PDA/SiO2大孔復(fù)合材料固定化熒光假單胞菌脂肪酶

白文靜　李　云　曹大麗　吳燕飛　梁云霄

(新型功能材料及其制備科學(xué)國家重點實驗室培育基地，寧波大學(xué)材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，寧波315211)

PDA/SiO2大孔復(fù)合材料固定化熒光假單胞菌脂肪酶

白文靜李云曹大麗吳燕飛梁云霄＊

(新型功能材料及其制備科學(xué)國家重點實驗室培育基地，寧波大學(xué)材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，寧波315211)

以具有三維骨架結(jié)構(gòu)的大孔聚合物為模板制備SiO2大孔材料，通過多巴胺在SiO2大孔材料孔道表面的原位聚合制得聚多巴胺表面功能化修飾的二氧化硅大孔材料(PDA/SiO2)。應(yīng)用SEM、EDX、MIP、BET、TG-DTA和FTIR等技術(shù)對修飾前后的材料進行表征。以PDA/SiO2為載體固定熒光假單胞菌脂肪酶(PFL)，優(yōu)化固定化條件并對比游離脂肪酶和固定化脂肪酶的性質(zhì)。結(jié)果表明SiO2大孔材料具有三維連續(xù)貫通的孔道結(jié)構(gòu)，孔徑分布在300～500 nm，聚多巴胺修飾后形成聚多巴胺/二氧化硅復(fù)合納米薄膜構(gòu)筑的大孔材料。在固定化時間為14 h、pH值為8、初始脂肪酶濃度為0.4 mg·mL-1時，固定化效果最佳，酶活回收率達246%。與游離脂肪酶相比，固定化脂肪酶有更寬的溫度和pH適用范圍、熱穩(wěn)定性顯著提高，并展現(xiàn)出良好的儲存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性，固定化脂肪酶的Km低于游離脂肪酶的，酶與底物的親和性較好。

SiO2大孔材料；功能化修飾；聚多巴胺；固定化；熒光假單胞菌脂肪酶

0　引言

脂肪酶(Lipase,E.C.3.1.1.3)是一類?；饷福哂写呋咝?、高選擇性以及催化底物較寬泛等特性[1-2]，在醫(yī)藥衛(wèi)生[3]、食品工業(yè)[4-5]和化學(xué)化工[6-7]等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用。游離脂肪酶易受環(huán)境影響變性失活、難以回收、不易循環(huán)利用，固定化脂肪酶不僅保留了游離酶的活性和高選擇性，而且穩(wěn)定性好、成本低、易從反應(yīng)體系中分離、便于重復(fù)使用[8]，具有更廣闊的應(yīng)用空間。

載體的選擇是影響固定化酶性能的主要因素之一。多孔材料通常有較大的比表面積，常用于固定化酶[9]。尤其是介孔材料因具有高比表面積、酶的固載量大等優(yōu)點，將其應(yīng)用于固定化脂肪酶已得到了廣泛的研究[10]。在多孔載體內(nèi)部酶的固定化需要經(jīng)歷一個緩慢的擴散過程，孔徑大小對酶的固定化至關(guān)重要[11]，較小的孔徑由于孔道尺寸的限制，對酶和底物存在較大的傳質(zhì)阻力[12-13]，酶難以滲透進孔道內(nèi)部而僅吸附于材料表面。Li等[14]在研究聚苯乙烯微球孔徑大小對固定化脂肪酶性能的影響時發(fā)現(xiàn)：介孔微球的比表面積(745 m2·g-1)比大孔微球的(19 m2· g-1)大得多，固載量也最大，但大孔微球固定化脂肪酶的酶學(xué)性能最好。大孔材料的比表面積通常比介孔材料的小很多，但用大孔材料固定化酶有以下優(yōu)點：由于孔徑大從而減小了酶在固定化過程中的傳質(zhì)阻力；在固定化酶催化底物反應(yīng)時，底物更容易接近酶的活性位點；便于表面功能化修飾引入活性基團[15]，包括用功能高分子進行修飾[16]。多巴胺(DA)能夠在堿性條件下氧化發(fā)生聚合反應(yīng)，形成強力粘附于載體表面的聚多巴胺(PDA)層[17-18]，反應(yīng)過程溫和，無毒無害且聚多巴胺富含功能基團，生物相容性好，具有共價連接親核基團的能力[19]。Ren等[20]用PDA修飾磁性氧化鐵納米顆粒用于固定化脂肪酶，提高了脂肪酶的活性和穩(wěn)定性。

