應(yīng)用iTRAQ技術(shù)篩選DNT差異表達(dá)蛋白

廖秋林 張偉 彭大云 王蔚 張海燕 陳曉東

(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510010)

·論著·

應(yīng)用iTRAQ技術(shù)篩選DNT差異表達(dá)蛋白

廖秋林 張偉 彭大云 王蔚 張海燕 陳曉東*

(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510010)

目的應(yīng)用同位素標(biāo)記相對和絕對定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)(iTRAQ)篩選胚胎發(fā)育不良性神經(jīng)上皮腫瘤(DNT)差異表達(dá)蛋白。方法將DNT實(shí)體組織標(biāo)本(2例)與正常腦組織標(biāo)本(2例)，各組標(biāo)本混合后提取蛋白，進(jìn)行定量和酶解。iTRAQ標(biāo)記后進(jìn)行液相串聯(lián)質(zhì)譜分析。通過Mascot軟件進(jìn)行圖譜分析。結(jié)果實(shí)驗(yàn)匹配到的譜圖數(shù)量是82 300張，其中特有譜圖數(shù)量為57 738張，共鑒定到2 663個(gè)蛋白，16 341個(gè)肽段，其中含14 993個(gè)特有肽段。當(dāng)?shù)鞍棕S度差異倍數(shù)達(dá)到1.3倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其P值小于0.05時(shí)，視為差異蛋白，共鑒定差異蛋白225個(gè)，其中48個(gè)蛋白上調(diào)，177個(gè)蛋白下調(diào)。結(jié)論通過iTRAQ技術(shù)分析得到的DNT差異表達(dá)蛋白可靠，iTRAQ技術(shù)為篩選出有意義的DNT生物標(biāo)記物提供了一個(gè)良好的平臺。

胚胎發(fā)育不良性神經(jīng)上皮腫瘤; 蛋白質(zhì)組學(xué); 同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù); 生物標(biāo)記物

胚胎發(fā)育不良性神經(jīng)上皮腫瘤(dysembryoplastic neuroepithelial tumor,DNT)是位于幕上的膠質(zhì)神經(jīng)元混合性腫瘤，主要發(fā)生在大腦皮質(zhì)，WHO分級Ⅰ級，屬于良性腫瘤。組織學(xué)上分為單純型、復(fù)合型和非特異型3個(gè)亞型，后兩者形態(tài)學(xué)與星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤有相似處，有時(shí)診斷十分困難。雖然近年來神經(jīng)影像學(xué)和神經(jīng)病理學(xué)取得了長足發(fā)展，但存在很大的挑戰(zhàn)。DNT的發(fā)生過程可能包含細(xì)胞內(nèi)多種信號通路的協(xié)同改變，能夠研究這目前仍缺乏特異的DNT診斷標(biāo)記物，病理醫(yī)師在面對復(fù)雜型和非特異型DNT的診斷時(shí)的有效方法就是利用整體的方法認(rèn)識和考慮這些復(fù)雜的改變。蛋白質(zhì)組學(xué)可以通過對整體蛋白質(zhì)的大規(guī)模分析研究生物過程相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能的改變。

同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ) 是2004年美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司推出的一種利用同位素標(biāo)簽標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行定量研究的蛋白質(zhì)組學(xué)新興技術(shù)，相對于其他蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在定量可信度、覆蓋度及定量精度方面都有明顯的優(yōu)勢。本研究利用iTRAQ結(jié)合液相串聯(lián)質(zhì)譜 (liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry,LC-MS/MS) 對DNT組織標(biāo)本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，通過篩選DNT差異表達(dá)蛋白驗(yàn)證iTRAQ技術(shù)的可靠性并為發(fā)現(xiàn)DNT的生物標(biāo)記物創(chuàng)造條件。

材料與方法

一、材料

選取廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院神經(jīng)外科腦手術(shù)凍存標(biāo)本，其中胚胎發(fā)育不良性神經(jīng)上皮腫瘤2例，年齡18和25歲，男女各1例，以上述兩例DNT旁的正常腦組織為對照。

二、方法

①蛋白質(zhì)提取過程：稱取適量的樣品；②蛋白質(zhì)濃度測量(采用Bradford定量)，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品濃度；③聚丙烯酰胺凝膠電泳；④蛋白質(zhì)酶解；⑤iTRAQ標(biāo)記；⑥用強(qiáng)陽離子交換色譜(strong cation exchange chromatography,SCX)進(jìn)行液相分離；⑦液相串聯(lián)質(zhì)譜分析。

