多殺性巴氏桿菌和豬圓環(huán)病毒混合感染的診斷

馬莉莉，王宇婷，趙微，翟軍軍，倪宏波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

多殺性巴氏桿菌和豬圓環(huán)病毒混合感染的診斷

馬莉莉，王宇婷，趙微，翟軍軍，倪宏波?

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

大慶市某豬場發(fā)生以高熱稽留、呼吸困難以及食欲廢絕等為臨床癥狀，部分仔豬甚至死亡的疫情。無菌采集病料，提取病變組織DNA或RNA進(jìn)行豬瘟病毒、圓環(huán)病毒的PCR或RT-PCR檢測，同時進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)等試驗。PCR擴(kuò)增出700 bp的豬圓環(huán)病毒特異性條帶。診斷為多殺性巴氏桿菌和豬圓環(huán)病毒混合感染。

圓環(huán)病毒；巴氏桿菌；混合感染；診斷

豬圓環(huán)病毒病（Porci neci rcovi rus di sease）是由豬圓環(huán)病毒2型（Porci neci rcovi rus 2，PCV2）導(dǎo)致的患病豬全身性淋巴結(jié)腫大為特征的多系統(tǒng)器官功能衰竭的一類疾病的統(tǒng)稱[1]。臨床上的主要表現(xiàn)為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PM W S）、豬呼吸疾病綜合征（PRDC）、新生仔豬先天震顫（CT）[2]。不同年齡的豬都可感染豬圓環(huán)病毒，病豬可通過鼻液、糞便等排泄物排出病毒，經(jīng)口腔和呼吸道途徑可傳染給健康的豬[3]。豬巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的一種傳染性疾病，又名豬肺疫，急性病例呈現(xiàn)出血性敗血癥，咽喉部急性腫脹，高度呼吸困難[4]。長途運(yùn)輸或頻繁遷移、過度疲勞、飼料突變、營養(yǎng)缺乏等也常常誘發(fā)此病。2016年4月，黑龍江大慶某豬場發(fā)生以生長緩慢、體溫升高、呼吸困難等為主要特征的傳染病，該豬場養(yǎng)仔豬80頭，發(fā)病率20%，死亡率6%，于發(fā)病后2 d送診，實驗室剖檢后無菌采集病死豬肝臟、肺臟、腎臟和淋巴結(jié)等病料，進(jìn)行病原學(xué)檢測。

1 材料與方法

1.1病料的采集無菌采集病死豬的肝臟、肺臟、脾臟、腎臟和淋巴結(jié)等病料，供實驗室診斷用。

1.2試劑M arker DL 2000購自大連寶生物工程有限公司；PCR M aster M i x緩沖液、TIAN am p Genomi c DN A Ki t和RN easy Pl us M i niH andbook RN A購自北京博凌科為生物科技有限公司；RevertAi d Fi rst Strand cDN A Synthesi s Ki t購自賽默飛世爾科技中國有限公司。藥敏紙片包括多粘菌素B、慶大霉素、硫酸頭孢喹肟和鹽酸頭孢噻呋混懸液等購于浙江海正藥業(yè)股份有限公司。

1.3引物設(shè)計根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬瘟病毒、圓環(huán)病毒、多殺性巴氏桿菌和鏈球菌的基因序列設(shè)計特異引物，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。詳見表1。

1.4細(xì)菌分離培養(yǎng)無菌操作采集肝臟和肺臟等病料，接種5%兔血脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)和溶血等情況。挑取疑似菌的單個菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，劃線于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫箱中需氧培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)等。

1.5核酸的提取及鑒定

1.5.1組織DNA和RNA提取按照TIAN am p Genom i c DN A Ki t操作進(jìn)行提取DN A；按照RN easy Pl us M i niH andbook RN A提取盒進(jìn)行提取RN A，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列Table1Primer sequences

1.5.2RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增按RevertAi d Fi rst Strand cDN A Synthesi s Ki t反轉(zhuǎn)錄盒說明書操作步驟將病毒提取的RN A進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDN A在-20℃進(jìn)行保存?zhèn)溆?。用得到的DN A和cDN A為模板，豬瘟病毒、高致病性藍(lán)耳病毒、圓環(huán)病毒、多殺性巴氏桿菌、鏈球菌等特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，取5 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6藥敏試驗將鑒定為多殺性巴氏桿菌的純培養(yǎng)物用接種棒均勻涂布在鮮血培養(yǎng)基上，將藥敏紙片（慶大霉素、卡那霉素、恩諾沙星等10種藥物）分別貼于平皿中，37℃培養(yǎng)24 h，測定抑制菌圈直徑大小，根據(jù)檢測標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1剖檢變化病理變化表現(xiàn)為全身黏膜、漿膜出血，腸管充血，淋巴結(jié)水腫；氣管內(nèi)有泡沫狀樣黏液；肺臟有不同程度的肝變區(qū)，間質(zhì)增寬，整個肺呈纖維素性變化，切面呈大理石樣紋理，淤血呈紫紅色；心肌變性，質(zhì)地松軟，心包液增多，見圖1和圖2。

2.2革蘭氏染色將病料中所分離的細(xì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)，然后對其進(jìn)行革蘭氏染色、涂片、鏡檢?？梢姷礁锾m氏染色陰性桿菌，染色可見兩極濃染的球桿菌，疑似多殺性巴氏桿菌，見圖3。

