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    梵凈山藤茶水提取物藥效學(xué)初步研究

    2016-11-28 15:18:52康超王芳劉盈盈秦華軍席培宇賈強(qiáng)
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年9期
    關(guān)鍵詞:血脂血壓血糖

    康超+王芳+劉盈盈+秦華軍+席培宇+賈強(qiáng)

    摘要:為研究梵凈山藤茶水提取物(AGWE)對乙醇性肝損傷、血脂、血糖、血壓的影響,通過構(gòu)建急性毒性乙醇性肝損傷模型,考察不同劑量濃度的AGWE對小鼠的預(yù)防作用和SD大鼠肝損傷的保護(hù)作用,檢測試驗動物的死亡率、血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平;通過構(gòu)建高血脂大鼠模型和四氧嘧啶構(gòu)建糖尿病模型,經(jīng)口灌胃AGWE,檢測動物模型血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和血糖水平;制備大鼠胸動脈離體血管環(huán),檢測AGWE 對血管環(huán)的舒張作用。結(jié)果表明,AGWE降低了小鼠對乙醇致死的死亡率,增強(qiáng)了小鼠對乙醇急性毒性的耐受性;灌胃不同劑量的AGWE,可明顯降低大鼠血清中ALT、AST水平,且呈劑量依賴;能顯著降低血清TC、TG、葡萄糖水平(P<0.05),可以減少血管的收縮作用,使血管舒張。AGWE對乙醇性肝損傷、高血脂、高血糖、高血壓均具有良好的保護(hù)作用。

    關(guān)鍵詞:藤茶水提物;乙醇性肝損傷;血脂;血糖;血壓

    中圖分類號: R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號:1002-1302(2016)09-0260-04

    藤茶別稱端午茶、藤婆茶、山甜茶、龍須茶、白茶、甘露茶、白毛猴等,系葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄[Ampelopsis grossedentata(Hand-Mazz) W.T.Wang]的嫩莖葉,主要分布于湖南、湖北、云南、貴州、廣東、廣西、福建等地[1]。藤茶中含有多種化學(xué)物質(zhì),如黃酮類、酚類、苷類、蛋白質(zhì)、氨基酸等[1-3],此外,還包括烷烴類、醛類、有機(jī)酸、醇類及甾醇類等多種揮發(fā)性物質(zhì)[4]。研究表明,藤茶及其提取物具有抗菌消炎[5-7]、抗腫瘤[8-10]、抗氧化[11-12]、降血糖[13-15]、降血脂[16-18]、保肝護(hù)肝[19-20]等作用。梵凈山位于貴州東北部,擁有同緯度地區(qū)保存最完好的亞熱帶原始森林,屬亞熱帶山地濕潤季風(fēng)氣候區(qū),動植物資源豐富,擁有豐富而優(yōu)質(zhì)的野生藤茶資源。然而,關(guān)于梵凈山藤茶的藥理功效卻未見報道。本研究首次報道梵凈山野生藤茶提取物對血脂、血糖、血壓的影響,探討了梵凈山藤茶的藥理學(xué)作用,為梵凈山藤茶的合理利用和產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 受試物

    梵凈山野生藤茶,采集自貴州省梵凈山自然保護(hù)區(qū)的野生藤茶。

    1.2 試驗動物

    NIH小鼠(批號:44007200006820),雌雄各半,清潔級標(biāo)準(zhǔn),體質(zhì)量18~22 g,由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。SD大鼠[批號:SCXK-(粵)2008-0002],雄性,清潔級標(biāo)準(zhǔn),體質(zhì)量180~220 g,由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。Wistar大鼠[批號:SCXK-(粵)2008-0002],雄性,體質(zhì)量223.7~276.3 g,清潔級標(biāo)準(zhǔn),共40只,由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。

    1.3 試劑和儀器

    試劑:99.7%乙醇(分析純,杭州長征化工廠,批號:20100302)、聯(lián)苯雙酯滴丸(北京協(xié)和藥廠)、地奧心血康(成都地奧制藥集團(tuán)有限公司)、四氧嘧啶(美國Sigma公司)、鹽酸二甲雙胍(貴州天安藥業(yè)有限責(zé)任公司)、普萘洛爾(山西云鵬制藥有限公司)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所,自動生化分析儀(日立7100)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(壹葉3100)、BL-420E生物機(jī)能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司),其他均為常規(guī)試劑和儀器。