三、生物信息學(xué)分析

使用蛋白質(zhì)鑒定軟件Mascot2.3.02。操作時(shí)以mgf文件為原始文件，選擇UniProt-Human (non-redundant 145 584 sequences)數(shù)據(jù)庫，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

依據(jù)蛋白質(zhì)豐度水平，當(dāng)差異倍數(shù)達(dá)到1.3倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其P值小于0.05時(shí)，視為差異蛋白。

結(jié) 果

一、蛋白質(zhì)基本鑒定信息

鑒定出二級譜圖總數(shù)373 984個(gè)，匹配到的譜圖量82 300個(gè)，匹配到特有肽段的譜圖數(shù)量57 738個(gè)，鑒定到的肽段的數(shù)量16 341個(gè)，鑒定到特有肽段序的數(shù)量14 993個(gè)，總共鑒定出蛋白質(zhì)2 663個(gè)。這表明本實(shí)驗(yàn)采用的iTRAQ技術(shù)先進(jìn)可靠，篩選出了大批量的肽段和蛋白質(zhì)。

二、蛋白質(zhì)定量

在相對定量時(shí)，如果同一個(gè)蛋白質(zhì)的量在兩個(gè)樣品間沒有顯著的變化，那么其蛋白質(zhì)豐度比接近于1。當(dāng)?shù)鞍椎呢S度比即差異倍數(shù)達(dá)到1.3倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其P值小于0.05時(shí)，視該蛋白為差異蛋白。對每個(gè)蛋白質(zhì)差異倍數(shù)以2為底取對數(shù)后作出分布如下圖(圖1)。表達(dá)量上調(diào)的蛋白居于橫坐標(biāo)0位置的左側(cè)(綠色)，表達(dá)量下調(diào)的蛋白居于橫坐標(biāo)0位置的右側(cè)(紅色)。DNT與正常腦組織標(biāo)本比較，上調(diào)蛋白48個(gè)，下調(diào)蛋白177個(gè)。

圖1 蛋白質(zhì)豐度分布
Fig 1 Protein abundance distribution

三、差異蛋白的基因本體論(gene ontology,GO)富集分析

基因本體論是一套國際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系，提供了一套動態(tài)更新的標(biāo)準(zhǔn)詞匯表(controlled vocabulary)來全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性。GO總共有三個(gè)本體(ontology)，分別描述基因的分子功能(molecular function)、細(xì)胞組成(cellular component)、參與的生物過程(biological process)。我們針對鑒定出的所有差異蛋白進(jìn)行GO功能注釋分析，從而給出差異蛋白質(zhì)與哪些生物學(xué)功能顯著相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)鑒定出的上調(diào)蛋白中涉及翻譯延伸因子，rRNA連接素、碳水化合物衍生結(jié)合素、ATP:ADP反向轉(zhuǎn)運(yùn)體、枸櫞酸鹽跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體、三羧酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體、DNA結(jié)合、單鏈RNA結(jié)合、氨基葡聚糖、調(diào)理素、髓鞘結(jié)構(gòu)成分、肝磷脂、血小板衍生生長因子、翻譯調(diào)整、有機(jī)酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、羧酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯因子、三價(jià)鐵、多聚尿苷酸RNA、血管緊張素受體Ⅰ型、多巴胺受體、NAD結(jié)合蛋白、酶結(jié)蛋白、有機(jī)負(fù)跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、序列特異性DNA結(jié)合蛋白、原肌球蛋白、泛醇細(xì)胞色素-c還原酶、多聚密定二氮三烯陸環(huán)通道、聯(lián)苯芬及相關(guān)物質(zhì)氧化還原酶、脫乙?；?、血管緊張素受體等多種生物學(xué)功能。

四、差異蛋白的通路(pathway)富集分析

通路顯著性富集分析方法同基因本體論功能富集分析，是以KEGG公共數(shù)據(jù)庫里的代謝通路為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與所有鑒定到蛋白背景相比，在差異蛋白中顯著性富集的通路。通過通路顯著性富集分析確定這些差異蛋白參與組蛋白代謝、剪接體、細(xì)胞色素P450藥物代謝、人T細(xì)胞白血病病毒感染、抗原加工及傳遞、類固醇激素合成、脂肪酸延長、細(xì)胞周期等多種代謝及信號通道。

討 論

本實(shí)驗(yàn)采用iTRAQ技術(shù)，是目前較先進(jìn)和可靠的高通量蛋白質(zhì)定量鑒定技術(shù)。質(zhì)譜儀器采用Q-Exactive，該儀器的優(yōu)勢在于具有很高的分辨能力和質(zhì)量精確度，可以廣泛適用于小分子和大分子分析，尤其適合樣品高度復(fù)雜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域。肽段母離子質(zhì)量的精確測定可以顯著減小假陽性鑒定結(jié)果的出現(xiàn)概率，因此鑒定質(zhì)量可靠。

