• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)提取方法的篩選

    2016-11-28 15:56:44唐世明曹君邁陳彥云馬玉龍
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年9期
    關(guān)鍵詞:提取方法部位品種

    唐世明+曹君邁+陳彥云+馬玉龍

    摘要:以青薯168、克新1號的芽眼部、側(cè)部及髓部為試驗(yàn)材料,分別采用丙酮提取法、三氯乙酸(TCA)提取法、鹽提取法、醇提取法、酚提取法提取,并用分光光度法對不同部位的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定。采用2因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),研究品種、提取方法、取樣部位以及不同因素組合對蛋白質(zhì)含量的影響。結(jié)果表明:不同品種的蛋白質(zhì)含量不同,青薯168顯著高于克新1號(P<0.05),達(dá)128.0 mg/L;不同提取方法之間蛋白含量不同,丙酮提取法、鹽提取法和TCA提取法的蛋白含量間無顯著差異,但顯著高于酚提取法、醇提取法(P<0.05),前3種提取方法的蛋白質(zhì)含量為153.3~159.7 mg/L;馬鈴薯塊莖芽眼部的蛋白質(zhì)含量顯著高于側(cè)部及髓部(P<0.05),達(dá)140.7 mg/L;品種、提取方法、取樣部位不同組合間差異顯著(P<0.05)。綜合比較可知,適合青薯168芽眼部的提取方法為鹽提取法,適合克新1號芽眼部的提取方法為TCA提取法。

    關(guān)鍵詞:馬鈴薯塊莖;品種;提取方法;部位;蛋白質(zhì)含量

    中圖分類號: TS201.2+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號:1002-1302(2016)09-0326-03

    馬鈴薯是多年生草本,可作一年生或一年兩季栽培作物,既可糧菜兼用,又可制成生物燃料及飼料,還具有和胃、調(diào)中、健脾、益氣的作用,對胃潰瘍、習(xí)慣性便秘、膠原病、熱咳及皮膚濕疹也有治療功效。同時,馬鈴薯也是一種營養(yǎng)保健食品。馬鈴薯資源非常豐富,而且己有報(bào)道表明,馬鈴薯蛋白粉的營養(yǎng)價值明顯優(yōu)于豆粕[1],是優(yōu)質(zhì)的天然氮源,具有廣闊的發(fā)展前景[2]。馬鈴薯蛋白能很好地被人體所吸收,屬于完全蛋白質(zhì)[3-4],其蛋白效價可以與雞蛋、酪蛋白相媲美,營養(yǎng)價值優(yōu)于從谷物或豆類中提取的蛋白質(zhì)[5]。馬鈴薯蛋白最接近動物蛋白,是很好的保健食品[6-7],其蛋白質(zhì)的凈消化利用率也很高[8],馬鈴薯的蛋白可利用價值為71%,比谷物高21%。馬鈴薯中的必需氨基酸含量高于大多數(shù)糧食作物,富含賴氨酸、色氨酸,是一般糧食所不能比的。與大米和面粉相比,馬鈴薯具有更多的優(yōu)點(diǎn),可以堪稱“十全十美的食物”[9]。近年來,馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)組學(xué)的研究有助于我們了解塊莖生長和發(fā)育機(jī)理,也有助于馬鈴薯塊莖產(chǎn)量及品質(zhì)等性狀的提高[10]。因此,開展馬鈴薯蛋白質(zhì)提取方法的研究對開展其他研究工作具有重要意義。

    國內(nèi)外關(guān)于馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)提取方法的報(bào)道較少,李萌萌等開展了馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)提取方法的研究[11-12]。而由于馬鈴薯不同品種的蛋白質(zhì)含量存在很大差異,且受到環(huán)境溫度、薯塊成熟度及薯塊上不同部位的影響,其結(jié)果也不同,不同的材料需要采用適合其特性的部位進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取[11]。針對這些問題,本試驗(yàn)選用不同品種馬鈴薯的不同部位進(jìn)行不同提取方法的篩選,以期為馬鈴薯蛋白質(zhì)提取及其進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    本試驗(yàn)所用馬鈴薯品種為克新1號(Kexin 1)、青薯168(Qingshu168),由寧夏固原天啟薯業(yè)有限公司提供。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)1采用2因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì),因素1為品種(V),V1為克新1號(Kexin 1)、V2為青薯168(Qingshu 168);因素2為提取方法(T),分5個水平,T1為丙酮提取法,T2為鹽提取法,T3為三氯乙酸(TCA)提取法,T4為酚提取法,T5為醇提取法。試驗(yàn)重復(fù)3次,共10個處理。

