看欧美| 欧美zozozo另类| .国产精品久久| 一区二区三区乱码不卡18| 全区人妻精品视频| 午夜爱爱视频在线播放| 只有这里有精品99| 欧美另类亚洲清纯唯美| av免费在线看不卡| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产成人福利小说| 尾随美女入室| 欧美激情在线99| 看十八女毛片水多多多| 一区二区三区乱码不卡18| 天堂中文最新版在线下载 | 亚洲国产精品专区欧美| 一级爰片在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 黑人高潮一二区| 精品久久久噜噜| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 色5月婷婷丁香| 观看美女的网站| 国产精品国产高清国产av| 欧美成人一区二区免费高清观看| 日本黄大片高清| 最近2019中文字幕mv第一页| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产午夜精品一二区理论片| 久久亚洲精品不卡| 欧美极品一区二区三区四区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲精品影视一区二区三区av| 日韩欧美国产在线观看| 只有这里有精品99| 人妻少妇偷人精品九色| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 97超视频在线观看视频| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美97在线视频| 日韩精品青青久久久久久| 一级二级三级毛片免费看| 国产色爽女视频免费观看| 五月伊人婷婷丁香| 久久人人爽人人片av| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 免费搜索国产男女视频| 亚洲真实伦在线观看| 午夜免费激情av| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 欧美成人a在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 国产麻豆成人av免费视频| 欧美日韩在线观看h| 亚洲国产成人一精品久久久| 日韩欧美三级三区| 亚洲人成网站在线观看播放| 成人午夜高清在线视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲精品日韩av片在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 精品久久国产蜜桃| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 日本免费在线观看一区| 午夜激情欧美在线| 最新中文字幕久久久久| 久久久精品大字幕| 一级二级三级毛片免费看| 欧美+日韩+精品| 观看美女的网站| 亚洲性久久影院| 国产乱人偷精品视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美性感艳星| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日韩大片免费观看网站 | 久久久久久久亚洲中文字幕| 午夜a级毛片| 成人av在线播放网站| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲国产欧美人成| 免费黄网站久久成人精品| 中文欧美无线码| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲色图av天堂| or卡值多少钱| 成人美女网站在线观看视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 26uuu在线亚洲综合色| 嫩草影院新地址| 综合色丁香网| 国产淫语在线视频| 日本wwww免费看| 久久久国产成人精品二区| 日韩人妻高清精品专区| 午夜免费激情av| 精品不卡国产一区二区三区| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 一个人看视频在线观看www免费| 日本免费a在线| 搞女人的毛片| 久久99热这里只频精品6学生 | av.在线天堂| 午夜免费激情av| 精品熟女少妇av免费看| 国产在视频线精品| 欧美区成人在线视频| av专区在线播放| 亚洲av福利一区| 内地一区二区视频在线| 五月伊人婷婷丁香| 18禁动态无遮挡网站| 人体艺术视频欧美日本| av在线观看视频网站免费| 男人和女人高潮做爰伦理| 免费无遮挡裸体视频| 一个人免费在线观看电影| 国产探花极品一区二区| 成人午夜高清在线视频| 看免费成人av毛片| 国产精品久久久久久av不卡| 国产成人午夜福利电影在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| ponron亚洲| 色综合站精品国产| 日韩一区二区视频免费看| 国产一区二区在线av高清观看| 少妇的逼水好多| av在线天堂中文字幕| 久久久久久久久久成人| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲不卡免费看| 欧美激情久久久久久爽电影| 成人漫画全彩无遮挡| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 一级av片app| 国产极品天堂在线| 欧美色视频一区免费| 国内精品美女久久久久久| 国产老妇伦熟女老妇高清| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 亚洲欧美日韩东京热| 久久6这里有精品| 国产成人freesex在线| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产探花在线观看一区二区| 国产av不卡久久| 男女那种视频在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲国产精品国产精品| 日韩三级伦理在线观看| videos熟女内射| 色吧在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频 | 日韩一区二区视频免费看| 长腿黑丝高跟| 美女被艹到高潮喷水动态| 淫秽高清视频在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 亚洲国产成人一精品久久久| 日本色播在线视频| 午夜激情欧美在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 婷婷色av中文字幕| 日本色播在线视频| 国产麻豆成人av免费视频| 99热全是精品| 一级毛片aaaaaa免费看小| 黑人高潮一二区| 天堂网av新在线| 有码 亚洲区| 日韩国内少妇激情av| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日本黄色视频三级网站网址| 精品人妻熟女av久视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 中文天堂在线官网| 午夜激情福利司机影院| 精品久久久久久久久亚洲| 精品久久久久久成人av| 亚洲av成人av| 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲av一区综合| 91狼人影院| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产精品.久久久| 一级毛片我不卡| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 久久热精品热| 免费看av在线观看网站| 久久99热这里只有精品18| 99热这里只有是精品50| 久久精品综合一区二区三区| 内射极品少妇av片p| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 成人毛片60女人毛片免费| 青春草国产在线视频| 国产一区二区在线观看日韩| 国产综合懂色| 国内揄拍国产精品人妻在线| 级片在线观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲高清免费不卡视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 午夜激情福利司机影院| 在线观看一区二区三区| 久久人妻av系列| 我要搜黄色片| 在线观看av片永久免费下载| 天堂影院成人在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8|