本研究首先以具有三維骨架結(jié)構(gòu)的大孔聚合物為模板制得塊體SiO2大孔材料，通過DA原位聚合使PDA均勻地粘附在SiO2大孔材料的孔壁上制得PDA修飾的二氧化硅大孔材料(PDA/SiO2)，該大孔材料由PDA和二氧化硅復(fù)合納米薄膜構(gòu)筑而成，既具有無機材料機械強度高、優(yōu)良的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性等特點又結(jié)合了高分子涂層表面富含功能基團等優(yōu)點，預(yù)期可以作為固定化酶的優(yōu)良載體。應(yīng)用SEM、MIP、BET、EDX、TG-DTA和FTIR等技術(shù)對制備材料進行表征；以PDA/SiO2為載體固定化熒光假單胞菌脂肪酶(PFL)，優(yōu)化了脂肪酶的固定化條件，并對比了游離脂肪酶和固定化脂肪酶的相關(guān)性質(zhì)。

1　實驗部分

1.1SiO2大孔材料的制備

將32 g環(huán)氧樹脂，58 g聚乙二醇1000和10 g聚乙二醇2000混合，加熱攪拌熔化為澄清溶液，在劇烈攪拌下迅速加入9.3 g三乙烯四胺，將澄清溶液倒入聚四氟乙烯淺盤中，70℃下反應(yīng)2.5 h。取出白色聚合物后將其切割為粒徑為2～3 mm的塊體，用水充分浸泡洗滌除去PEG，室溫下真空干燥12 h，得到具有三維骨架結(jié)構(gòu)的大孔聚合物。將塊狀聚合物浸入正硅酸四乙酯中3 h，濾出后，50℃下在NH3·H2O氣氛中放置12 h，使正硅酸四乙酯充分水解為SiO2，將得到的復(fù)合物在60℃下干燥2 h后置于馬弗爐中以5℃·min-1的速度升溫至600℃，并持續(xù)煅燒3 h，即得塊體SiO2大孔材料。

1.2PDA/SiO2大孔復(fù)合材料的制備

用去離子水配制濃度為0.8 mg·mL-1的多巴胺溶液，加入干燥的塊體SiO2大孔材料，振蕩、充分浸泡后，用0.1 mol·L-1pH值為9.0的Tris-HCl緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為8.5，置于恒溫水浴搖床中25℃下反應(yīng)12 h，用去離子水多次洗滌除去未附著在大孔材料上的聚多巴胺，30℃真空干燥5 h，得到PDA/SiO2。

Scheme 1 Schematic description of surface modification of macroporous SiO2by the polydopamine coating and subsequent lipase immobilization on PDA/SiO2

1.3PFL的固定化

用0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液溶解PFL配置不同濃度的酶溶液，取0.1 g PDA/SiO2置于10 mL脂肪酶溶液中，在35℃、轉(zhuǎn)速為100 r·min-1的水浴恒溫振蕩器中振蕩一定時間，濾出大孔材料，用相同pH值的磷酸鹽緩沖溶液洗滌至洗滌液中檢測不到蛋白含量為止，25℃下真空干燥，4℃下儲存待用，固定化脂肪酶標記為PFL@PDA/SiO2（Scheme 1）。