    試驗(yàn)2采用2因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì),因素1為提取方法(T),分5個水平:T1~T5;因素2為取樣部位(P),分為3種處理:P1為芽眼部,P2為側(cè)部,P3為髓部。試驗(yàn)重復(fù)3次,共15個處理。

    試驗(yàn)3采用2因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),因素1為品種(V),含V1、V2;因素2為取樣部位(P),分為3種處理:P1、P2、P3。試驗(yàn)重復(fù)3次,共6個處理。

    1.2.2 馬鈴薯蛋白質(zhì)的提取部位 芽眼部:芽眼在塊莖上呈螺旋狀排列,頂端密,基部稀,提取時繞芽眼周邊約0.7 cm、深度約0.6 cm提取。側(cè)部:即維管束環(huán),從皮層往內(nèi)0.6 cm左右的厚度。髓部:塊莖中央部位,在塊莖的橫切面上,可以明顯地看出塊莖中央為髓部,外面圍繞著開放維管束環(huán)。

    1.2.3 馬鈴薯蛋白質(zhì)的提取方法 TCA提取法、丙酮提取法采用王改萍等的方法[13]。酚提取法、鹽提取法及醇提取法分別采用Hurkman等報(bào)道的方法[14-16]。

    1.2.4 樣品中蛋白質(zhì)含量的測定 蛋白質(zhì)含量的測定采用郭藹光等介紹的方法[17]進(jìn)行。用牛血清蛋白(BSA)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定595 nm處的吸光度。用繪圖軟件,以蛋白濃度為縱坐標(biāo)(y)、D595 nm為橫坐標(biāo)(x)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,詳見圖1。

    1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Excel 2003處理后,用SPSS 17.0軟件進(jìn)行2因素方差分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 品種對馬鈴薯蛋白質(zhì)含量的影響

    由表1可知,不同品種之間蛋白質(zhì)含量不同,青薯168顯著高于克新1號。

    2.2 提取方法對馬鈴薯蛋白質(zhì)含量的影響

    由表2可知,不同提取方法對蛋白質(zhì)含量均有影響,TCA法、丙酮提取法、鹽提取法之間無顯著差異,但顯著高于酚提取法和醇提取法,后二者之間無顯著差異。

    2.3 不同部位對馬鈴薯蛋白質(zhì)含量的影響

    由表3可知,不同取樣部位對蛋白質(zhì)含量均有影響。芽眼部位蛋白質(zhì)含量顯著高于髓部和側(cè)部,但后二者之間無顯著差異。

    2.4 品種和提取方法對馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)含量的影響

    由表4可知,克新1號品種以TCA提取法為佳,青薯168品種以鹽提取法為佳,均以丙酮提取法次之。酚提取法、醇提取法提取的蛋白質(zhì)含量最低。

    2.5 提取方法和取樣部位對馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)含量的影響

    由表5可知,適合芽眼的提取方法有TCA提取法、鹽提取法,其次為丙酮提取法;適合側(cè)部的提取方法有鹽提取法、丙酮提取法,其次為TCA提取法;適合髓部的提取方法有丙酮提取法,其次為TCA提取法和鹽提取法;適合3個部位提取的最差方法為酚提取法、醇提取法。

    2.6 品種和取樣部位對馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)含量的影響

    由表6可見,不同馬鈴薯取樣部位、不同品種的蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)出一定的規(guī)律。馬鈴薯塊莖不同部位、品種間的蛋白質(zhì)含量差異基本達(dá)顯著水平。青薯168、克新1號均以芽眼部位含量最高,髓部最低。因此,這2個品種取樣的最佳部位均為芽眼。

    3 討論

    本試驗(yàn)以青薯168、克新1號的芽眼部、側(cè)部及髓部為試驗(yàn)材料,分別采用丙酮提取法、TCA提取法、鹽提取法、醇提取法、酚提取法提取蛋白質(zhì)。結(jié)果表明,不同品種之間蛋白質(zhì)含量不同,青薯168顯著高于克新1號;不同提取方法之間蛋白含量不同,丙酮提取法、鹽提取法與TCA法提取的蛋白含量無顯著差異,但顯著高于酚提取法、醇提取法,而后二者無顯著差異;不同取樣部位對蛋白質(zhì)含量均有影響,芽眼部位蛋白質(zhì)含量顯著高于髓部、側(cè)部,但后二者之間無顯著差異;克新1號品種以TCA提取法為佳,青薯168品種以鹽提取法為佳,均以丙酮提取法次之,酚提取法、醇提取法提取的蛋白質(zhì)含量最低??梢姡m合芽眼的提取方法有TCA提取法、鹽提取法,其次為丙酮提取法;適合側(cè)部的提取方法有鹽提取法、

