牛病毒性腹瀉病毒的分離與鑒定

畢瑩，倪宏波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319）

牛病毒性腹瀉病毒的分離與鑒定

畢瑩，倪宏波?

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319）

為了對(duì)牛病毒性腹瀉病毒進(jìn)行分離鑒定，本試驗(yàn)通過對(duì)黑龍江省完達(dá)山牛場(chǎng)疑似感染牛病毒性腹瀉病毒患牛的直腸糞便以及鼻拭子進(jìn)行無菌采集，樣品經(jīng)常規(guī)處理后接種于MDBK細(xì)胞，盲傳3次以及PCR擴(kuò)增鑒定，最后對(duì)收集到的病毒進(jìn)行蝕斑純化試驗(yàn)。結(jié)果表明，病毒MDBK細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，PCR鑒定與預(yù)期結(jié)果相符，3次蝕斑純化后分離到該病毒。結(jié)論可成功分離到牛病毒性腹瀉病毒。

牛病毒性腹瀉病毒；MDBK；鑒定；蝕斑純化

牛病毒性腹瀉病（Bovi ne vi raldi arrhea，BVD）是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovi ne vi raldi arrhea vi rus，BVDV）引起的傳染病，各種年齡的牛都易感染，以犢牛易感性最高。BVDV是黃病毒科瘟病毒屬成員[1]，單股RN A、有囊膜的病毒?；蚪M全長12.5 kb，其開放閱讀框共編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白和8種非結(jié)構(gòu)蛋白[2-3]。BVDV根據(jù)基因組5'-UTR序列，分為BVDV-1和BVDV-2型，其中BVDV-1有很多亞型，目前已分出18種亞型1a-1t，BVDV-2分為4個(gè)亞型2a～2d[4]。其中BVDV-1型呈全球性廣泛分布，BVDV-2型僅有部分國家流行[5]。國外最早是在1946年發(fā)現(xiàn)BVDV，而我國在1980年成功分離并鑒定BVDV，并在我國20多個(gè)省市都報(bào)道了該病[6]。根據(jù)是否發(fā)生細(xì)胞病變，可分為兩種生物型，即致細(xì)胞病變型（cytopathogeni c，CP）和非致細(xì)胞病變型（noncytopathogeni c，N CP）。BVDV的流行給國內(nèi)外養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展帶來很大損失，BVDV可引起呼吸綜合征、先天性缺陷、免疫抑制、繁殖障礙、腸炎、母畜流產(chǎn)等癥狀[7]。本試驗(yàn)通過采集臨床疑似牛病料，處理后接種于M DBK細(xì)胞進(jìn)行盲傳，提取病毒RN A，通過PCR擴(kuò)增鑒定為BVDV1b型，并采用蝕斑純化分離病毒。

1 材料與方法

1.1引物設(shè)計(jì)采用O l i go7軟件在5’UTR保守區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)引物，由哈爾濱博仕生物有限公司合成。引物序列如下：上游引物：5’-ATGCCCTATAGTAGGACTAGCA-3’；下游引物：5’-TCAACTCCATGTGCCATGTAC-3’。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與病毒的分離鑒定將M DBK細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗3次，0.25%濃度胰酶消化，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中消化3～5 m i n，棄掉胰酶，加入培養(yǎng)液（5%血清，1%雙抗DM EM），反復(fù)吹吸細(xì)胞，使細(xì)胞分散，鏡下觀察，置于37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

將采集的3頭牛的糞便以及鼻拭子進(jìn)行處理，糞便用PBS緩沖液3倍稀釋，12 000 r/m i n離心，鼻拭子經(jīng)適量PBS稀釋，參照病毒RN A提取試劑盒（Q IAGEN）說明書提取RN A，按照M-M u LV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDN A，以cDN A為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系如下：PCR M aster M i x：12.5 μL；上游引物、下游引物（BVDV鑒定引物）各1 μL；cDN A：3 μL；加去離子水補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 m i n，94℃變性30 s，退火30 s（根據(jù)引物不同設(shè)置不同退火溫度），72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃終延伸10 m i n。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

經(jīng)鑒定BVDV陽性的病料，0.22 μm濾膜過濾后取1 m L接種于M DBK細(xì)胞中，并設(shè)立對(duì)照組，待孵育1 h后，病毒與細(xì)胞充分接觸，添加6～7 m L營養(yǎng)液。置37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7 d，逐日觀察細(xì)胞病變，若7 d仍不出現(xiàn)細(xì)胞病變，則回收培養(yǎng)物凍融2次，離心后取上清液接種于新的單層細(xì)胞，盲傳3代后，觀察細(xì)胞病變。出現(xiàn)病變者凍融3次后離心收取上清液，保存于-70℃冰箱待鑒定。如果未出現(xiàn)病變，則繼續(xù)盲傳，如還未出現(xiàn)病變，則反復(fù)凍融提取病毒RN A。試驗(yàn)同時(shí)做BVDV陽性和陰性對(duì)照。

提取收集病毒液的RN A，方法參照病毒RN A提取試劑盒（Q IAGEN）說明書。按照M-M u LV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDN A，如上述PCR體系進(jìn)行鑒定。