1.4表征方法

采用AMETEK公司的SU70型掃描電鏡(SEM)對大孔SiO2、PDA/SiO2和PFL@PDA/SiO2樣品形貌進行表征；用MICROMERITICS INSTRUMENT公司的AutoPore IV9500型壓汞儀對大孔SiO2的孔徑分布、孔體積和孔隙率進行表征；用北京金埃譜科技有限公司的V-Sorb 2800P型比表面積及孔徑分析儀進行比表面積分析，利用BET公式計算大孔SiO2和PDA/SiO2的比表面積；用Nicolet公司PEOTEGE460 E.S.P型傅立葉變換紅外光譜儀(FTIR)，采用KBr壓片法測定樣品的結(jié)構(gòu)組成，掃描范圍為400～4 000 cm-1；用AMETEK公司的EDAX型能譜儀(EDX)隨機選取樣品不同區(qū)域進行元素分析；用Mehler-Toledo公司的TGA/SDTA 851e型熱重分析儀，在N2保護下，以10℃·min-1的升溫速度在30～600℃范圍內(nèi)測定樣品的熱分解規(guī)律；用北京普析通用公司的T6新世紀紫外-可見分光光度計分別讀取595和410 nm處對應(yīng)的蛋白質(zhì)和對硝基苯酚的吸光度。

1.5酶活和蛋白含量的測定

以對硝基苯月桂酸酯(p-NPL)為底物測定脂肪酶的活性[21]。取0.1 g固定化脂肪酶（或當量的游離脂肪酶）加入4 mL的p-NPL底物溶液中，在37℃下反應(yīng)3 min，用分光光度法在波長為410 nm處測定水解產(chǎn)物對硝基苯酚(p-NP)的吸光度，根據(jù)標準曲線計算反應(yīng)生成的p-NP量。一個酶活(U)單位定義為每分鐘產(chǎn)生1 μmol p-NP所需的酶量。為便于考察變量對酶固定化條件以及固定化酶性質(zhì)的影響，以同組實驗中酶活的最高值或處理前的酶活為100%進行數(shù)據(jù)處理。酶活回收率=(固定化脂肪酶的酶活/與固定化脂肪酶等量的游離脂肪酶的酶活)× 100%。根據(jù)Bradford法[22]測定脂肪酶溶液在595 nm處的吸光度，以牛血清蛋白為標準繪制標準曲線，計算脂肪酶的固載量。

2　結(jié)果與討論

2.1材料的表征

2.1.1材料的形貌分析

圖1為大孔SiO2(A、D)、PDA/SiO2(B、E)和PFL@PDA/SiO2(C、F)的SEM圖。由圖1(A、D)可以看出大孔SiO2的孔壁為連續(xù)的SiO2納米薄膜、厚度在25～35 nm，大孔孔徑在300～500 nm之間，具有三維連續(xù)貫通的孔道結(jié)構(gòu)。對比圖1(B、E)可知，經(jīng)PDA修飾后，孔道結(jié)構(gòu)沒有明顯變化，孔壁厚度有所增加，說明形成了聚多巴胺/二氧化硅復(fù)合納米薄膜構(gòu)筑的大孔材料。固定化酶后(圖1F)，孔壁表面出現(xiàn)了一些酶納米顆粒，未出現(xiàn)孔道堵塞現(xiàn)象，生物催化劑很好地保持了原有大孔SiO2的孔結(jié)構(gòu)。

圖1　大孔SiO2(A,D)、PDA/SiO2(B,E)和PFL@PDA/SiO2(C,F)的SEM圖Fig.1　SEM images of macroporous SiO2(A,D),PDA/SiO2(B,E)and PFL@PDA/SiO2(C,F)

2.1.2孔性質(zhì)及比表面積分析

利用壓汞法測得大孔SiO2的孔體積為5.6 cm3· g-1，孔隙率為90%，中值孔徑為350 nm、孔徑主要分布在300～500 nm之間，與電鏡圖所觀察的結(jié)果一致。通過BET方程計算得到大孔SiO2和PDA/SiO2的比表面積分別為46 m2·g-1和36 m2·g-1，PDA修飾后，比表面積有所降低，此結(jié)果與文獻[23]相似，這可能是由于部分介孔被PDA堵塞的緣故。