    丙酮提取法,其次為TCA提取法;適合髓部的提取方法有丙酮提取法,其次為鹽提取法和TCA提取法。綜合試驗(yàn)的可操作性,建議馬鈴薯蛋白質(zhì)采用丙酮提取法。

    李萌萌等使用5種方法從馬鈴薯中薯9號塊莖中提取蛋白質(zhì),并用Bradford法測定其中蛋白質(zhì)的含量,結(jié)果顯示:磷酸緩沖液提取法的粗蛋白含量最高,為105.3 mg/L,其次是直接提取方法,為72.3 mg/L,提取蛋白質(zhì)最少的是酚提取法,為10.3 mg/L;蛋白質(zhì)純度最好的提取方法是TCA法,純度可達(dá)10.92%;其次是直接提取法,為7.66%;酚提取法最低,僅為1.32%[11]。以上結(jié)果綜合表明,直接提取法效果最好。范吉星等以紅海欖根為材料,比較丙酮沉淀法、TCA法、酚法等幾種方法,認(rèn)為上述方法均不甚理想,蛋白提取的純度較低,也無法呈現(xiàn)清晰的條帶,而經(jīng)過改良的酚法則得到了很好的效果[18]。谷瑞升等以木本植物為材料,比較丙酮沉降法、TCA法和直接提取法等方法,認(rèn)為丙酮沉降法最優(yōu),建議馬鈴薯蛋白質(zhì)提取采用丙酮提取法[19]。

    在本試驗(yàn)中,醇提取法、酚提取法效果均較差,蛋白質(zhì)損失量較高。而應(yīng)用丙酮提取法、鹽提取法、TCA提取法所得結(jié)果均比醇、酚提取法好,表明對于馬鈴薯塊莖來說,丙酮提取法、鹽提取法、TCA提取法可能是較適合的方法。但這些方法的不足之處是蛋白液中含有相對較多的雜質(zhì),有可能對進(jìn)一步的深入研究帶來干擾。因此需要進(jìn)一步探索更適合、更簡便、更高效尤其是純度更高的馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)的分離純化方法,為利用和深入研究馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)提供依據(jù)。

    有研究表明,料液比為1 g ∶10 mL、浸泡溫度為35 ℃、pH值為9.8、浸泡時間為1h時,鹽提取法提取馬鈴薯蛋白質(zhì)的得率最大,達(dá)0.80 g/100 g[15]。本試驗(yàn)的鹽提取法的條件大致相同,最終提取到的蛋白質(zhì)含量為159.67 mg/L。

    TCA沉淀法、丙酮沉淀提取法是進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析中最常見的提取方法,這2種方法雖然操作步驟少、耗時短、提取過程中損失較少、簡便易行,具有廣泛的適用性,在微生物材料以及動植物組織中具有很好的分離效果。但是沉淀所得提取物里含有大量的蛋白質(zhì)粗提物和雜質(zhì),還需要除去雜質(zhì)并且需要強(qiáng)力的裂解緩沖液及機(jī)械輔助,才能提取到較純的蛋白質(zhì)。醇提取法在加2-氯乙醇提取之前通過加入氯化鈉除去鹽溶性蛋白,所以總體提取的蛋白含量很少,但是馬鈴薯醇提取蛋白僅適用于電泳分析技術(shù)。