    1.4 方法

    1.4.1 AGWE制備 將采集的梵凈山藤茶的嫩枝葉粉碎,熱水提取3次,合并濾液,濃縮成浸膏。給藥時蒸餾水溶解為目的給藥劑量,分別相當(dāng)于生藥200 mg/kg體質(zhì)量和2 000 mg/kg 體質(zhì)量。

    1.4.2 動物分組及胸動脈離體血管環(huán)制備 (1)乙醇急性毒性學(xué)試驗:將NIH小鼠隨機(jī)分成5組,每組10只。

    (2)乙醇急性毒性的預(yù)防試驗:將NIH小鼠隨機(jī)分成5組,即空白對照、乙醇對照組和AGWE低、中、高劑量組,每組10只。

    (3)乙醇致肝損傷保護(hù)作用:將SD大鼠隨機(jī)分成6組,即空白對照、陰性對照、陽性對照和AGWE低、中、高3個劑量組,每組10只。

    (4)降血脂試驗:將SD大鼠(雌雄各半)隨機(jī)分成4組,即空白對照、模型組、陽性對照組和AGWE組,每組10只。除空白組外,其余組別SD大鼠連續(xù)給予高脂飼料(基礎(chǔ)飼料87.3%、膽固醇2%、膽鹽0.5%、豬油10%、甲基硫氧嘧啶0.2%[21])14 d,空白組給予基礎(chǔ)飼料。隨機(jī)抽取每組30%的動物眼球后血管叢取血,檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平,確定動物模型。

    (5)降血糖試驗:將NIH小鼠隨機(jī)分成4組,即空白對照、模型組、陽性對照和AGWE組,每組10只。將四氧嘧啶溶于生理鹽水溶液中,配制為72 mg/kg。通過NIH小鼠尾靜脈注射四氧嘧啶(72 mg/kg)生理鹽水溶液,72 h后檢測血清葡萄糖水平,以血糖值大于16 mmol/L作為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

    (6)胸動脈離體血管環(huán)制備:Wistar大鼠斷頭處死,開胸迅速取出胸主動脈,置于預(yù)先用混合氣體(95% O2和5% CO2)飽和的4 ℃的K-H溶液中,沖洗至無血跡,去除外周的脂肪組織和結(jié)締組織,剪成2~3 mm長的血管環(huán),將血管環(huán)置于盛有10 mL的K-H溶液(37 ℃恒溫,并持續(xù)通入95% O2和5% CO2的混合氣體,pH值=7.4)的恒溫套瓶中。每一根血管環(huán)用2個三角型掛鉤貫穿血管環(huán)管腔,一端固定,另一端連接于張力傳感器,張力變化由BL-420E生物機(jī)能實驗系統(tǒng)采集并記錄。血管環(huán)加靜息張力2 g左右,穩(wěn)定90 min,期間每15 min用預(yù)溫至37 ℃的K-H溶液更換液體,使血管環(huán)完全穩(wěn)定。

    1.4.3 試驗方法 (1)乙醇急性毒性學(xué)試驗:每組試驗動物,分別灌胃不同劑量的乙醇1次,記錄死亡數(shù),并計算死亡率和半數(shù)致死劑量。

    (2)乙醇急性毒性的預(yù)防試驗:NIH大鼠隨機(jī)分組后,每組給予半數(shù)致死量乙醇的同時給藥。樣品組給予不同劑量的AGWE(50、100、200 mg/mL),空白組和模型組給予等體積生理鹽水,記錄死亡數(shù),并計算死亡率。

    (3)乙醇致肝損傷保護(hù)作用:SD大鼠隨機(jī)分組后,陽性對照組腹腔注射聯(lián)苯雙酯滴丸(0.2 g/kg),樣品組腹腔分別注射AGWE低、中、高劑量(400、1 000、2 000 mg/kg),空白對照和模型組腹腔分別注射等體積生理鹽水。1次/d,連續(xù)給藥10 d,分別于第5、9天給藥1 h后腹腔注射乙醇溶液(3 mL/kg),空白組注射等體積生理鹽水,并于第10天給藥4 h 后眼眶取血1 mL,3 000 r/min離心10 min,檢測血清中ALT、AST含量。

    (4)降血脂試驗:高脂飼料飼養(yǎng)第15天開始給藥,各試驗動物組分別經(jīng)口灌胃給藥。樣品供試組給藥AGWE(2 000 mg/kg),陽性對照組給藥地奧心血康(30 mg/kg),模型組和空白對照給予等體積生理鹽水,1次/d,連續(xù)給藥28 d(末次給藥后,禁食不禁飲8 h)。所有動物經(jīng)眼球后血管叢采血,取血清檢測血脂水平。