圖1 氣管內(nèi)有泡沫狀黏液Fig.1The trachea with foamy mucus

圖2 肺臟淤血水腫Fig.2Congestion edema of the lungs

圖3 兩極濃染球桿菌（10×10）Fig.3Two levels of dyeing ball coli（10×10）

2.3PPCCRR結(jié)果PCR或RT-PCR檢測結(jié)果表明，第4孔在700 bp左右有一條清晰的條帶，與圓環(huán)病毒預(yù)期片段大小相符；第6孔在450 bp左右有一條清晰的條帶，與巴氏桿菌預(yù)期片段大小相符，見圖4。

2.4藥敏試驗結(jié)果該病原菌對硫酸頭孢喹肟和鹽酸頭孢噻呋高度敏感,對卡那霉素、恩諾沙星、阿米卡星和多粘菌素B敏感，對青霉素、慶大霉素、克拉霉素和阿奇霉素耐藥，詳見表2。

圖4 PCR電泳分析圖Fig.4PCR electrophoresis analysis chart

表2 藥敏結(jié)果Table2The results of drug susceptibility

3 討論

3.1豬圓環(huán)病毒經(jīng)常呈現(xiàn)隱性感染，要定期進(jìn)行檢測，并且淘汰病豬，避免混合感染導(dǎo)致其他的疾病[5]。治療多殺性巴氏桿菌要根據(jù)要藥敏結(jié)果進(jìn)行致病菌特性，合理使用抗生素且不可隨意用藥。

3.2飼養(yǎng)管理應(yīng)加強(qiáng)，周圍環(huán)境衛(wèi)生要處理好，增強(qiáng)家畜的抵抗力非常關(guān)鍵[6]。發(fā)現(xiàn)病豬最好隔離，創(chuàng)造舒適環(huán)境，有利于疾病的康復(fù)。建立規(guī)?；B(yǎng)豬場防疫管理等制度，實行全進(jìn)全出，定期對豬群進(jìn)行監(jiān)測，圈舍和用進(jìn)行消毒，病死豬進(jìn)行深埋處理，豬舍凈化[7]。保育豬轉(zhuǎn)舍，育肥豬出欄后，要最少空舍2周，2周內(nèi)至少要消毒2次以及體外凈化等[8]。

3.3用商品化疫苗對母豬進(jìn)行免疫[9]，做好各種疾病的預(yù)防接種，免疫母豬使得仔豬能從初乳中獲得母源的抗體保護(hù)，能夠在5周內(nèi)有效避免PCV2的感染[10]。更應(yīng)該注意飼養(yǎng)的密度，減少不良因素的應(yīng)激，可減少疾病的發(fā)生。

3.4本次該豬場發(fā)病在臨床診斷的基礎(chǔ)上，采用病原的分離鑒定和PCR鑒定，診斷為多殺性巴氏桿菌和豬圓環(huán)病毒混合感染，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果推薦使用硫酸頭孢喹肟進(jìn)行治療。

[1]郎洪武，王力，張廣川，等.豬圓環(huán)病毒病及生物制品學(xué)的研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2012，42（5）：545-550.

[2]宋長緒，梁鵬帥.豬圓環(huán)病毒研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（9）：34-37.

[3]Stevenson GM,Ki upel M,M i ttal SK.Ti ssue di stri buti onandgeneti ctypi ngofporci ne ci rcovi rusi n pi gsw i th natural l yoccurri ng congeni taltrem ors[J].VetDi agnInvest, 2001,13(1):57-62.

[4]甘孟候，楊漢春.中國豬病學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：177-182.

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[10]張文奎.豬肺疫的診斷與防制[J].山東畜牧獸醫(yī)，2013（3）：21-22.

Diagnosis of the combined infection with Circovirus and Pasteurella of swine

M a Li l i,W ang Yuti ng,Zhao W ei,Zhai J unj un,N i H ongbo*
(Col l ege of ani m al sci ence and technol ogy,H ei l ongj i ang Bayi Agri cul tural Uni versi ty,H ei l ongj i angDaqi ng 163319)

A pi g farmw i th fever,di ffi cul ty breathi ng and l oss of appeti te as the cl i ni cal sym ptom s i n the ci ty ofDaqi ng,som e pi gs even death.Col l ected asepti cal l y di seased ti ssue extract DN A or RN A for PCR or RT-PCR detecti ng ci rcovi rus and sw i ne fever vi rus,w hi l e for bacteri al i sol ati on tests.PCR am pl i fi ed 700 bp porci ne ci rcovi rus speci fi c bands.By l aboratory di agnosi s a pi g farmpi gs di ed,the eti ol ogy of the di sease i s di agnosed w i th Pasteurel l a and Ci rcovi rus combi ned i nfecti on.

Ci rcovi rus;Pasteurel l a;Com bi ned i nfecti on;Di agnosi s

S858.28

B

1672-9692(2016)07-0036-04

2016-05-18

馬莉莉（1992-），女，黑龍江人，在讀碩士，研究方向為分子細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)。

倪宏波（1972-），男，黑龍江人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事分子細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)研究。

博士科研啟動基金（編號：LBH-Q 14134）。