寧夏水稻品種抗稻瘟病基因Pi—ta、Pi—b和Pi9的檢測分析

張銀霞+張敏+田蕾+楊淑琴+李培富

摘要：為明確寧夏水稻品種中抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和Pi9的分布情況，為寧夏水稻抗穗頸瘟病的分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。利用Pi-ta、Pi-b和Pi9 3個與抗稻瘟病基因緊密連鎖的功能標(biāo)記，對94份寧夏水稻品種進行抗稻瘟病基因的分子檢測。結(jié)果表明，寧夏水稻品種中含Pi-ta抗性基因的占46.8%，含Pi-b抗性基因的占93.6%，含Pi9抗性基因的占27.7%，同時含有Pi-ta和Pi-b抗性基因的占44.7%，同時含有Pi-ta、Pi-b和Pi9抗性基因的占12.8%。根據(jù)報道，Pi-ta、Pi-b基因的聯(lián)合效應(yīng)與穗頸瘟抗性正相關(guān)系數(shù)為0.71，表明從寧夏水稻品種中選育抗穗頸瘟品種是有基因基礎(chǔ)的。

關(guān)鍵詞：水稻品種；稻瘟??；穗頸瘟；Pi-ta基因；Pi-b基因；Pi9基因；抗病基因

中圖分類號： S435.111.4+1 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0035-04

水稻（Oryza sativa）是世界上最重要的糧食作物之一，其產(chǎn)生的稻谷是全球半數(shù)以上人口的主食。由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae；無性態(tài)：Pyriculariagrisea）引起的稻瘟病是水稻生產(chǎn)的主要病害之一[1]，嚴重威脅世界的糧食安全[2-3]。實踐證明，利用抗稻瘟病基因培育抗性品種是防治水稻稻瘟病最經(jīng)濟、最有效、最環(huán)保的手段[4]。

寧夏是我國北方粳稻主產(chǎn)區(qū)之一，有悠久的水稻栽培歷史，形成了獨特而豐富的水稻遺傳資源。近年來，隨著全球氣候變暖，稻瘟病的發(fā)生越來越嚴重，成為寧夏水稻的常發(fā)性病害，也是制約寧夏灌區(qū)水稻增產(chǎn)的主要病害，每年都有不同程度的發(fā)生，主要以穗頸瘟危害為主，尤其是2006—2007年，局部地區(qū)甚至有大發(fā)生[5]。然而，這些種質(zhì)資源卻沒能得到充分利用，其原因首先是這些種質(zhì)資源的抗稻瘟病基因類型和抗性尚不清楚；其次是常規(guī)育種法通常是在抗病性由主效基因控制時才是最有效的，并且存在效率低、工作量大、操作困難等缺點。

近年發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)可快速、準(zhǔn)確地鑒定出材料中所含的抗性基因類型，并利用與稻瘟病抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進行分子標(biāo)記輔助選擇育種，這對于培育抗稻瘟病水稻品種有重要意義。目前已定位的抗稻瘟病基因至少有68個位點，總共有83個主效基因，它們成簇地分布在除第3染色體外的所有水稻染色體上[6]，已經(jīng)有葉瘟、頸瘟、苗瘟共24個抗稻瘟病基因被克?。ǜ鶕?jù)中國水稻數(shù)據(jù)中心提供的資料），與其緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記多數(shù)都已被開發(fā)出來。本研究利用對穗頸瘟抗性貢獻較大且相關(guān)性較緊密的抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b、Pi9的緊密連鎖的分子標(biāo)記[7-9]對寧夏水稻品種的抗病基因進行分子檢測與分析，旨在研究這3個抗性基因在寧夏水稻品種中的分布情況，為通過分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)培育抗穗頸瘟的水稻新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用由寧夏大學(xué)、寧夏農(nóng)業(yè)科學(xué)院等選育出的94份水稻品種作為供試材料：農(nóng)科843、寧粳3號、寧粳7號、寧粳9號、寧粳12、寧粳15（作）、寧粳16、寧粳18（作）、寧粳19（作）、寧粳23（作）、寧粳25（作）、寧粳26（作）、寧粳27（作）、寧粳28、寧粳29、寧粳31（作）、寧粳32（作）、寧粳33（作）、寧粳34、寧粳35、寧粳36、寧粳37、寧粳38、寧粳39（作）、寧粳40、寧粳41、寧粳42（作）、寧粳43（李）、寧粳44、寧粳45、寧粳46、寧粳47（節(jié)7）、寧稻216、寧香稻1號、寧香稻2號、寧香稻3號、寧香優(yōu)2號、京寧2號、京寧3號、京寧6號、京寧7號、寧資218、寧資460、節(jié)9、節(jié)12、花92、花96、花98、花117（作）、中花17、鑒17、鑒1310、鑒1320、鑒11、鑒61、鑒24、鑒1342、鑒1346、鑒1360、2007-218、2009XE-588、2001QX-62、2011-173、2012-731、2012-151、2012-162、2012-336、2012.784（航）、2013-1、2013-409、2013P2-36、2013-1104、2013-1120、2013-1134、11NX-2417、11NX-2324、318、05P3、SD-3、SD-4、毛毛糯、寧糯5號、黑蘭稻、小糯稻、養(yǎng)和白皮大稻、大白芒稻、葉盛大皮大稻、小紅板稻、小琥板稻、有芒小琥板稻、小白板稻、有芒大琥板稻、大琥板稻、白皮小稻。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物合成 PCR特異性引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