    酚提取法雖然提取的蛋白質(zhì)含量低,但卻是一種非常適合植物材料尤其是難提取材料的蛋白質(zhì)提取方法。植物細(xì)胞由于細(xì)胞壁和眾多胞內(nèi)次生代謝物質(zhì)的存在,給蛋白質(zhì)提取、純化帶來了很大的難度。酚提法與TCA提取法、丙酮提取法的直接沉淀相比,避免了大量組織殘?jiān)?、水溶性雜質(zhì)的污染,也能除去鹽離子。在樣品制備過程中,核酸、鹽、酚、色素和多糖等可溶性物質(zhì)進(jìn)入水相,蛋白質(zhì)和脂類則進(jìn)入酚相,從而得到了分離。酚層中的蛋白質(zhì)可通過沉淀進(jìn)一步純化并除去鹽。該方法所得雜質(zhì)較少,很適合用于進(jìn)行電泳試驗(yàn)。TCA沉淀法雖然能夠很好地去除蛋白樣品中的鹽離子,但是對色素、多糖等雜質(zhì)的去除效果并不是很明顯,而且蛋白質(zhì)經(jīng)過多次沉淀后溶解是比較困難的,這樣會有很多蛋白質(zhì)損失。首先在樣品中加入聚乙烯吡咯烷酮吸附劑,這樣可以減少植物中的酚類、醌類和色素等次生代謝物質(zhì)的干擾;其次,酚可以有效去除樣品中的可溶性雜質(zhì),也能除去鹽離子[20]。另外,由于酚的脂溶性,酚提取法非常有利于膜蛋白的提取,而膜蛋白往往與植物的耐鹽性密切相關(guān)[21]。因此,酚改良法是一種有效提取紅海欖根部蛋白的方法。

    鹽提取法提取的蛋白質(zhì)含量雖高,但是相對于別的方法鹽提取法操作復(fù)雜,需要控制好pH值、溫度、料液比和提取時間等因素,同時透析袋的使用也不方便。當(dāng)樣品溶液中的鹽離子濃度超過100 mmol/L時,樣品的電內(nèi)滲比較高[22],而且等電聚焦電壓也上不去,這會嚴(yán)重影響等電聚焦的進(jìn)行,因此可以認(rèn)為,鹽是雙向電泳最常見的一種雜質(zhì)。

    4 結(jié)論

    由本研究可以得出以下結(jié)論。(1)不同品種之間蛋白質(zhì)含量不同,青薯168顯著高于克新1號。(2)不同提取方法之間蛋白含量不同,丙酮提取法、鹽提取法和TCA法提取的蛋白含量無顯著差異,但顯著高于酚提取法、醇提取法,而后二者無顯著差異。(3)不同取樣部位對蛋白質(zhì)含量均有影響。芽眼部位蛋白質(zhì)含量顯著高于髓部和側(cè)部,但后二者之間無顯著差異。(4)2個品種有利于蛋白提取的組合,V1品種以V1T3為佳,V2品種以V1T2為佳。2個品種均為丙酮提取法較佳,最差為酚提取法、醇提取法,因此淘汰后2種方法。(5)適合芽眼的提取方法有TCA提取法、鹽提取法,其次為丙酮提取法;適合側(cè)部的提取方法有TCA提取法、丙酮提取法,其次為鹽提取法;適合髓部的提取方法有鹽提取法,其次為丙酮提取法、TCA提取法;3個部位最差為酚提取法、醇提取法,故淘汰后2種方法。(6)為了試驗(yàn)操作方便,建議馬鈴薯蛋白質(zhì)提取采用丙酮提取法。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Aluko R E,Yada R Y. Some physicochemical and functional properties of cowpea (Vigna unguiculata) isoelectric protein isolate as a function of pH and salt concentration[J]. International Journal of Food Sciences and Nutrition,1997,48(1):31-39.

    [2]李玉珍,肖懷秋,蘭立新. 大豆分離蛋白功能特性及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 中國食品添加劑,2008(1):121-124.

    [3]鞏慧玲,趙 萍,楊俊峰. 馬鈴薯塊莖貯藏期間蛋白質(zhì)和維生素C含量的變化[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2004,13(1):45-51.

    [4]謝慶華,吳毅歆. 馬鈴薯品種營養(yǎng)成分分析測定[J]. 云南師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2002,22(2):50-52.

    [5]Kaldy,M.S.Protein yield of various cropsas related to protein value[J]. Economic Botany,1972,26(2):142-144.

    [6]宋國安. 對馬鈴薯的開發(fā)利用及加工工藝的探討[J]. 馬鈴薯雜志,1995,9(3):174-177.

    [7]顧春雷,楊 剛,刑衛(wèi)紅,等. 膜技術(shù)處理馬鈴薯加工廢水實(shí)驗(yàn)研究[C]//第一屆全國化學(xué)工程與生物化工年會論文摘要集(下). 南京:中國化工學(xué)會化學(xué)工程專業(yè)委員會與生物化工專業(yè)委員會,2004:562.

