紅河紅茄中總黃酮的提取及抑菌作用

張虹+黃文莉+張淑梅+李春燕+袁寒+白紅麗+郭俊明

摘要：以紅茄為材料，乙醇為提取劑浸提，采用正交試驗(yàn)對(duì)紅茄總黃酮提取條件乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，用紫外分光光度法進(jìn)行紅茄中總黃酮的測定，并研究其抑菌作用。結(jié)果表明紅茄中總黃酮最佳提取條件為乙醇濃度（體積分?jǐn)?shù)）60%、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間1 h。在此條件下紅茄中總黃酮的提取率最高，為1.50%，RSD為1.02%。紅茄總黃酮提取液對(duì)腸球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌都有一定抑制作用，對(duì)腸球菌和大腸桿菌的抑制效果較好，而對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果較差。

關(guān)鍵詞：紅茄；總黃酮；提?。灰志饔?/p>

中圖分類號(hào)： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0287-03

紅茄（Solanum integrifolium Poir.），別稱扁果苦子、大苦子[1]，云南蒙自地區(qū)也稱苦茄，茄科，一年生草本植物，果實(shí)扁圓，上有4～6個(gè)淺棱，每棱上常有1淺溝，成熟果實(shí)橙黃色、紅色。紅茄果實(shí)為野生苦味蔬菜，具有清熱解毒功能[1-2]。目前已從野生到少量栽培，紅茄頗受蒙自地區(qū)人民的青睞，形成了具有當(dāng)?shù)靥厣氖秤梅椒?，可用來切片炒食或燒后作為“蘸水”調(diào)料。

黃酮類化合物是廣泛存在于植物中的一類化合物，在蔬菜、作物、水果等植物中均有分布，黃酮類化合物具有保護(hù)心腦血管、清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒的作用[3-6]。黃酮類化合物呈酸性，能使蛋白質(zhì)凝固或變性，以影響細(xì)胞膜的透性，導(dǎo)致微生物細(xì)胞吸收營養(yǎng)、核苷酸合成及ATP活性等功能障礙，從而抑制微生物的生長，產(chǎn)生殺菌和抑菌作用[7-8]。

本試驗(yàn)以紅茄的果實(shí)為研究對(duì)象，采用不同的乙醇濃度、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)紅茄中總黃酮進(jìn)行水浴加熱浸提，用紫外分光光度法進(jìn)行測定，并對(duì)其抑菌作用進(jìn)行研究，為苦味野生蔬菜資源的開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 新鮮的紅茄果實(shí)購于云南省紅河州蒙自集市。

1.1.2 試劑 蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、濃鹽酸、氯化鋁、鋅粉、三氯化鐵，均為分析純。瓊脂粉、蛋白胨（生化試劑）、牛肉膏（生化試劑）。

1.1.3 供試菌株 大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、腸球菌（Enterococcus faecalis），供試菌種均由紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 儀器 紫外分光光度儀（UV-4802S型，上海尤尼柯儀器有限公司）、真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、電熱恒溫水浴鍋（HWS-24，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、電子分析天平（BSA224S型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原材料處理 將新鮮的紅茄果實(shí)洗凈、切片，在80 ℃條件下烘干，高速粉碎機(jī)粉碎，備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確稱取干燥的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置50 mL容量瓶中，加入適量60%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的乙醇溶解（60 ℃），再用60%的乙醇定容至刻度，搖勻，得到濃度為0.20 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于25 mL 容量瓶中，加入5%的NaNO2溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min后加入10%的Al（NO3）3 溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min后加入4%的NaOH溶液10 mL，搖勻，用60%的乙醇定容，靜置15 min，同時(shí)以試劑空白作參比。在波長510 nm處測定溶液的吸光度[9]。

以吸光度（D）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：D=10.796C-0.001 1，r=0.999 9。

1.2.3 紅茄總黃酮的提取

1.2.3.1 單因素試驗(yàn) 采用恒溫水浴加熱的提取方法，分別以提取溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間為影響因素，設(shè)置3個(gè)因素水平，確定相關(guān)因素對(duì)紅茄提取液總黃酮的影響。

1.2.3.2 正交設(shè)計(jì)提取因素水平 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用正交設(shè)計(jì)方案進(jìn)一步考察乙醇濃度、提取時(shí)間和提取溫度3個(gè)因素對(duì)總黃酮提取的影響，以確定紅茄中總黃酮提取的最佳條件。每個(gè)因素選擇3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)（表1）。