1.2.2 基因組總DNA的提取 利用SDS法提取總DNA，并用瓊脂糖電泳檢測DNA的質(zhì)量。以總DNA為模板，按下列反應(yīng)體系（20 μL）進行PCR擴增：2.0 μL 10×緩沖液（含Mg2+）、0.4 μL dNTP（2.5 mmol/μL）、每種引物各1.0 μL （2 mmol/L）、0. 2 μL Taq酶、2.0 μL 模板DNA，用ddH2O補足至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，退火（溫度依據(jù)引物說明而定），72 ℃ 1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃10 min。擴增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，核酸染料染色，紫外燈下觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pi-ta、Pi-b和Pi9基因功能標(biāo)記的檢測和驗證

利用Pi-ta、Pi-b和Pi9抗性基因的功能標(biāo)記特異性PCR引物對94份寧夏水稻品種進行抗病基因檢測。圖1為Pi-ta基因的檢測結(jié)果，可以看出，攜帶Pi-ta抗性基因的品種利用Pi-ta引物YL183/YL87能擴增出1 042 bp的片段，不含抗性基因Pi-ta的不能擴出1 042 bp的片段。圖2為Pi-b基因的檢測結(jié)果，可以看出，攜帶Pi-b抗性基因的品種利用Pi-b引物L(fēng)ys145能擴增出803 bp的片段。圖3為Pi9基因的檢測結(jié)果，可以看出，攜帶Pi9抗性基因的品種利用Pi9引物M-Pi9能擴增出291 bp的片段，不攜帶Pi9抗性基因的品種擴增出的片段為397 bp。

2.2 寧夏水稻品種抗稻瘟病基因分子檢測結(jié)果

通過對寧夏水稻品種抗稻瘟病基因的分子檢測，表2結(jié)果表明：94份寧夏水稻品種中含有Pi-ta抗性基因的有44份，占46.8%，根據(jù)報道，Pi-ta抗性基因與抗穗頸瘟有正相關(guān)關(guān)系[7，13]，在寧夏水稻品種中含有Pi-ta抗性基因占46.8%，說明從寧夏當(dāng)?shù)仄贩N中培育抗穗頸瘟的品種是有基因基礎(chǔ)的；含有Pi-b抗性基因的有88份，占93.6%，說明寧夏水稻品種中大多數(shù)都含有Pi-b基因；含有Pi9抗性基因的有26份，占27.7%，Pi9抗性基因為光譜抗性基因，而在寧夏水稻品種中單獨含Pi9抗性基因的材料較少。94份材料中同時含有Pi-ta和Pi-b抗性基因的有42份，占44.7%，根據(jù)報道，Pi-ta、Pi-b基因的聯(lián)合效應(yīng)與穗頸瘟抗性正相關(guān)系數(shù)為0.71[7，13]。因此，攜帶這2個抗病基因可以大大提高穗頸瘟抗性，這也說明從寧夏當(dāng)?shù)仄贩N中培育抗穗頸瘟的品種是有基因基礎(chǔ)的。由表2還可見，同時含有Pi-ta和Pi9抗性基因的有14份，占14.9%；同時含有Pi-b和Pi9抗性基因的有23份，占24.5%；同時含有Pi-ta、Pi-b和Pi9抗性基因的有12份，占12.8%。

3 討論與結(jié)論

由于稻瘟病的發(fā)生逐年在增加，尤其是穗頸瘟危害最為嚴重，嚴重時可導(dǎo)致顆粒無收[14]。而近幾年發(fā)展的通過分子標(biāo)記輔助選擇育種（MASB）在水稻抗稻瘟病育種上應(yīng)用回交轉(zhuǎn)移抗性基因并進行多個抗性基因的聚合，從而達到增加品種的抗性和抗譜，培育出多抗品種的事例越來越多，比如董巍等通過MASB方法將供體BL6的Pi1、Pi2抗性基因聚合到培矮64S水稻品種中，篩選出10株對稻瘟病的葉瘟和穗頸瘟抗性明顯增強的改良株系[15]。表明多個抗性基因聚合后，抗性基因之間表現(xiàn)為極顯著的基因互作，協(xié)同抵抗單個抗病基因不能抵抗的生理小種[16]，這是多基因聚合后抗譜拓寬、抗性增強的重要原因，因此基因聚合是培育稻瘟病持久抗性的有效方法。在聚合雜交中，應(yīng)用目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記進行輔助選擇，可以快速準(zhǔn)確地將多個目標(biāo)基因聚合于一個重組體。比如王軍等研究表明，Pi-ta、Pi-b基因的聯(lián)合效應(yīng)與穗頸瘟抗性呈正相關(guān)，并且這種相關(guān)性比Pi-ta和Pi-b單獨存在與穗頸瘟抗性的相關(guān)性要緊密[7]。

本研究應(yīng)用3個抗稻瘟病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對寧夏水稻品種進行檢測，結(jié)果表明，46%的寧夏水稻品種中含有抗稻瘟病基因Pi-ta，而Pi-ta基因與穗頸瘟抗性的相關(guān)性為0.5[7]；44%的寧夏水稻品種中含有抗稻瘟病基因Pi-ta和Pi-b，而這2種基因與穗頸瘟抗性的相關(guān)性為0.7[13，7]，所以這2種抗性基因的存在，可以為寧夏水稻選育抗穗頸瘟品種奠定基因基礎(chǔ)。Pi9為廣譜抗性的基因[17]，而寧夏水稻品種中缺乏Pi9基因，若以此為主效基因，可以聚合其他抗性基因以拓寬抗譜、提高持久抗稻瘟病的能力。目前在寧夏地區(qū)最嚴重的稻瘟病危害為穗頸瘟，可以利用品種中含有Pi-ta基因的品種與其他品種進行MASB，選育抗穗頸瘟的品種。所以本研究為寧夏水稻抗稻瘟病以及抗穗頸瘟的分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)。

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