    (5)降血糖試驗:陽性對照組給藥鹽酸二甲雙胍(150 mg/kg),樣品供試組給藥AGWE (200 mg/kg),對照組和模型組給予等體積生理鹽水,1次/d,連續(xù)7 d。于末次給藥后1 h,小鼠眼眶靜脈叢取血測定血糖水平。

    (6)降血壓試驗:先制備胸動脈離體血管環(huán),待立體血管環(huán)穩(wěn)定后,用60 mmol/L的KCl重復(fù)刺激3次,誘發(fā)血管的最大收縮幅度,連續(xù)3次同樣的刺激,使血管收縮幅度<10%時,以此作為100%收縮張力。陽性藥物組給藥普萘洛爾(0.10 mg/kg),樣品供試組給藥AGWE(2 000 mg/kg),對照組給予體積60 mmol/L的KCl溶液。記錄不同藥物下血管環(huán)的張力變化,并計算舒張率,公式如下:

    舒張率=加受試藥后張力-加受試藥前張力藥物刺激后張力-藥物刺激前張力×100%。

    1.5 數(shù)據(jù)分析和處理

    數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,結(jié)果取平均值,以x[TX-*5]±s表示,采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 AGWE解酒護(hù)肝作用

    2.1.1 乙醇急性毒性學(xué)試驗 為研究乙醇對小鼠的急性毒性作用,分別給予不同劑量的乙醇1次,其死亡數(shù)和死亡率見表1。從表1可以看出,隨著劑量的增加,死亡率逐漸上升。當(dāng)乙醇劑量增加到12.46 g/kg時,死亡率達(dá)到100%。根據(jù)數(shù)據(jù)及半數(shù)致死量(LD50)的計算方法得出乙醇對小鼠的LD50為10.11 g/kg。

    2.1.2 AGWE對乙醇急性毒性的預(yù)防試驗 為考察不同AGWE濃度對乙醇急性毒性的預(yù)防作用,每組試驗動物給予半數(shù)致死量乙醇的同時給予AGWE低、中、高劑量(分別相當(dāng)于生藥量50、100、200 mg/mL),結(jié)果見表2。從表2可以看出,隨著AGWE濃度的增加,小鼠死亡率逐漸降低,從乙醇組的60%下降到AGWE高劑量組的20%,死亡率降低了66.7%,揭示AGWE增強(qiáng)了小鼠對乙醇急性毒性的耐受性。

    2.1.3 AGWE對乙醇致肝損傷的保護(hù)作用 分別考察不同劑量的AGWE對乙醇致肝損傷的保護(hù)作用,結(jié)果見表3。從表3可以看出,與空白組比較,模型組血清中ALT、AST含量顯著升高(P<0.01),揭示化學(xué)性肝損傷造模成功。與模型組比較,AGWE各劑量組和聯(lián)苯雙酯滴丸可顯著降低大鼠血清中ALT含量(P<0.05)。AGWE中,高劑量和聯(lián)苯雙酯滴丸可顯著降低大鼠血清中AST含量(P<0.05)。其中,AGWE 高劑量組對血清中ALT、AST作用與聯(lián)苯雙酯滴丸組相當(dāng),說明該提取物對乙醇性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用。此外,隨著提取物劑量的逐漸增加,血清中ALT、AST含量逐漸減少,表明AGWE對乙醇性肝損傷的保護(hù)作用呈劑量依賴。

    2.2 藤茶提取物對血脂的影響

    連續(xù)給藥28 d后,眼球后血管叢采血檢測血脂水平,結(jié)果見表4。從表4可以看出,地奧心血康和AGWE(2 000 mg/kg)2個組的總膽固醇和甘油三酯水平顯著低于模型組(P<0.05)。此外,藤茶水提取物組的膽固醇水平顯著低于地奧心血康組(P<0.05),對甘油三酯的影響,兩者之間無顯著性差異。結(jié)果表明,AGWE能明顯地降低膽固醇和甘油三酯水平,且優(yōu)于地奧心血康。

    2.3 藤茶水提取物對血糖的影響

    連續(xù)給藥7 d后,小眼眶靜脈叢取血測定小鼠血糖水平,結(jié)果見表5。從表5可以看出,AGWE(200 mg/kg)和鹽酸二甲雙胍2個組的血糖水平明顯低于模型組血糖水平(P<0.05),兩者之間無顯著性差異。結(jié)果表明,AGWE能明顯降低小鼠血糖水平,與鹽酸二甲雙胍效果相當(dāng)。