2.1.3結(jié)構(gòu)組成表征

大孔SiO2、PDA/SiO2、PFL@PDA/SiO2和游離PFL的紅外光譜如圖2所示。大孔SiO2譜圖(圖2a)中，在466 cm-1和808 cm-1為Si-O伸縮振動峰，1 105 cm-1對應(yīng)Si-O-Si反伸縮振動峰，1 230 cm-1為SiO2表面Si-O-H中O-H的彎曲振動峰,3 440 cm-1處的寬峰為Si-O-H中O-H的伸縮振動峰。PDA/SiO2譜圖(圖2b)中3 459 cm-1處的特征峰為O-H和N-H伸縮振動峰的疊加，新增的峰1 596 cm-1對應(yīng)聚多巴胺苯環(huán)C=C伸縮振動峰，2 937 cm-1對應(yīng)CH2的伸縮振動峰[24]，1 358 cm-1對應(yīng)酚的C-O-H彎曲振動峰，說明聚多巴胺成功修飾到SiO2大孔材料上。游離的脂肪酶(圖2c)展示出酰胺基（CONH）的特征吸收峰，1 601 cm-1為酰胺Ⅰ中C=O伸縮振動峰，1 452和1 355 cm-1處為酰胺Ⅱ和Ⅲ的特征吸收峰，在1 100～1 000 cm-1處的吸收峰為肽鏈中C-C和CN的振動吸收峰[25]。當PFL固定在PDA/SiO2復(fù)合材料上后，脂肪酶中酰胺Ⅰ的振動吸收峰與聚多巴胺苯環(huán)C=C伸縮振動峰重疊，但酰胺Ⅱ的吸收峰在1 458 cm-1處出現(xiàn)，而且在1 353 cm-1和1 200～900 cm-1處的振動峰顯著增強，因此紅外振動吸收峰對應(yīng)的改變說明PFL固定在PDA/SiO2復(fù)合材料上。

圖2大孔SiO2(a)、PDA/SiO2(b)、PFL@PDA/SiO2(c)和游離PFL(d)的紅外光譜圖Fig.2　IR spectra of macroporous SiO2,PDA/SiO2(b), PFL@PDA/SiO2(c)and free PFL(d)

圖3(a)為SiO2大孔材料的EDX圖，顯示只含有O、Si兩種元素。圖3(b)和3(c)為隨機選取的PDA/ SiO2表面和內(nèi)部的EDX圖，均檢測到C、N、O、Si的元素特征峰，從圖中可以看出，PDA/SiO2表面和內(nèi)部的各元素含量百分比大致相同，說明PDA均勻粘附在SiO2大孔材料孔壁上。

圖3　大孔SiO2(a)、PDA/SiO2表面(b)和內(nèi)部(c)的EDX譜圖Fig.3　EDX spectra of macroporous SiO2(a),the surface(b)and the inside(c)of PDA/SiO2

大孔SiO2和PDA/SiO2的熱重和差熱曲線如圖4所示，大孔SiO2脫去表面部分硅羥基大約失重2%，PDA/SiO2在250～420℃之間有明顯的失重，保留了近91.6%的質(zhì)量，PDA/SiO2的失重由PDA分解所引起，去除SiO2大孔材料本身的熱失重，得到PDA占PDA/SiO2大孔復(fù)合材料質(zhì)量的約6.4%。

2.2固定化脂肪酶條件的優(yōu)化

2.2.1初始脂肪酶濃度對固定化的影響

當脂肪酶溶液pH值為8.5、固定化時間為16 h時，酶活和固載量隨初始脂肪酶濃度的變化曲線如圖5，脂肪酶的酶活隨濃度的增加先逐漸增加，當初始酶濃度為0.4 mg·mL-1時，酶活最大；當酶濃度大于0.4 mg·mL-1時，酶活呈減小的趨勢，脂肪酶的固載量始終呈現(xiàn)不斷增加的趨勢。該現(xiàn)象可能是由于載體表面負荷能力一定，隨著酶濃度的增加載體結(jié)合酶蛋白的總量增加，酶活逐漸增大，然而不斷增加初始酶的濃度造成酶分子的擁擠，酶的活性位點被阻塞，阻礙酶與底物之間的反應(yīng)，表現(xiàn)為固定化酶的活性呈下降趨勢[26]。