    [8]邱彩玲,李 勇,白雅梅,等. 蛋白質(zhì)在二倍體馬鈴薯中的分布及相關(guān)性分析[J]. 中國馬鈴薯,2006,20(2):65-67.

    [9]唐亞武. 馬鈴薯22-KD球蛋白的分離純化及其結(jié)構(gòu)測定的研究[D]. 長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

    [10]Van Gelder W M J,Vonk C R. Amino acid composition of coagulable protein from tubers of 34 potato varieties and its relationship with protein content[J]. Potato Researeh,1980,23(4):427-434.

    [11]李萌萌,蔣繼志,王會仙. 幾種提取馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)方法的比較研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2009,15(23):37-38.

    [12]張小靜,程李香,林必博,等. 馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)提取方法對雙向電泳結(jié)果的影響[J]. 生物發(fā)育與分子生物學(xué),2006,2(1):325-328.

    [13]王改萍,彭方仁,李生平. 銀杏葉片蛋白質(zhì)含量動態(tài)變化的電泳分析[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,30(4):114-118.

    [14]Hurkman W J,Tanaka C K. Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis[J]. Plant Physiology,1986,81(3):802-806.

    [15]張文會. 馬鈴薯分離蛋白溶液流變學(xué)特性及熱穩(wěn)定性研究[D]. 長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

    [16]邵錦震,邱昌恩,丁 毅. 不同提取劑對麥醇溶蛋白提取效果的電泳比較[J]. 武漢植物學(xué)研究,2003,21(3):262-266.

    [17]郭藹光,郭澤坤. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京:高等教育出版社,2007:55-57.

    [18]范吉星,鄧用川,黃 惜,等. 紅海欖根部總蛋白質(zhì)提取方法的改進(jìn)和雙向電泳體系的建立[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,34(5):550-553.

    [19]谷瑞升,劉群錄. 木本植物蛋白提取和SDS-PAGE分析方法的比較和優(yōu)化[J]. 植物學(xué)通報(bào),1999,16(2):171-177.

    [20]Wang W,Scali M,Vignani R,et al. Protein extraction for two-dimensional electrophoresis from olive leaf,a plant tissue containing high levels of interfering compounds[J]. Electrophoresis,2003,24(14):2369-2375.

    [21]彭存智. 紅樹耐鹽相關(guān)蛋白的分離和MALDI-TQ質(zhì)譜鑒定[D]. ??冢喝A南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

    [22]Gorg A,Weiss W,Dunn M J. Current two-dimensional electro-phoresis technology for proteomics[J]. Proteomics,2004,4(12):3665-3685.

