豬圓環(huán)病毒2型自然感染條件下的豬口蹄疫免疫效果調(diào)查

王克才，王芳，吳新華，郭祉岐，鄭洪玲，李曉楠，吳運譜

（1.遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽110164；2.遼寧輝山集團，遼寧沈陽110164；3.遼寧省朝陽市雙塔區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧朝陽122000；4.遼寧省遼陽市白塔區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督管理中心，遼寧遼陽111000）

豬圓環(huán)病毒2型自然感染條件下的豬口蹄疫免疫效果調(diào)查

王克才1，王芳2，吳新華3，郭祉岐4，鄭洪玲1，李曉楠1，吳運譜1

（1.遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽110164；2.遼寧輝山集團，遼寧沈陽110164；3.遼寧省朝陽市雙塔區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧朝陽122000；4.遼寧省遼陽市白塔區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督管理中心，遼寧遼陽111000）

本研究對豬圓環(huán)病毒2型自然感染風(fēng)險條件下的10窩98頭仔豬隨機分成口蹄疫常規(guī)和倍量2個免疫劑量組，另選5頭成年母豬作為圓環(huán)感染陰性對照，仔豬于35日齡和65日齡進(jìn)行豬口蹄疫O型滅活疫苗免疫，并于首免前的28日齡、首免后21 d和二免后的29 d采血，5頭成年母豬同期進(jìn)行采血，分別進(jìn)行PCV-2核酸、抗體和豬口蹄疫O型ELISA抗體檢測。結(jié)果顯示，成年母豬PCV-2核酸均為陰性，口蹄疫免疫抗體水平均達(dá)到≥1∶128；2組仔豬首免后21 d和二免后29 d檢測存在不同比率的PCV-2核酸陽性和抗體陽性，豬口蹄疫抗體合格率分別為69%、97.5%和13.8%、25%，提示斷奶仔豬可能因感染PCV-2而影響了豬口蹄疫免疫效果。

豬圓環(huán)病毒2型；自然感染；豬口蹄疫；免疫；效果

豬2型圓環(huán)病毒（Porci ne ci rcovi rus type 2，PCV-2）是現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)十分重要的免疫抑制性病原之一。目前該病毒感染流行十分普遍，由PCV-2感染所引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭征（PM W S）和豬呼吸系統(tǒng)綜合征（PRDC），對現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)危害較大，而且由于豬在感染PCV-2后產(chǎn)生免疫抑制作用，可能導(dǎo)致對其他豬群疫病免疫造成負(fù)面影響，導(dǎo)致豬群疫病防控效果大打折扣，對養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展構(gòu)成了現(xiàn)實威脅。為探究田間狀態(tài)下的PCV-2自然感染豬群接種豬口蹄疫滅活疫苗的免疫效果，并對指導(dǎo)和評價豬口蹄疫科學(xué)免疫提供參考依據(jù)，筆者開展了本次試驗調(diào)查。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗豬選擇具有PCV-2病史的某種豬場2013年6月2～5日出生的10窩105頭仔豬群和5頭成年母豬，作為備用調(diào)查群體。

1.1.2免疫用疫苗豬口蹄疫（O/GX/09-7株+O/XJ/ 10-11株）滅活疫苗，中牧實業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：1304003。

1.1.3主要檢測試劑PCV-2抗體ELISA檢測試劑盒，購自北京世紀(jì)元亨生物技術(shù)公司，批號：PCV-20130508E；PCV-2核酸熒光PCR檢測試劑盒，購自達(dá)安基因生物技術(shù)公司，批號：2013001、2013002。口蹄疫O型液相阻斷ELISA試劑盒，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，批號：2013050901。

1.2試驗方法

1.2.1試驗豬處理選擇該場同期分娩的10窩105頭仔豬和5頭成年母豬作為備用調(diào)查試驗豬，仔豬28日齡前，死亡7頭，其余98頭隨機分成常規(guī)劑量免疫組（58頭）和倍量免疫組（40頭）。為了便于區(qū)分，隨機將實行常規(guī)劑量免疫的仔豬打上藍(lán)色耳標(biāo)，將實行倍量免疫的仔豬打上綠色耳標(biāo)，5頭成年母豬記錄耳標(biāo)號，調(diào)查試驗豬群與場內(nèi)同期未參加試驗的其他仔豬同舍飼養(yǎng)，28日齡斷奶。備選試驗豬分組情況見表1。