圖4　大孔SiO2和PDA/SiO2的TG-DTG曲線Fig.4　TG and DTG curves of macroporous SiO2andPDA/SiO2

圖5　初始酶濃度對脂肪酶固定化的影響Fig.5　Effect of initial concentration on lipaseimmobilization

2.2.2固定化時間的影響

當初始脂肪酶濃度為0.4 mg·mL-1、pH值為8.5時，固定化時間對酶活和固載量的影響如圖6，在反應(yīng)初始階段，隨著固定化時間的延長酶活逐漸增加，當固定化時間達到14 h時，相對酶活達到最大，延長固定化時間，酶活并沒有增加，反而有所降低，而固載量在前9 h內(nèi)基本呈直線上升，至14 h基本達到飽和值，與陶維紅等[27]的研究結(jié)果相似，選取14 h為固定化時間。

圖6　時間對脂肪酶固定化的影響Fig.6　Effect of time on lipase immobilization

2.2.3pH值對脂肪酶固定化的影響

脂肪酶初始濃度為0.4 mg·mL-1、固定化時間為14 h時，溶液pH值對脂肪酶固定化效果的影響如圖7所示，pH值在6～9變化時，脂肪酶的固載量并未隨著pH值的變化有很大的變化，維持在一定范圍內(nèi)，而固定化脂肪酶的酶活隨著pH值的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當pH值為8時固定化脂肪酶的酶活最大。溶液pH值值影響脂肪酶的離子化狀態(tài)[28]，中性或弱堿性的情況下，固定化脂肪酶酶活明顯增強，可能通過pH值的調(diào)控，酶的賴氨酸的ε-氨基與組氨酸的咪唑基與載體表面聚多巴胺的作用實現(xiàn)固定化；在pH值小于7.5或者大于8.5的范圍，酶活下降，由于酶作為一種蛋白質(zhì)，溶液pH值超過一定范圍時，酶的構(gòu)象會發(fā)生可逆或不可逆的變化，導(dǎo)致酶活的降低或喪失。

圖7　pH值對脂肪酶固定化的影響Fig.7　Effect of pH value on lipase immobilization

綜上所述，在固定化時間為14 h、pH值為8、初始脂肪酶濃度為0.4 mg·mL-1時，PFL固定化效果最佳，酶活達到4 650 U·g-1，固載量為4.24 mg·g-1，相應(yīng)游離酶的酶活為445.2 U·mg-1，酶活回收率達246%。酶活回收率高可能有以下原因：(1)部分脂肪酶分子與載體作用后構(gòu)象發(fā)生了變化，活性中心從封閉狀態(tài)變成開放狀態(tài)；(2)PDA/SiO2的孔徑比酶分子直徑大得多，固定化酶在催化底物反應(yīng)時，底物容易接近酶的活性中心[29]，產(chǎn)物容易從催化劑的孔道內(nèi)擴散至溶液本體中。

2.3固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1最適pH值和溫度

測定固定化脂肪酶和游離脂肪酶在不同pH值下的酶活，相對酶活隨pH值的變化如圖8所示。游離脂肪酶的最適pH值為8，固定化脂肪酶的最適pH值為9，固定化脂肪酶比游離酶展現(xiàn)了更寬的pH值適應(yīng)范圍，在pH值為7到10范圍內(nèi)固定化脂肪酶受pH值的影響較小，相對酶活在90%以上，這與Lei等[30]的報道類似，可能與固定化方法和載體的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖8　pH值對游離脂肪酶和固定化脂肪酶酶活的影響Fig.8　Effect of pH value on the activities of immobilized and free lipase