    猜你喜歡
    提取方法部位品種
    每個女孩都有不允許別人觸碰的隱私部位
    每個女孩都有不允許別人觸碰的隱私部位
    分析當(dāng)歸中不同部位有效化學(xué)成分
    品種選育彩版
    中國蔬菜(2019年5期)2019-06-04 10:59:06
    五個部位冬天尤其要保暖
    華人時刊(2018年23期)2018-03-21 06:26:26
    種什么品種好?
    長江蔬菜(2017年5期)2017-05-10 09:26:56
    適合金銀花不同組織總RNA提取方法的篩選
    果膠的提取及應(yīng)用研究進(jìn)展
    果膠的提取及應(yīng)用研究進(jìn)展
    不同提取方法對骨碎補(bǔ)中總黃酮含量的影響比較
    日韩视频在线欧美| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 女性被躁到高潮视频| 午夜激情久久久久久久| 人成视频在线观看免费观看| 尾随美女入室| 97精品久久久久久久久久精品| 18禁在线播放成人免费| av免费观看日本| 免费大片黄手机在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲欧美一区二区三区国产| 一二三四中文在线观看免费高清| 五月玫瑰六月丁香| 久久久久久久久久久久大奶| 久久久国产精品麻豆| 国产一级毛片在线| 久久精品久久精品一区二区三区| 女人精品久久久久毛片| 少妇丰满av| 亚洲欧美精品自产自拍| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久久久国产网址| 人妻系列 视频| 免费av中文字幕在线| 另类亚洲欧美激情| 一级毛片我不卡| 亚洲国产av新网站| 99国产综合亚洲精品| 亚洲人成网站在线播| 女性被躁到高潮视频| 久久97久久精品| 激情五月婷婷亚洲| av在线观看视频网站免费| 黄色配什么色好看| 色视频在线一区二区三区| 欧美精品一区二区大全| 99re6热这里在线精品视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲五月色婷婷综合| 欧美性感艳星| 国产精品偷伦视频观看了| 国产成人freesex在线| tube8黄色片| 少妇 在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 大香蕉久久网| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 超色免费av| 免费高清在线观看日韩| 午夜免费观看性视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 97精品久久久久久久久久精品| 日韩欧美精品免费久久| 国产高清国产精品国产三级| 成人国产av品久久久| 国产免费福利视频在线观看| 免费av不卡在线播放| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美丝袜亚洲另类| 久久久精品区二区三区| 中文字幕av电影在线播放| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲欧美精品自产自拍| 十八禁网站网址无遮挡| 久久婷婷青草| 九色亚洲精品在线播放| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产精品无大码| 国产av码专区亚洲av| 伦理电影大哥的女人| 久久久精品免费免费高清| 嘟嘟电影网在线观看| 天美传媒精品一区二区| 国产男女内射视频| 美女国产视频在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| kizo精华| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲精品av麻豆狂野| av播播在线观看一区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲av综合色区一区| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产av精品麻豆| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产精品久久久久久久久免| 一级黄片播放器| 亚洲国产色片| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 9色porny在线观看| 国产精品免费大片| 亚洲国产av影院在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区 | 中文字幕最新亚洲高清| 777米奇影视久久| 99热网站在线观看| 最新中文字幕久久久久| 午夜av观看不卡| 午夜av观看不卡| 日本午夜av视频| 国产 一区精品| 精品一区二区免费观看| 少妇人妻 视频| 亚洲美女视频黄频| 国产国语露脸激情在线看| 国产极品天堂在线| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 婷婷色综合www| 国产综合精华液| 男女高潮啪啪啪动态图| 一级毛片 在线播放| 国产国语露脸激情在线看| 日本av免费视频播放| 午夜福利网站1000一区二区三区| 午夜免费观看性视频| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲欧美一区二区三区国产| 一区二区三区免费毛片| 国产视频首页在线观看| 色哟哟·www| 欧美少妇被猛烈插入视频| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲av成人精品一二三区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 国产日韩欧美在线精品| 精品人妻熟女av久视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 青青草视频在线视频观看| 丰满乱子伦码专区| 亚洲欧洲国产日韩| 欧美日韩视频精品一区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 两个人的视频大全免费| 国产免费福利视频在线观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产av一区二区精品久久| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产淫语在线视频| 天天影视国产精品| 99久久精品一区二区三区| 老女人水多毛片| 亚洲欧美色中文字幕在线| 在线观看一区二区三区激情| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产成人精品一,二区| 18+在线观看网站| 男人添女人高潮全过程视频| 国产精品人妻久久久久久| 免费人成在线观看视频色| videos熟女内射| av线在线观看网站| 欧美97在线视频| 人妻 亚洲 视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲成人一二三区av| 国产精品蜜桃在线观看| 婷婷色综合www| 最后的刺客免费高清国语| 老司机亚洲免费影院| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久久久网色| 欧美精品亚洲一区二区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产视频内射| 如何舔出高潮| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日日啪夜夜爽| 欧美亚洲日本最大视频资源| 午夜激情av网站| 韩国av在线不卡| 久久人人爽人人片av| 秋霞在线观看毛片| 午夜精品国产一区二区电影| 国产视频内射| 91精品国产九色| 亚洲av在线观看美女高潮| 久久久久久久久久久丰满| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美97在线视频| 