1.2.2病毒的蝕斑純化M DBK鋪于6孔板內(nèi)，將收獲的病毒用不含血清的DM EM維持液做10-1～10-6梯度稀釋后，接種于6孔板中培養(yǎng)的密度為80%的M DBK細(xì)胞上，37℃孵育1～2 h，使病毒充分吸附。將提前滅菌煮沸的低熔點(diǎn)瓊脂糖和2×M EM以1:1（v/v）混合后加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，使?fàn)I養(yǎng)瓊脂糖覆蓋在細(xì)胞表面。待凝固后倒置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待出現(xiàn)病變后，利用中性紅染色。挑取單個(gè)的蝕斑置于無血清的DM EM培養(yǎng)液中，反復(fù)凍融3～5次，再用于接種M DBK細(xì)胞，進(jìn)行下一輪的蝕斑純化，如此反復(fù)操作3代后得到純化的病毒。

2 結(jié)果與分析

2.1病毒的分離與鑒定3份樣品中其中有一份為BVDV陽性，將糞便以及鼻拭子分別接種M DBK細(xì)胞，經(jīng)過3次盲傳后，接種糞便的M DBK細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，在288 bp處有明顯條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1接種病料后MDBK細(xì)胞病變情況Fig.1Inoculation of MDCK cells

2.2病毒的蝕斑純化病毒接種細(xì)胞后，約4～5 d，顯微鏡下能看到細(xì)胞出現(xiàn)病變，中性紅染色后可見透明呈圓形的蝕斑，大小不完全相同，但邊緣清晰。細(xì)胞病變特征為細(xì)胞死亡、變圓、聚集成堆、脫落、脫落的細(xì)胞變圓，漂浮在維持液中，并逐漸縮小，活細(xì)胞在瓶壁上成拉網(wǎng)狀；隨著傳代次數(shù)的增加，出現(xiàn)病變的時(shí)間縮短。而未接毒的細(xì)胞鏡下未見變化，中性紅染色后也不出現(xiàn)蝕斑。

3 討論和結(jié)論

本試驗(yàn)采集黑龍江省某牛場(chǎng)疑似感染BVDV患畜的糞便以及鼻拭子，進(jìn)行樣品處理，接種細(xì)胞培養(yǎng)，盲傳3代后接種糞便的M DBK細(xì)胞出現(xiàn)CPE，收毒并提取RN A，進(jìn)行PCR鑒定，最后通過蝕斑純化分離病毒。本試驗(yàn)分離到的病毒出現(xiàn)典型CPE，因此分離到的病毒為CP型。

病毒的分離過程中細(xì)胞的培養(yǎng)是非常重要的環(huán)節(jié)，在細(xì)胞培養(yǎng)中，對(duì)血清的選擇是尤其關(guān)鍵的，因?yàn)锽VDV可以通過胎盤屏障傳給胎牛，這可能造成在胎牛血清中含有BVDV抗體，市場(chǎng)上經(jīng)過處理的血清也有可能含有BVDV殘留，聶兆晶等[8]在細(xì)胞培養(yǎng)中選用的是馬血清，可以避免牛血清中BVDV抗體的干擾。而本試驗(yàn)在細(xì)胞培養(yǎng)過程中選取的血清為gi bco胎牛血清，并且從PCR結(jié)果中陰性對(duì)照中也說明此血清中無BVDV殘留。

蝕斑純化病毒時(shí)，將病毒進(jìn)行不同梯度的稀釋接種于M DBK細(xì)胞上，病毒在細(xì)胞上增殖，對(duì)病毒濃度的控制是試驗(yàn)的關(guān)鍵，一個(gè)孔中的蝕斑數(shù)目最好不超過10個(gè)，挑取蝕斑細(xì)胞，將其繼續(xù)接毒傳代3次以上得到純化病毒。本試驗(yàn)成功分離到BVDV病毒，這為后續(xù)病毒基因結(jié)構(gòu)的研究奠定基礎(chǔ)。

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Isolation and identification of Bovine viral diarrhea virus

Bi Yi ng,N i H ongbo*
(H ei l ongj i ang Bayi Agri cul tural Uni versi ty,H ei l ongj i angDaqi ng163319)

W i th suspected bovi ne vi ral di arrhea vi rus di sease m ateri al separati on and i denti fi cati on.In thi s study,cow s of H ei l ongj i ang Provi nce W anda cattl e i nfected w i th bovi ne vi raldi arrhea vi rus w ere di seased acqui si ti on.Speci m ens col l ected w ere i nocul ated by M DBK cel l s and reproduced bl i ndl y 3 generati ons.The vi ralRN A w as am pl i fi ed by PCR i denti fi cati on.Fi nal l y,the coll ected vi rus by pl aque puri fi cati on experi m ents puri fi ed vi rus.Resul t:The vi rus i nocul ati on obvi ous l esi ons on M DBK cel l.PCR am pl i fi ed the expected am pl i fi cati on segm ent.The vi rus w as i sol ated by 3 ti m es pl aque puri fi ed.Concl usi on:Successful l y i sol ated the bovi ne vi raldi arrhea virus.

Bovi ne vi ral di arrhea vi rus;M DBK;Identi fi cati on;The pl aque puri fi cati on

S852.659.6

B

1672-9692(2016)07-0014-03

2016-05-25

畢瑩（1993-），女，在讀碩士，主要從事分子細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)研究。

倪宏波（1972-），教授，博士生導(dǎo)師，主要從事分子細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)研究。