測定固定化脂肪酶和游離脂肪酶在不同溫度下的酶活，相對酶活隨溫度的變化如圖9所示。游離脂肪酶和固定化脂肪酶的最適溫度均為40℃，但固定化脂肪酶在20～60℃溫度范圍內(nèi)酶活維持在80%以上，顯示出更寬的溫度適應(yīng)范圍，在相同溫度下游離脂肪酶比固定化脂肪酶的酶活降低的程度大，表明固定化脂肪酶有較好的溫度適應(yīng)性。

圖9　溫度對游離脂肪酶和固定化脂肪酶酶活的影響Fig.9　Effect of temperature on the activities of immobilized and free lipase

2.3.2熱穩(wěn)定性

Park等[31]研究PFL的熱穩(wěn)定性時發(fā)現(xiàn)：在磷酸鹽緩沖溶液中，當溫度高于50℃時，PFL熱失活很快。為了更好地對比固定化脂肪酶和游離脂肪酶的熱穩(wěn)定性，分別將它們置于50℃下磷酸鹽緩沖液（0.1 mol·L-1,pH值7.0）中保溫，每隔30 min在相同的條件下測定酶活。如圖10所示，相較游離脂肪酶，固定化脂肪酶的酶活降低的幅度很小，保溫480 min后游離脂肪酶的相對酶活降到8.2%，而固定化脂肪酶的相對酶活為70%，固定化脂肪酶的熱穩(wěn)定性遠遠優(yōu)于游離脂肪酶的熱穩(wěn)定性，實驗結(jié)果與Lei等[32]用磁性微球為載體固定褶皺假絲酵母脂肪酶的熱穩(wěn)定性測試結(jié)果相似，這歸因于在脂肪酶固定化后剛性有所提高，降低了高溫條件下引起酶失活的速度。

圖10　游離脂肪酶和固定化脂肪酶的熱穩(wěn)定性Fig.10　Thermal stabilities of immobilized and free lipase

2.3.3操作穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性

固定化脂肪酶與底物重復(fù)反應(yīng)8批次的結(jié)果如圖11所示，重復(fù)使用5批次后，相對酶活降為68%，酶活損失相對較快，可能是由于在重復(fù)使用或清洗過程中部分以物理吸附方式吸附于載體上的酶分子脫落造成酶活損失。重復(fù)操作6批次之后，相對酶活保持在50%不再變化，說明另一部分酶分子與PDA/SiO2載體形成了穩(wěn)定的共價鍵，不容易脫落。脂肪酶經(jīng)固定化后具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性。

將固定化脂肪酶和游離脂肪酶儲存在4℃條件下，每隔一定時間測定酶活，儲存穩(wěn)定性如圖12所示。固定化酶儲存20 d后相對酶活為89.3%，而游離酶的為62.3%，游離酶在儲存58 d后，相對酶活僅剩11.5%，而固定化酶的相對酶活仍然保持在66%，說明PFL被固定化后儲存穩(wěn)定性顯著提高，優(yōu)于PFL固定于氨基功能化修飾的Fe3O4納米顆粒的儲存穩(wěn)定性（儲存21 d后相對酶活為40%）[33]。

圖11　固定化脂肪酶的操作穩(wěn)定性Fig.11　Operational stability of immobilized lipase

圖12　固定化脂肪酶的儲存穩(wěn)定性Fig.12　Storage stability of immobilized lipase

2.4動力學(xué)常數(shù)

