黃花蒿1—脫氧—D—木酮糖—5—磷酸還原異構(gòu)酶基因的生物信息學(xué)分析

王步勇+馬玲

摘要：以黃花蒿（Artemisia annua L.） 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因（DXR）為研究對(duì)象，利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站及生物信息學(xué)軟件對(duì)堿基分布、氨基酸組成、親疏水性及編碼蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，用Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)，用MGEA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用STRING進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，研究黃花蒿DXR基因特征并預(yù)測(cè)分析DXR蛋白結(jié)構(gòu)與功能。結(jié)果表明：黃花蒿DXR基因mRNA序列長(zhǎng)度為1 419 bp，編碼蛋白包含472個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為6.15；DXR蛋白為疏水性蛋白，無(wú)信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。多序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明，黃花蒿DXR蛋白與杭白菊DXR（BAE79548.1）的相似度最高，為98%，且處于同一分支，親緣關(guān)系較近。蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲是黃花蒿DXR蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件?；プ骶W(wǎng)絡(luò)分析顯示，黃花蒿DXR在2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）代謝途徑中，可與CMS、DXS、HDS等多個(gè)蛋白發(fā)生互作。黃花蒿DXR基因在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守，獲得的保守區(qū)序列信息為其他物種DXR基因的克隆奠定了基礎(chǔ)，深入研究該蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能特征，也為今后提高青蒿素的生物合成量提供理論支持。

關(guān)鍵詞：黃花蒿；DXR基因；生物信息學(xué)；同源序列；多重序列比對(duì)；蛋白結(jié)構(gòu)；蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；青蒿素；生物合成量

中圖分類號(hào)： S188；R282.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0042-05

黃花蒿（Artemisia annua L.）為菊科蒿屬的一年生草本植物，生態(tài)適應(yīng)性非常廣，在我國(guó)各地均有分布，已入藥2 000多年，具有清熱解毒的功效，為我國(guó)傳統(tǒng)中草藥之一。其主要有效成分青蒿素在抗瘧，治中暑、蕁麻疹和滅蚊等方面具有重要功效，是目前世界衛(wèi)生組織推薦治療瘧疾的首選藥物[1-2]。中國(guó)青蒿素產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的70%左右[3]，由于野生資源的黃花蒿中青蒿素含量較低（0.01%～0.8%），致使青蒿素價(jià)格較高，很難滿足醫(yī)藥需求[4]。近年來(lái)，利用環(huán)己烯酮[5]、青蒿酸[6-7]等物質(zhì)化學(xué)合成青蒿素取得一定成果，但因青蒿酸的生產(chǎn)主要依賴黃花蒿葉片，青蒿素的全化學(xué)合成幾乎不可能[8]。生物合成青蒿素仍是生產(chǎn)青蒿素的主要途徑，培育黃花蒿則成為提高青蒿素產(chǎn)量的關(guān)鍵。通過(guò)對(duì)青蒿素生物合成中關(guān)鍵酶的研究，利用基因工程獲得高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株是解決這一矛盾的有效途徑。

青蒿素是含有過(guò)氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯，屬于萜類化合物。絕大多數(shù)萜類化合物的合成前體是異戊烯基焦磷酸（IPP），植物體內(nèi)IPP的生物合成主要存在2條不同的代謝途徑：一是定位于細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑[9]；另一條是定位于質(zhì)體中的2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）途徑[10]。1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（DXR）催化1-脫氧-D-葡萄糖-5-磷酸（DXP）產(chǎn)生異構(gòu)并還原生產(chǎn)MEP，是MEP代謝途徑中最重要的限速反應(yīng)，也是細(xì)胞質(zhì)體內(nèi)類異戊二烯化合物代謝中的重要調(diào)控穩(wěn)點(diǎn)[11]。DXR在植物類異戊二烯生物合成過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。Mahmoud等發(fā)現(xiàn)，薄荷過(guò)量表達(dá)DXR，可促進(jìn)葉片中薄荷油等單萜的合成，使薄荷精油量提高50%[12]。Carretero-Paulet等發(fā)現(xiàn)，在過(guò)量表達(dá)DXR的轉(zhuǎn)基因擬南芥中，葉綠素、類胡蘿卜素水平都顯著提高[13]。Graham等通過(guò)對(duì)青蒿基因組測(cè)序并對(duì)青蒿素合成相關(guān)基因進(jìn)行分析表明，DXR與青蒿素合成呈正相關(guān)[14]。