1.2.2參試豬免疫及采樣檢測程序試驗組仔豬達(dá)35日齡時，進(jìn)行豬O型口蹄疫滅活疫苗初次免疫，1～6窩58頭仔豬按疫苗說明書，每頭仔豬頸部肌肉1 m L（1頭份），7～10窩40頭仔豬每頭頸部肌肉2 m L（2頭份），共免疫98頭；達(dá)65日齡時，按初次免疫方法再進(jìn)行1次加強免疫；5頭成年母豬每隔4個月免疫1次（4 m L/頭）并于產(chǎn)前45 d和15 d進(jìn)行2次PCV-2滅活疫苗免疫。所有參試仔豬分別于28日齡、56日齡和94日齡采血分離血清（1 m L/頭），5頭母豬進(jìn)行同期采血分離血清，送省動物疫病預(yù)防控制中心實驗室分別進(jìn)行PCV-2核酸檢測、PCV-2抗體檢測（間接ELISA）和豬O型口蹄疫抗體（液相阻斷ELISA）檢測。

1.2.3臨床觀測指標(biāo)試驗期間按該場常規(guī)要求實施生物安全及飼養(yǎng)管理措施，每日觀察豬群精神狀態(tài)、采食狀況是否正常，生長發(fā)育狀況是否良好，一旦發(fā)現(xiàn)臨床發(fā)病豬，及時隔離、采樣檢測。28日齡斷奶成活率及個體平均體重，1～3月齡期間發(fā)病及死亡數(shù)，3月齡時成活率及個體平均體重。

在以往的教學(xué)評價中，教學(xué)評價缺乏學(xué)生的參與，教師和教育主管部門通常是教學(xué)評價的主導(dǎo)，這樣的評價結(jié)果對于學(xué)生而言是被動的。學(xué)生很難激發(fā)出自主學(xué)習(xí)的主人翁意識，也無法主動反思和調(diào)控自己的學(xué)習(xí)策略，認(rèn)識自我。教師在評價中占主導(dǎo)地位就會導(dǎo)致學(xué)生不能深刻了解評價標(biāo)準(zhǔn)和學(xué)習(xí)進(jìn)程，無法發(fā)現(xiàn)和分析學(xué)習(xí)中的具體問題，無法自己探明下一步的努力方向。此外，教師很難做到對每個學(xué)生精準(zhǔn)地評價。

1.2.4實驗室檢測程序

1.2.4.1依據(jù)PCV-2熒光PCR試劑盒給出的檢測方法，分別對采集的豬血清樣品進(jìn)行熒光PCR檢測和結(jié)果判定。試驗成立條件：陽性對照Ct值≤28，陰性對照Ct值應(yīng)等于none。樣品的熒光PCR擴增的Ct值≤35，判定為核酸陽性，否則，均判為陰性。

1.2.4.2依據(jù)PCV-2 ELISA抗體檢測試劑盒給出的檢測方法，分別對采集的豬血清樣品進(jìn)行ELISA抗

體檢測和結(jié)果判定。試驗成立條件：陰性對照平均O D值≤0.15，陽性對照平均O D值≥0.60。計算該次試驗的臨界O D值=陽性對照平均O D值×0.25，樣品O D值≥臨界O D值時，樣品抗體判為陽性，否則，判為陰性。

表1 備選試驗豬分組明細(xì)表Table1The list of Pre-selection pigs for testing

1.2.4.3依據(jù)豬O型口蹄疫液相阻斷ELISA檢測試劑盒給出的檢測方法，分別對采集的豬血清樣品進(jìn)行檢測和結(jié)果判定。試驗成立條件：病毒抗原對照平均O D492nm值在1.0～2.0范圍內(nèi)，陽性對照血清抗體效價在1:1024±1滴度，陰性對照血清抗體效價＜1:4，試驗有效；臨界值=病毒抗原對照平均O D492nm值×50%；根據(jù)臨界值判定被檢樣品的抗體效價，抗體效價≥1:64，99%以上保護(hù)；效價≤1:4，不保護(hù)；效價在1:4～1:45之間，50%保護(hù)。

2 結(jié)果與分析

2.1臨床觀測結(jié)果

2.1.2斷奶重試驗豬斷奶時98頭稱重總重量為727 kg，平均個體重為7.42 kg，死亡率為6.67%。

2.1.3斷奶后至3月齡臨床指標(biāo)試驗豬達(dá)3月齡時，稱重總重量為4 021 kg，平均個體重為41.03 kg，臨床觀察有10頭豬疑似感染PCV-2，采集血清樣品進(jìn)行PCV-2核酸檢測，結(jié)果均為核酸陽性。主要臨床監(jiān)測項目及結(jié)果見表2。