動力學(xué)常數(shù)Km是酶的特征常數(shù)，是衡量酶與底物之間親和力大小的依據(jù),越低的Km值意味著酶與底物有更好的親和性。配制濃度不同的p-NPL底物溶液，將固定化脂肪酶和游離脂肪酶分別與底物反應(yīng)3 min后，測定410 nm處的吸光度變化值，根據(jù)對硝基苯酚的濃度-吸光度標準曲線，計算反應(yīng)的初始速度(V)，以1/V和1/S（S為底物濃度）為坐標作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖（如圖13）。通過計算求得固定化脂肪酶的Km值為1.783 mmol·L-1，游離脂肪酶的Km為2.298 mmol·L-1，固定化脂肪酶的Km略低于游離脂肪酶的Km，反映了脂肪酶固定化后與底物有較好的親和性。

圖13　脂肪酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖Fig.13　Lineweaver-Burk plots of immobilized and free lipase

3　結(jié)論

以具有三維骨架結(jié)構(gòu)的大孔聚合物為模板制得大孔SiO2，其具有三維連續(xù)貫通的大孔孔道結(jié)構(gòu)，孔徑分布在300～500 nm，比表面積大，孔隙率高。采用原位聚合法，使聚多巴胺均勻地粘附在大孔SiO2的孔壁上制得復(fù)合納米薄膜構(gòu)筑的PDA/SiO2大孔材料，它很好地保持了大孔SiO2的孔道結(jié)構(gòu)。以PDA/ SiO2為載體固定化熒光假單胞菌脂肪酶，酶活回收率達246%，與游離脂肪酶相比，固定化脂肪酶的熱穩(wěn)定性、儲存穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì)均顯著提高。大孔PDA/SiO2既具有無機材料機械強度高、化學(xué)和熱穩(wěn)定性好等特點又結(jié)合了高分子涂層表面富含功能基團等優(yōu)點；同時，三維連續(xù)貫通的大孔能夠較好地解決傳質(zhì)問題，固定化酶能得到高效利用；而且大尺寸的塊狀材料便于回收利用。因此，用PDA/SiO2固定化酶有良好的應(yīng)用前景。

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Immobilization of Pseudomonas Fluorescens Lipase on PDA/SiO2Macroporous Composite

BAI Wen-Jing LI Yun CAO Da-Li WU Yan-Fei LIANG Yun-Xiao＊
(State Key Laboratory Base of Novel Functional Materials and Preparation Science,Faculty of Materials Science and Chemical Engineering,Ningbo University,Ningbo,Zhejiang 315211,China)

A large-sized macroporous SiO2was prepared via a polymer template with three-dimensional(3D) skeletal structure and it was surface functionalized with polydopamine(PDA)by controlling the in situ polymerization of dopamine in its micro-channels to obtain the macroporous composite polydopamine/SiO2(PDA/SiO2). Samples were characterized by SEM,EDX,MIP,BET,TG-DTA and FTIR.PDA/SiO2was used to immobilize pseudomonas fluorescens lipase(PFL),immobilization conditions were optimized,and the properties of immobilized and free PFL were studied.The results show that the macroporous SiO2has 3D continuous pass-through pore structure,the pore sizes are in the range of 300～500 nm.After modification with PDA,the pore walls of the resulting PDA/SiO2are composed of PDA and SiO2composite nano-film.The best activity recovery of immobilized lipase is 246%under conditions of immobilizing time of 14 h,pH of 8 and initial PFL concentration 0.4 mg· mL-1.Compared with free PFL,the optimum working temperature and pH ranges of immobilized PFL are both widened,and the thermal stability of immobilized PFL is improved significantly.Immobilized PFL has good operational and storage stabilities.The Kmof immobilized PFL is lower than that of free PFL,suggesting a better affinity capacity between PFL and substrate.

macroporous SiO2;functionalization;polydopamine;immobilization;pseudomonas fluorescens lipase

Q814.2

A

1001-4861(2016)11-1973-08

10.11862/CJIC.2016.261

2016-05-19。收修改稿日期：2016-10-07。

浙江省公益項目(No.2014C31130)、浙江省自然科學(xué)基金(No.LY12B01004)和寧波大學(xué)王寬誠幸?；?No.XKL072)資助。＊通信聯(lián)系人。E-mail：liangyunxiao@nbu.edu.cn；會員登記號：S060017726M。