    2.4 藤茶水提取物對血壓的影響

    當(dāng)大鼠胸動脈離體血管環(huán)處于最大收縮張力時(收縮幅度<10%),用普萘洛爾和AGWE(2 000 mg/kg)分別對血管環(huán)進(jìn)行刺激,記錄血管舒張幅度并計算舒張率,結(jié)果見表6。從表6可以看出,在普萘洛爾和AGWE的刺激下,處于緊張的血管環(huán)明顯舒張,其舒張率分別為(114.31±13.87)%和(103.23±12.31)%,與對照組比較,兩者能明顯減輕收縮幅度(P<0.01)。普萘洛爾和AGWE對血管有舒張作用,兩者之間無顯著性差異。結(jié)果表明,AGWE具有明顯降血壓作用,與普萘洛爾效果相當(dāng)。

    3 討論

    本試驗研究了藤茶水提取物對乙醇性肝病、“三高”、抗炎癥等作用。乙醇性肝病是我國常見的肝臟疾病之一,是由長期大量飲酒導(dǎo)致的,嚴(yán)重危害人的健康。初期通常表現(xiàn)為脂肪肝,進(jìn)而可發(fā)展成乙醇性肝炎、肝纖維化和肝硬化。嚴(yán)重酗酒時可誘發(fā)廣泛肝細(xì)胞壞死,甚至肝功能衰竭。本研究通過灌胃乙醇建立大鼠急性毒性肝損傷模型,觀察藤茶水提物對乙醇性肝損傷的保護(hù)作用。表明藤茶水提取物增強(qiáng)了小鼠對乙醇急性毒性的耐受性,明顯降低了大鼠血清中ALT、AST含量,與之前研究結(jié)果一致[19-20,22]。乙醇在肝臟代謝過程中可產(chǎn)生大量的活性氧自由基(如OH-、O-2、H2O2)導(dǎo)致生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),引起膜的流動性和通透性發(fā)生改變,最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損壞[23];另一方面,產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物——丙二醛(MDA)可以與蛋白質(zhì)、核酸(DNA、RNA)等大分子化合物交聯(lián),導(dǎo)致細(xì)胞和胞內(nèi)細(xì)胞器代謝及功能障礙,甚至死亡[24]。AST主要分布于胞漿和線粒體,是一種線粒體酶,極易受到乙醇的影響[24]。梵凈山藤茶水提取物能明顯降低血清中AST水平,揭示了藤茶水提取物具有清除肝臟代謝過程中氧自由基,防止生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的功能,從而達(dá)到保肝護(hù)肝的作用。

    “三高”即高血脂、高血糖和高血壓的簡稱,是導(dǎo)致心血管疾病的直接因素。如何有效控制高血脂、高血糖、高血壓的發(fā)生,對心腦血管疾病的防治有著深遠(yuǎn)的意義。體質(zhì)量指數(shù)(BMI)升高所致心血管風(fēng)險部分由高血壓、高血脂和高血糖介導(dǎo),降低血壓、血脂和血糖可使BMI升高引起的冠心病和卒中額外風(fēng)險分別減少一半和3/4[25]。研究表明,藤茶總黃酮能降低血清TC、TG、LDL-C含量,減少肝系數(shù)和apoB/apoA比值,提高血清HDL-C含量[17-18],且能降低陰虛小鼠血糖和饑餓小鼠肝糖原水平,增加胰島素抗性[26],能降低大鼠血糖值,改善血脂,升高胰島素水平,并減輕胰島細(xì)胞的損傷[15]。結(jié)果表明,梵凈山藤茶水提取物能明顯降低試驗型血脂、血糖水平,達(dá)到降血脂、血糖的效果,與之前研究結(jié)果一致,同時揭示其具有潛在的減肥功效。此外,本試驗研究了藤茶水提物對大鼠胸腔離體血管環(huán)的影響,表明藤茶水提取物能緩解由KCl刺激的血管緊張作用,表現(xiàn)了良好的降壓效果。

    本研究僅涉及水提取物的藥效作用,對乙醇性肝損傷和“三高癥”均有良好的效果,但對其具體的活性成分和作用機(jī)制尚未研究。藤茶含有多種化學(xué)成分,其中總黃酮的含量可達(dá)40%[27],其保肝護(hù)肝、抗“三高”可能體現(xiàn)在黃酮類化合物上,其活性成分的篩選和藥理作用機(jī)制有待后續(xù)研究??傊?,梵凈山具有獨特的氣候環(huán)境,擁有豐富、優(yōu)質(zhì)的野生藤茶資源,其藥理活性的研究可為梵凈山藤茶保健飲品和藥用開發(fā)提供依據(jù)。

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