表2 臨床觀察結(jié)果統(tǒng)計表Table2Statistical table of clinical observation results

2.2實驗室檢測結(jié)果

2.2.1試驗豬28日齡斷奶且進(jìn)行豬口蹄疫O型滅活疫苗免疫前檢測結(jié)果2個免疫劑量組PCV-2病毒核酸陽性檢出率分別為1.7%和2.5%，抗體陽性率分別為13.8%和12.5%，豬口蹄疫O型抗體效價≥1:64的比率均為100%；母豬的PCV-2病毒核酸陽性檢出率為0，抗體陽性率為100%；豬口蹄疫O型抗體效價≥1:64的比率均為100%。檢測結(jié)果統(tǒng)計詳見表3。

2.2.2試驗豬56日齡且進(jìn)行豬口蹄疫O型滅活疫苗初次免疫后21 d檢測結(jié)果2個免疫劑量組PCV-2病毒核酸陽性檢出率分別為12.1%和10%，抗體陽性率分別為96.6%和95%；豬口蹄疫O型抗體效價≥1:64的比率分別為69%和97.5%。檢測結(jié)果統(tǒng)計詳見表3。

2.2.3試驗豬94日齡且進(jìn)行豬口蹄疫O型滅活疫苗二次免疫后29 d檢測結(jié)果2個免疫劑量組PCV-2病毒核酸陽性檢出率均為100%，抗體陽性率均為100%；豬口蹄疫O型抗體效價≥1:64的比率分別為13.8%和25%。檢測結(jié)果統(tǒng)計詳見表3。

2.3結(jié)果分析

2.3.1從成年母豬的檢測結(jié)果來看，成年豬血液中均未檢出PCV-2病毒核酸，說明豬在未受到PCV-2自然感染攻擊條件下，檢測豬口蹄疫免疫效果保持較高水平，也說明口蹄疫疫苗在免疫原性上是可信的。

2.3.2從仔豬28日齡臨床觀察和采樣檢測結(jié)果來看，①臨床上表現(xiàn)為各種原因?qū)е碌乃劳雎蕿?.71%，在6頭發(fā)病仔豬中檢出1頭PCV-2陽性病例，但豬群生長發(fā)育總體上相對穩(wěn)定。②28日齡檢測發(fā)現(xiàn)，斷奶前PCV-2病毒核酸陽性檢出率分別為1.7%和2.5%，同時PCV-2初免前7d抗體（母源抗體）陽性率分別為13.8%和12.5%，說明此時大多數(shù)仔豬將喪失母源抗體的保護(hù)，仔豬群進(jìn)入PCV-2感染的風(fēng)險期。③檢測豬口蹄疫O型抗體效價≥1:64的比率二組均達(dá)到100%，說明被調(diào)查的仔豬群在生后4周時母源抗體水平仍維持在較高水平，也間接反映出該場母豬群的口蹄疫免疫水平很高。

2.3.3綜合成年母豬的檢測結(jié)果和仔豬首免后21 d檢測結(jié)果來看，二組仔豬PCV-2病毒核酸陽性檢出率分別為12.1%和10%，自然感染帶毒檢出率較低，在此時期檢測豬口蹄疫O型抗體效價≥1:64的比率二組分別為69%和97.5%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)卡方檢驗分析，差異極顯著（P＜0.01），結(jié)合5頭成年豬檢測結(jié)果，說明在PCV-2自然感染帶毒率較低時進(jìn)行豬口蹄疫滅活疫苗免疫，其免疫效果基本未受到影響。

表3 實驗室檢測結(jié)果統(tǒng)計表Table3Statistical table of Laboratory testing results

2.3.4綜合仔豬二免后29 d檢測結(jié)果來看，正常情況下進(jìn)行口蹄疫疫苗加強免疫后，免疫抗體合格率會較初免后明顯提高，然而本次試驗中仔豬94日齡檢測PCV-2帶毒率二組均為100%，同時臨床上出現(xiàn)疑似病例，此時檢測94日齡豬口蹄疫O型抗體效價≥1:64所占比率二組分別為13.8%和25%，效價在1: 4～1:45之間所占比率二組分別為86.2%和75%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)卡方檢驗，差異均不顯著（P＜0.05），說明二組豬口蹄疫免疫未達(dá)到預(yù)期效果，最大可能是受到PCV-2高自然感染率的影響。