在线播放无遮挡| 不卡视频在线观看欧美| 国产成人精品在线电影| 精品国产露脸久久av麻豆| 天天操日日干夜夜撸| 这个男人来自地球电影免费观看 | 日韩精品免费视频一区二区三区 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 一级黄片播放器| 91精品国产九色| 伊人久久国产一区二区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 男人操女人黄网站| 国产精品女同一区二区软件| 久久久精品区二区三区| 午夜激情久久久久久久| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产成人一区二区在线| 日韩中字成人| 国内精品宾馆在线| 天天影视国产精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 少妇的逼好多水| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产精品久久久久成人av| 一个人免费看片子| 成人免费观看视频高清| 少妇人妻 视频| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲成人一二三区av| 另类亚洲欧美激情| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲av男天堂| 99久国产av精品国产电影| 久久久a久久爽久久v久久| 最近中文字幕2019免费版| 97在线视频观看| 亚洲精品456在线播放app| 成年人免费黄色播放视频| 中国三级夫妇交换| 春色校园在线视频观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 欧美日韩视频精品一区| 在线观看免费高清a一片| 丝瓜视频免费看黄片| videosex国产| 美女国产视频在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 高清毛片免费看| 国产一区二区三区综合在线观看 | 三级国产精品欧美在线观看| 精品久久蜜臀av无| 午夜老司机福利剧场| videos熟女内射| av.在线天堂| 成人国语在线视频| 老司机亚洲免费影院| 精品视频人人做人人爽| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲情色 制服丝袜| 妹子高潮喷水视频| 大香蕉久久网| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲av福利一区| 亚洲精品国产av成人精品| 极品少妇高潮喷水抽搐| 永久网站在线| 亚洲精品乱久久久久久| 免费观看性生交大片5| 亚洲国产成人一精品久久久| 免费av不卡在线播放| 黑人高潮一二区| 国产精品熟女久久久久浪| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产亚洲最大av| 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美激情国产日韩精品一区| 男女啪啪激烈高潮av片| 91久久精品国产一区二区三区| 51国产日韩欧美| 亚洲性久久影院| 欧美bdsm另类| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产高清三级在线| 男女边摸边吃奶| 卡戴珊不雅视频在线播放| 丝瓜视频免费看黄片| 99国产综合亚洲精品| 男女高潮啪啪啪动态图| 超碰97精品在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 国产免费现黄频在线看| 国产男女内射视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲国产精品一区三区| 色吧在线观看| 性色avwww在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 人体艺术视频欧美日本| 色婷婷av一区二区三区视频| 丰满少妇做爰视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 精品国产露脸久久av麻豆| 在线观看三级黄色| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲人成网站在线观看播放| 午夜日本视频在线| 久久影院123| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲成色77777| 七月丁香在线播放| 老司机影院成人| 青春草视频在线免费观看| 在线看a的网站| 国产成人免费观看mmmm| 一本大道久久a久久精品| 精品亚洲成国产av| 国产男女超爽视频在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产不卡av网站在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产欧美亚洲国产| 色哟哟·www| 国产一级毛片在线| 欧美最新免费一区二区三区| 国产伦精品一区二区三区视频9| videossex国产| 成人午夜精彩视频在线观看| 99热国产这里只有精品6| 日韩亚洲欧美综合| 国产探花极品一区二区| 桃花免费在线播放| 天天操日日干夜夜撸| 一本色道久久久久久精品综合| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久99热这里只频精品6学生| 国产色婷婷99| 欧美xxⅹ黑人| 男人操女人黄网站| 色吧在线观看| 亚洲精品日本国产第一区| 高清在线视频一区二区三区| 九九在线视频观看精品| 亚洲天堂av无毛| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲无线观看免费| 少妇被粗大猛烈的视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 中文字幕亚洲精品专区| av.在线天堂| 一级二级三级毛片免费看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产日韩欧美在线精品| 99精国产麻豆久久婷婷| 精品一区二区免费观看| 美女国产高潮福利片在线看| 两个人免费观看高清视频| 日本与韩国留学比较| 天堂8中文在线网| 超碰97精品在线观看| 国产午夜精品一二区理论片| 大话2 男鬼变身卡| 国产精品国产三级国产av玫瑰| av天堂久久9| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲丝袜综合中文字幕| 久久女婷五月综合色啪小说| 在线观看免费日韩欧美大片 | 在线 av 中文字幕| 久久精品国产亚洲av天美| 午夜福利,免费看| 美女大奶头黄色视频| 女人精品久久久久毛片| 久久青草综合色| 久久久久久久大尺度免费视频| 涩涩av久久男人的天堂| 91午夜精品亚洲一区二区三区| av天堂久久9| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 大话2 男鬼变身卡| 国国产精品蜜臀av免费| 欧美丝袜亚洲另类| 女人久久www免费人成看片| 色婷婷av一区二区三区视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 精品一品国产午夜福利视频| 一级,二级,三级黄色视频| 九色成人免费人妻av| 九色亚洲精品在线播放| 热99久久久久精品小说推荐| 在线观看免费日韩欧美大片 | videos熟女内射| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 99九九线精品视频在线观看视频| 如何舔出高潮| 欧美三级亚洲精品| 精品久久久久久久久av| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 色吧在线观看| 久久精品夜色国产| 看十八女毛片水多多多| 成人国产av品久久久| 