稱取制備好的紅茄粉末2 g，分別置于帶塞三角瓶中，各加入20 mL乙醇，按表1因素水平進(jìn)行提取。提取后過濾，用相應(yīng)濃度乙醇溶液將濾液定容至25 mL容量瓶中，為樣品提取液。

1.2.4 總黃酮含量的測定 準(zhǔn)確吸取樣品提取液2mL，置于25 mL容量瓶中，按“1.2.2”節(jié)方法操作，在510 nm波長處平行測定3次，同時(shí)以樣品空白作參比。根據(jù)回歸方程計(jì)算總黃酮含量，總黃酮提取率=[提取液濃度×稀釋倍數(shù)×體積/樣品干重×1 000]×100%[10]。

1.3 紅茄總黃酮提取液抑菌方法

1.3.1 菌種的活化 在無菌條件下將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、腸球菌的菌種分別接種在新鮮的培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌種活化，取第2代備用。

1.3.2 菌懸液的制備 在大腸桿菌、腸球菌、枯草芽孢桿菌的試管斜面培養(yǎng)基上取活化好的少許菌株，用無菌水洗脫，配制成含菌數(shù)約為108個(gè)/mL的菌懸液備用。

1.3.3 抑菌圈直徑的測定[11-12] 在無菌條件下，用已滅菌的濾紙片（直徑6 mm）浸入總黃酮提取率最高的60%乙醇濃度紅茄總黃酮提取液中，充分浸泡后放在37 ℃干燥箱中烘干制成飽和的藥敏紙片，備用。將滅菌后的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿15 mL，冷卻凝固后，用無菌微量注射器取配制好的大腸桿菌、腸球菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液各0.1 mL涂布到培養(yǎng)基平板中，將飽和的藥敏紙片貼在平板上，以75%乙醇和無菌水的濾紙片作為對(duì)照。于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑（d）的大小（mm），測3次求平均值。

1.3.4 紅茄總黃酮粗提液用量對(duì)抑菌效果的測定 在無菌條件下，向已滅菌的培養(yǎng)皿中分別加入2、3、4、5、6 mL 60%乙醇濃度紅茄總黃酮提取液，然后倒入15 mL已滅菌的培養(yǎng)基，混勻、冷卻凝固，用無菌移液管將3種菌懸液各加入0.1 mL，用刮鏟將菌懸液涂勻后，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察記錄細(xì)菌生長情況，以得出適宜的總黃酮提取液的用量。每個(gè)用量和菌種分別重復(fù)3次。

1.3.5 最低抑菌濃度（MIC）的測定 在無菌條件下，將60%乙醇濃度紅茄總黃酮提取液稀釋成：100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.563%的不同濃度系列溶液，分別加入3 mL稀釋好的不同濃度的紅茄總黃酮提取液于無菌培養(yǎng)皿中，然后倒入15 mL培養(yǎng)基，混勻、冷卻凝固后，用無菌微量注射器加入0.1 mL菌懸液，用刮鏟將菌液涂勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察記錄細(xì)菌生長情況，每個(gè)濃度和菌種分別重復(fù)3次。觀察記錄細(xì)菌生長情況，以無菌體生長的濃度為最低抑菌濃度（MIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇提取濃度對(duì)總黃酮提取率的影響 在溫度80 ℃、乙醇濃度50%、60%、70%、80%、95%時(shí)，水浴提取1.0 h，結(jié)果（圖1）表明乙醇濃度在60%、70%、95%時(shí)，有較高提取率，60%時(shí)總黃酮的提取率最高，70%、80%和95%時(shí)的提取率雖有下降，但差別不大。

2.2.2 溫度對(duì)總黃酮提取率的影響 在乙醇濃度60%、溫度50、60、70、80、90 ℃時(shí)，水浴提取1.0 h，結(jié)果（圖2）表明隨溫度升高，總黃酮的提取率增高，在80 ℃提取率最高，80 ℃以后，提取率略有降低，這可能是因?yàn)闇囟忍撸瑢?duì)黃酮類物質(zhì)會(huì)有一定的破壞[13]。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

在乙醇濃度60%、溫度80 ℃，水浴提取0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h的條件下，對(duì)紅茄總黃酮的提取結(jié)果（圖3）表明，在提取時(shí)間為1.0、1.5、2.0 h時(shí)，有較高總黃酮的提取率，在1.0 h時(shí)最高；超過1.0 h時(shí)，提取率略有下降，但變化幅度不大。