3 討論

PCV-2是現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)倍受關(guān)注的免疫抑制性疫病。關(guān)于PCV-2感染后引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、呼吸道病綜合征等免疫抑制性綜合征的文獻(xiàn)報道頗多[1]。任靜柏等[2]報道證實引起此類綜合征的主要元兇是PCV-2與豬的其他疫病的混合或協(xié)同感染；王克才等[3]報道了豬圓環(huán)病毒2型存在病毒抗原與抗體在血液中可同時檢出現(xiàn)象；史利軍等[4]、司興奎等[5]報道感染PCV-2后對豬的體液免疫和細(xì)胞免疫均產(chǎn)生不同程度的抑制作用；高世杰等[6]、吳在玉等[7]、呂六新等[8]、孫寶權(quán)等[9]分別報道了口蹄疫母源抗體保護(hù)水平的臨界點為生后5～7周；王克才等[10]、于長泳等[11]分別報道了斷奶仔豬PCV-2自然感染條件下，進(jìn)行高致病性豬藍(lán)耳病和豬瘟免疫的效果，其中，進(jìn)行高致病性豬藍(lán)耳病活疫苗免疫后26 d時，抗體合格率未達(dá)到國家規(guī)定的70%標(biāo)準(zhǔn)，免疫后64 d時，抗體合格率明顯高于70%，進(jìn)行豬瘟活疫苗首次免疫后32 d和二次免疫后39 d的免疫抗體合格率分別為43.4%和38.4%，均未達(dá)到國家規(guī)定的免疫合格率標(biāo)準(zhǔn)。本試驗觀察在PCV-2自然感染條件下對仔豬進(jìn)行豬口蹄疫免疫，二次免疫即使增加免疫劑量，也不會明顯提高口蹄疫免疫抗體水平，這與上述文獻(xiàn)報道的關(guān)于PCV-2具有的免疫抑制作用報道的觀點相近或一致。

4 小結(jié)

綜合上述分析與討論結(jié)果，斷奶仔豬在PCV-2自然感染風(fēng)險條件下進(jìn)行豬口蹄疫免疫，其免疫效果會受到不同程度抑制或干擾。

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Investigation on immunity effective of Foot and Mouth disease under natural infection of Porcine circovirus type 2 virus

W ang Kecai1,W ang Fang2,W u Xi nhua3,Guo Zhi qi4, Zheng H ongl i ng1,Li Xi aonan1,W u Yunpu1
（1.Li aoni ng Provi nci al Center for Ani m al Di sease Control and Preventi on,Li aoni ngShenyang110164; 2.Li aoni ng H ui shan Dai ry H ol di ngs Co.,Ltd.,Li aoni ngShenyang110164; 3.Shuangta Di stri ct Center of ani m al heal th and producti on,Li aoni ngChaoyang122000; 4.Bai ta Di stri ct Center of ani m al heal th and producti on,Li aoni ngLi aoyang111000）

The 98 pi gl ets from ten l i tters under naturali nfecti ous ri sk condi ti on ofPorci ne ci rcovi rus type 2(PCV2)w ere random l y di vi ded i nto tw o groups,and then i nocul ated i nacti vated vacci ne agai nst sw i ne Foot and M outh di sease(FM D)type O by one dose and tw o doses,respecti vel y.Another fi ve adul t sow s w ere used as negati ve controlgroup.Al lPi gl ets i m m uni zed of the i nacti vated vacci ne agai nst sw i ne FM D type O i n 35,65 days,respecti vel y.Bl ood w as col l ected from al lof the pi gs at 3 ti m e poi nts:28 days before the fi rst vacci nati on,21 days after the fi rst vacci nati on and 29 days after the booster vacci nati on.The testes for detecti ng ELISA anti body of sw i ne FM D O type,vi ral nucl ei c aci d and anti body of PCV2 w ere perform ed.The resul t of the bl ood sam pl es of the adul t sow s for detecti ng vi ralnucl ei c aci d of PCV2 i s negati ve,the ELISA antibody of sw i ne FM D type O of them al labove 1:128.The di fferent posi ti ve rates of vi ralnucl ei caci d and anti body of PCV2 of the sam pl es col l ected fromone dose and tw o doses groups,the qual ifi cati on rate of ELISA anti body of sw i ne FM D type O at the 21 days after the fi rst vacci nati on i s 69%and 97.5%,how ever,the rate at 29 days after the booster vacci nati on i s 13.8%and 25%,respecti vel y.The Resul ts show ed thatthe i m m uni ty effecti ve ofthe i nacti vated vacci ne agai nst sw i ne FM D type O i n the w eaned pi gl ets m ay depressed by i n the i nfecti on of PCV2 i n natural i nfecti on.

Porci ne ci rcovi rus type 2 vi rus;Foot and m outh di sease of type O;Investi gati on; Im m uni ty;N atural i nfecti on

S858.28

B

1672-9692(2016)07-0040-06

2016-05-19

王克才（1965-），男，漢族，?？?，高級獸醫(yī)師，主要從事動物疫病防控等工作。