近年來(lái)，擬南芥、番茄、水稻、玉米、銀杏、橡膠樹(shù)及喜樹(shù)等多種植物的DXR基因得到解析[15-16]，但尚未有報(bào)道利用生物信息學(xué)的方法系統(tǒng)研究這些基因，制約了其他物種中該基因的克隆與功能驗(yàn)證。本試驗(yàn)利用生物信息學(xué)方法對(duì)黃花蒿DXR基因以及GenBank上已發(fā)表的其他植物DXR基因進(jìn)行序列分析和功能預(yù)測(cè)，利用分子互作技術(shù)對(duì)黃花蒿DXR基因進(jìn)行全面分析，旨在為提高黃花蒿青蒿素產(chǎn)量提供新思路，為其他植物DXR基因的克隆、功能驗(yàn)證提供理論和實(shí)踐參考依據(jù)。

1 材料與方法

數(shù)據(jù)來(lái)源于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中已登陸的黃花蒿DXR基因的核苷酸序列（GenBank登錄號(hào)：AF182287.2）、氨基酸序列（GanBank登錄號(hào)：AAD56391.2）[17]。

黃花蒿DXR序列分析：利用NCBI在線工具ORF-Finder翻譯蛋白并進(jìn)行開(kāi)放閱讀框（ORF）查找。利用ExPASy ProtParam預(yù)測(cè)分析編碼蛋白的相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)、穩(wěn)定性等理化性質(zhì)[18]。用Target 1.1 Server在線軟件分析編碼蛋白的導(dǎo)肽[19]。用SignalP 4.1在線軟件分析編碼蛋白信號(hào)肽[20]。用TMHMM Server軟件對(duì)編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析[21]。用WOLF PSORT預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位信號(hào)[22]。用ProtScale分析編碼蛋白的親疏水性。用NetPhos 2.0 Server分析編碼蛋白潛在的磷酸化位點(diǎn)[23]。利用NCBI BLAST篩選同源序列，用Bioedit軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析。利用MEGA 5.2 軟件鄰接算法N-J（Neihgbor-Joining）[24]，選用JTT+I模型運(yùn)算1 000次構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并利用Bootstraping自展法對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。

蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及互作網(wǎng)絡(luò)分析：用NCBI CDD工具對(duì)蛋白保守區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；用ExPaSy-SOPMA軟件分析編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；用SWISS-MODEL自動(dòng)建模方式來(lái)篩選構(gòu)建三維模型，用X射線衍射結(jié)構(gòu)進(jìn)行模型修飾；用Swiss-Pdb viewer構(gòu)建拉氏構(gòu)象圖，對(duì)建模準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估；用STRIG 9.1（http：//string.embl.de/）[25]進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花蒿DXR基因分析和蛋白分析

2.1.1 黃花蒿DXR基因序列分析 NCBI上登錄的黃花蒿DXR序列是從黃花蒿mRNA中克隆得到的全長(zhǎng)CDS（coding sequence）序列。序列全長(zhǎng)為1 419 bp，其中包含多個(gè)起始密碼子（ATG）和1個(gè)終止密碼子（TGA）。其中A有379個(gè)，T有415個(gè)，A+T含量較高，為55.95%；C有292個(gè)，G有333個(gè)，C+T含量較少，為44.05%。

2.1.2 黃花蒿DXR編碼蛋白的氨基酸組成及其理化性質(zhì)分析 通過(guò)ORF-Finder軟件分析發(fā)現(xiàn)，黃花蒿DXR編碼蛋白編碼472個(gè)氨基酸。該預(yù)測(cè)蛋白原子總數(shù)為7 204個(gè)，分子式為C2 278H3 634N600O677S15，蛋白相對(duì)分子量為50.74 ku；理論半衰期為30 h；不穩(wěn)定系數(shù)為33.53，小于40.0，說(shuō)明該蛋白屬于穩(wěn)定性蛋白。此外，該蛋白脂肪系數(shù)為98.37，親水性系數(shù)為0.020，理論等電點(diǎn)（PI）為6.15。由其氨基酸組分可知，丙氨酸Ala（A）、亮氨酸Leu（L）含量最高，為9.70%；半胱氨酸Cys（C）含量最低，為1.50%；帶負(fù)電荷總殘基數(shù)（Asp+Glu）為49個(gè)，帶正電荷總殘基數(shù)（Arg+Lys）為44個(gè)（圖1）。