99热这里只有是精品在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 午夜影院在线不卡| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲欧美清纯卡通| 男人添女人高潮全过程视频| 国产精品成人在线| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲精品国产av蜜桃| 大陆偷拍与自拍| 国产视频首页在线观看| 久久久精品区二区三区| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产成人91sexporn| 亚洲国产最新在线播放| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲欧美一区二区三区国产| 午夜福利视频在线观看免费| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久综合国产亚洲精品| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 精品国产露脸久久av麻豆| 亚洲欧洲日产国产| 熟妇人妻不卡中文字幕| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久综合国产亚洲精品| av线在线观看网站| 一级,二级,三级黄色视频| 精品少妇内射三级| 免费看光身美女| 日本av手机在线免费观看| 麻豆成人av视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 91精品三级在线观看| 在线观看国产h片| 黄色欧美视频在线观看| 日韩大片免费观看网站| 自线自在国产av| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 亚洲精品久久午夜乱码| 91成人精品电影| 婷婷色麻豆天堂久久| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 日韩精品有码人妻一区| 久久精品夜色国产| 日本免费在线观看一区| 国产高清有码在线观看视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 少妇丰满av| 99热全是精品| 日本免费在线观看一区| 国产av国产精品国产| 亚洲人成网站在线观看播放| 黑人高潮一二区| 老熟女久久久| av播播在线观看一区| av女优亚洲男人天堂| 夫妻性生交免费视频一级片| 丰满迷人的少妇在线观看| 精品久久久噜噜| 免费观看a级毛片全部| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 日本-黄色视频高清免费观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 免费少妇av软件| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲av在线观看美女高潮| 久久久久精品久久久久真实原创| 嘟嘟电影网在线观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 一区二区三区乱码不卡18| 十八禁网站网址无遮挡| 欧美国产精品一级二级三级| 97在线人人人人妻| 街头女战士在线观看网站| 老司机影院成人| 国产精品.久久久| 中文字幕最新亚洲高清| 国产色婷婷99| 草草在线视频免费看| 九色亚洲精品在线播放| 女性生殖器流出的白浆| 欧美精品国产亚洲| 自线自在国产av| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 人妻少妇偷人精品九色| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久久久久久国产电影| 黄片无遮挡物在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 中文字幕人妻丝袜制服| 卡戴珊不雅视频在线播放| 91精品三级在线观看| av天堂久久9| 99久久精品一区二区三区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产深夜福利视频在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 精品久久久久久久久av| 中文字幕久久专区| 精品久久久久久电影网| 丝瓜视频免费看黄片| 日本av免费视频播放| 韩国av在线不卡| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久毛片免费看一区二区三区| 精品午夜福利在线看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲精品自拍成人| 免费观看的影片在线观看| 五月开心婷婷网| 综合色丁香网| kizo精华| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久久国产欧美日韩av| 少妇丰满av| 久久久精品区二区三区| 超色免费av| 三级国产精品片| 成人手机av| 韩国高清视频一区二区三区| 在线看a的网站| 久久 成人 亚洲| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 18禁在线播放成人免费| 熟女av电影| 99九九线精品视频在线观看视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产淫语在线视频| 久久久国产一区二区| 少妇精品久久久久久久| 视频区图区小说| 中文字幕亚洲精品专区| 欧美国产精品一级二级三级| av线在线观看网站| 视频区图区小说| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美日韩精品成人综合77777| 久热久热在线精品观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产爽快片一区二区三区| 视频区图区小说| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日日撸夜夜添| 国产高清三级在线| 亚洲综合色网址| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产精品三级大全| 人妻 亚洲 视频| 黑人猛操日本美女一级片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产视频首页在线观看| 考比视频在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 国产精品.久久久| 大片免费播放器 马上看| 久久国产精品大桥未久av| 性色avwww在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 能在线免费看毛片的网站| 久久久久久久久久人人人人人人| 一区二区三区免费毛片| 性高湖久久久久久久久免费观看| 久久97久久精品| 九草在线视频观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产在线免费精品| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 毛片一级片免费看久久久久| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久久久久久精品精品| 伊人久久精品亚洲午夜| xxxhd国产人妻xxx| 欧美激情国产日韩精品一区| 一级二级三级毛片免费看| 欧美+日韩+精品| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 久久综合国产亚洲精品| 伦精品一区二区三区| 青青草视频在线视频观看| 99国产精品免费福利视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲久久久国产精品| 观看美女的网站| 欧美日本中文国产一区发布| 久久国产亚洲av麻豆专区| 女性生殖器流出的白浆|