2.2 紅茄中總黃酮提取工藝正交結(jié)果

由表2得出紅茄中總黃酮提取率最高的為A1B3C3，即乙醇濃度為60%，提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為2.0 h，最高提取率為1.43%。通過極差（R）分析，各因素對(duì)總黃酮提取率的影響程度由大到小為A>B>C；乙醇濃度對(duì)總黃酮的提取率影響最大，提取溫度影響次之，提取時(shí)間影響最小。極差分析的最佳提取條件為A1B3C1，綜合考慮其他因素，確定紅茄的最優(yōu)提取工藝為A1B3C1，即乙醇濃度為60%，提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為1.0 h。

用正交優(yōu)化的最佳試驗(yàn)條件，按“1.2.2”節(jié)方法操作進(jìn)行紅茄中總黃酮的提取試驗(yàn)，做3次平行試驗(yàn)，紅茄中總黃酮提取率為1.50%、1.51%、1.50%，平均提取率為1.50%，RSD為1.02%，該提取條件比較穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

在乙醇濃度為60%，提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為1.0 h 的條件下，對(duì)紅茄中總黃酮重復(fù)提取3次，按“1.2.2”節(jié)方法操作，總黃酮的提取率平均為1.48%，RSD值為1.10%，試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取2.0 mL 60%乙醇紅茄中總黃酮提取液，按“1.2.2”節(jié)方法操作，放置1.0 h，每隔10 min測定1次吸光度，結(jié)果表明1.0 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD為1.03%。

2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取60%乙醇紅茄總黃酮提取液2.0 mL置于3個(gè)25.0 mL容量瓶中，分別加入蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品0.2 mg，余下部分按“1.2.2”節(jié)方法操作，平行測定5次，計(jì)算加標(biāo)回收率，其平均回收率為99.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.17%，表明測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，符合測定要求。

2.6 紅茄總黃酮提取液抑菌效果

由表3可以看出，紅茄總黃酮提取液對(duì)3種供試菌均有抑制作用，對(duì)腸球菌的抑菌效果最好，其次為大腸桿菌，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果較弱，紅茄總黃酮提取液對(duì)3種菌的抑制效果均好于對(duì)照75%乙醇，無菌水無抑菌作用。

2.7 紅茄黃酮粗提取液的用量對(duì)抑菌效果的影響

從表4可以看出，紅茄總黃酮提取液的用量不同，抑菌效果也不相同。用量為2 mL時(shí)腸球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有少量的菌體生長；當(dāng)紅茄總黃酮提取液用量為3 mL以上時(shí)，對(duì)3種菌均有明顯的抑制作用，因此紅茄總黃酮提取液的用量選擇3 mL時(shí)為最佳的抑菌用量。

2.8 最低抑菌濃度（MIC）的測定

紅茄總黃酮提取液對(duì)3種供試菌均有抑制作用，抑制作用的強(qiáng)弱與濃度有關(guān)，隨濃度的增加，抑菌效果增強(qiáng)，其中以紅茄總黃酮提取液100%原液的抑菌效果最好。3種菌的MIC值均為100%原液，低于原液濃度的抑菌效果都較弱，尤以紅茄總黃酮提取液濃度為3.125%和1.526%時(shí)的抑菌效果最差，紅茄總黃酮提取液對(duì)腸球菌和大腸桿菌的抑制效果較好，但二者差別不大，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果最差（表5）。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明：各因素對(duì)總黃酮提取率的影響程度由大到小為乙醇濃度>提取溫度>提取時(shí)間。正交試驗(yàn)極差分析得出紅茄中總黃酮提取的最佳工藝條件為：乙醇濃度60%、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間為1 h，在此條件下提取紅茄總黃酮，總黃酮平均提取率為1.50%，RSD為1.02%。

紅茄總黃酮提取液對(duì)腸球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌都有一定的抑制效果，其抑菌作用的大小與濃度成正相關(guān)，以紅茄總黃酮提取液100%原液的抑菌效果最好，對(duì)3種菌的抑制效果為：對(duì)腸球菌和大腸桿菌的抑制效果較好，對(duì)枯草芽孢桿菌抑制效果較弱。

有研究表明，黃酮類物質(zhì)對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果一般好于大腸桿菌[14-17]，主要是因?yàn)辄S酮類物質(zhì)的抑菌作用與革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組分和結(jié)構(gòu)有關(guān)，黃酮類物質(zhì)對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制效果好于革蘭氏陰性菌，但本試驗(yàn)中對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果略低于對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抑制效果，與前人研究有一定的差異。

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