2.1.3 DXR蛋白導(dǎo)肽、信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析 用TargetP 1.1 Server預(yù)測(cè)DXR導(dǎo)肽，結(jié)果顯示，該序列mTP（定位于線粒體）值為0.030，cTP（定位于葉綠體）值為0.691，SP（信號(hào)肽）值為0.022，推測(cè)該序列不含有線粒體目標(biāo)肽、分類途徑信號(hào)肽，可能為葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。SignalP 4.1預(yù)測(cè)顯示，黃花蒿DXR蛋白為非分泌蛋白。用WOLF PSORT軟件對(duì)該蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，該蛋白最可能定位于細(xì)胞質(zhì)上，可信度高達(dá)76%。

2.1.4 DXR蛋白親/疏水性及磷酸化位點(diǎn)分析 利用ProtScale預(yù)測(cè)黃花蒿DXR蛋白的親/疏水性，由圖2可見(jiàn)：在黃花蒿DXR蛋白氨基酸中，第167～193位氨基酸區(qū)域具有很強(qiáng)的疏水性，在第171位氨基酸處達(dá)到最強(qiáng)疏水性峰值，為2.444；第32～44位氨基酸區(qū)域具有很強(qiáng)的親水性，在第40位氨基酸處達(dá)到最強(qiáng)親水性峰值，為-2.224。由于親水性氨基酸的個(gè)數(shù)多于疏水性氨基酸，預(yù)測(cè)黃花蒿DXR蛋白為親水性蛋白。

用NetPhos2.0 Server預(yù)測(cè)結(jié)黃花蒿DXR蛋白磷酸化位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，在DXR有17個(gè)絲氨酸（Ser，S）磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)蘇氨酸（Thr，T）磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)酪氨酸（Tyr，Y）磷酸化位點(diǎn)。在整個(gè)氨基酸序列中，第7位氨基酸（S）、第40位氨基酸（S）的磷酸化預(yù)測(cè)值最高，為0.992，可能受蛋白磷酸化激酶磷酸化。

2.2 多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

用NCBI BLAST篩選得到14條黃花蒿DXR同源序列（表1），應(yīng)用Clustal W進(jìn)行多重序列比對(duì)分析。圖3結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中間功能區(qū)域的氨基酸序列較為保守，兩端區(qū)域的氨基酸序列差異較大，且N-端差異大于C-端差異。用MEGA5.2 軟件N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。由圖4結(jié)果可知：16個(gè)物種的DXR氨基酸序列聚集成2大分支：黃花蒿、艾菊、杭白菊、甜葉菊聚為分支Ⅰ；千金子、蓖麻、毛果楊等聚為分支Ⅱ。由傳統(tǒng)分類學(xué)可知，分支Ⅰ中的黃花蒿、艾菊、杭白菊、甜葉菊4個(gè)物種均屬菊科，分支Ⅱ中的千金子、蓖麻、毛果楊等11個(gè)物種不屬于菊科。這表明DXR是1種相對(duì)保守的蛋白，物種的進(jìn)化速度與物種DXR蛋白的進(jìn)化速度是一致的，DXR可以作為生物遺傳分析、分子進(jìn)化研究的重要因子。

2.3 DXR蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及互作網(wǎng)絡(luò)分析

2.3.1 黃花蒿DXR蛋白保守區(qū)預(yù)測(cè) 利用NCBI CDD在線分析黃花蒿DXR蛋白保守區(qū)域。圖5結(jié)果顯示，DXR蛋白含有DXP_reductoisom、DXP_redisom_C、DXPR_C 3個(gè)保守結(jié)構(gòu)區(qū)域，預(yù)測(cè)該蛋白屬于SDR 超家族、DXP_redisom_C超家族及DXPR_C超家族。

2.3.2 黃花蒿DXR蛋白結(jié)構(gòu)分析 用ExPaSy-SOPMA軟件分析DXR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。由圖6可知，該蛋白由37.08%無(wú)規(guī)則卷曲、28.81% α-螺旋、23.94%延伸鏈、10.17%β-轉(zhuǎn)角組成，無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋是其主要構(gòu)件，延伸鏈貫穿于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

利用Swiss-MODEL根據(jù)同源蛋白構(gòu)建黃花蒿DXR蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖7-A），該蛋白包含28個(gè)α-螺旋、25個(gè)β-折疊和大量無(wú)規(guī)則卷曲。通過(guò)Swiss-Pdb Wiewer構(gòu)建拉氏構(gòu)象圖（圖7-B）對(duì)預(yù)測(cè)的DXR三維模型進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)，預(yù)測(cè)模型的二面角位于黃色核心區(qū)域，其空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，該蛋白利用Swiss-MODEL同源建模得到的三維結(jié)構(gòu)的可信度極高。用VAST Search在線軟件預(yù)測(cè)DXR蛋白的功能位點(diǎn)（圖7-C），預(yù)測(cè)DXR蛋白兩端的α-螺旋、β-折疊結(jié)合部位為主要的功能位點(diǎn)。

2.3.3 黃花蒿DXR蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 根據(jù)黃花蒿DXR蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型，利用STRING交互式數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果表明，DXR在催化DXP產(chǎn)生異構(gòu)并還原生產(chǎn)MEP代謝過(guò)程中與多個(gè)蛋白發(fā)生互作，主要包括：CMS、DXS、eugene3.09030001、gw1.III.2599.1、gw1.171.35.1、gw1.VI.2744.1、estExt_Genewise1_v1.C_LG_XVIII1471、MCS、gw1.I.8813.1、HDS等（圖8）。

3 結(jié)論與討論

次生代謝產(chǎn)物是地球上最豐富的有機(jī)化合物，由于其功能特殊、用途廣泛，現(xiàn)已成為國(guó)際上研究的熱點(diǎn)、焦點(diǎn)。目前已經(jīng)有多種萜類化合物被分離提取，應(yīng)用到醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等各領(lǐng)域。青蒿素作為黃花蒿的1萜類次生代謝產(chǎn)物，因其具有抗瘧效率高、速度快、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為全球抗瘧的主要藥物。2011年，因?qū)η噍锼氐目汞懷芯孔鞒鲐暙I(xiàn)，我國(guó)的女藥學(xué)家屠呦呦獲得了拉斯克獎(jiǎng)[26]。青蒿素的獲取主要依賴于黃花蒿的生物合成，全面了解青蒿素生物合成途徑關(guān)鍵酶的功能，通過(guò)基因工程等手段調(diào)控其在植物體內(nèi)表達(dá)，獲得大量有用的青蒿素，可為提高青蒿素產(chǎn)量開(kāi)辟新的思路。

DXR在萜類物質(zhì)MEP合成途徑中具有特殊作用，可將DXP異構(gòu)化并還原生產(chǎn)MEP。黃花蒿DXR作為青蒿素生物合成的重要限速酶而倍受關(guān)注。生物信息學(xué)是當(dāng)今生命科學(xué)和自然科學(xué)的核心領(lǐng)域，是后基因組時(shí)代的重要研究方法。本研究根據(jù)NCBI上登錄的黃花蒿DXR基因序列，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)該基因及編碼蛋白進(jìn)行比對(duì)、分析、建模等研究，應(yīng)用STRING對(duì)該基因編碼蛋白進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)分析?；蛐蛄蟹治霭l(fā)現(xiàn)，該基因中A+T堿基含量較高，為55.95%，高于50%，且錯(cuò)配率較低，核苷酸穩(wěn)定。編碼蛋白氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，DXR蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為33.53，屬于不穩(wěn)定性蛋白。多序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，黃花蒿DXR與杭白菊DXR同源性最高，為98%，親緣關(guān)系最近。DXR在進(jìn)化上高度保守，可作為其他物種生物遺傳分析和分子進(jìn)化研究的重要因子。蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋是其主要結(jié)構(gòu)元件。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析表明，黃花蒿DXR可能與1-脫氧木桶糖-5-磷酸合成酶（DXS）互作。本研究結(jié)果為深入探討黃花蒿DXR蛋白功能和萜類生物合成的分子機(jī)制提供重要基礎(chǔ)信息，為提高黃花蒿青蒿素的生物合成量提供了理論支持，也為其他植物萜類等次生代謝產(chǎn)物的研究提供了一定依據(jù)。

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