本研究共鑒定了中國大陸黃種人DNT相對于正常腦組織的差異蛋白質(zhì)225個(gè)，其中上調(diào)蛋白質(zhì)48個(gè)，下調(diào)蛋白質(zhì)177個(gè)。上調(diào)蛋白具體包括肌球蛋白輕鏈可變區(qū)域，人類組蛋白1，甘油三磷酸脫氫酶，甘油甲酸酯反向轉(zhuǎn)運(yùn)體，S100A8，羥酰谷胱甘肽水解酶，髓鞘相關(guān)糖蛋白，鐵蛋白輕鏈，肌動蛋白結(jié)合蛋白，天冬氨酸酰酶，可溶性家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9(鈉/氫交換器)，髓磷脂堿性蛋白，WDR44，載脂蛋白D，S100A4，細(xì)胞色素b-c1復(fù)合亞單位7，核酸內(nèi)切酶封閉領(lǐng)域1蛋白，β1微管蛋白，非常規(guī)肌球蛋白Id，巨大圓盤相關(guān)蛋白4，乳腺癌放大序列1，神經(jīng)微絲重鏈多肽，半乳凝結(jié)蛋白3，凝血酶原，尿苷酸結(jié)合蛋白，肌肽合酶，細(xì)胞角蛋白10Ⅰ型，S100A9，乳鐵蛋白，白鼬，S期激酶相關(guān)蛋白1，丙酮酸脫氫酶E1，磺基轉(zhuǎn)移酶4A1，α球蛋白，中性粒細(xì)胞防衛(wèi)素1，α血紅素穩(wěn)定蛋白，三聯(lián)組氨酸核算結(jié)合蛋白1，細(xì)胞粘附分子4，熱休克蛋白72，氯芐乙胺4，磷酸神經(jīng)膜，二氫尿嘧啶脫氫酶依賴蛋白脫乙?；?。

在上調(diào)的蛋白質(zhì)中，NF蛋白及髓磷脂堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)是我們比較熟悉和常用的蛋白，已經(jīng)在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤常規(guī)應(yīng)用，但缺乏特異性和敏感性。S100家族被視為重要的一群蛋白，與腫瘤細(xì)胞生長、浸潤、轉(zhuǎn)移過程中所發(fā)生的基因和分子變化，對臨床診治腫瘤有重要作用。本實(shí)驗(yàn)鑒定出S100A4、S100A8和S100A9三個(gè)家族成員。S100A4蛋白具有減少腫瘤細(xì)胞間黏附，促進(jìn)細(xì)胞異常增生，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解和重塑增加腫瘤細(xì)胞運(yùn)動性，促進(jìn)腫瘤血管生成等作用[1]。S100A8可通過清除氧化物阻止過度氧化對機(jī)體的損傷，促進(jìn)傷口愈合，表現(xiàn)為抗炎作用[2]。除炎癥外，S100A8 在多種原發(fā)和浸潤性腫瘤、多種自身免疫性疾病以及心血管疾病中發(fā)揮重要作用。 S100A9參與細(xì)胞分化、增殖、蛋白磷酸化、突變細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移等過程。已有研究發(fā)現(xiàn)，S100A9 在結(jié)腸癌、肺癌、甲狀腺癌、膀胱癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，且與腫瘤組織的分化程度呈負(fù)相關(guān)[3～6]。髓鞘相關(guān)糖蛋白通過介導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞與軸突的相互作用參與髓鞘的形成及其完整性的維持，同時(shí)也是髓鞘來源的神經(jīng)生長抑制因子的主要成分，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的不同階段，顯示不同的功能：即發(fā)育期促進(jìn)軸突生長，成熟期抑制軸突生長[7]。微管蛋白是微管的組成成分，在細(xì)胞中起重要的細(xì)胞骨架作用。在神經(jīng)系統(tǒng)，微管系統(tǒng)的穩(wěn)定性也是維持胞體和突觸間營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)的基礎(chǔ)。已證實(shí)微管蛋白與帕金森病、阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病的關(guān)鍵蛋白密切相關(guān)。乳鐵蛋白是一種相對分子質(zhì)量為80 kD的球狀糖蛋白。目前已作為一種安全、有效、新型的腦靶向功能分子已備受人們的青睞，在腫瘤治療領(lǐng)域中也顯示了巨大的發(fā)展前景，但作為藥物載體的穩(wěn)定性、有效性和靶向性還應(yīng)該持續(xù)探索[8,9]。防衛(wèi)素最早發(fā)現(xiàn)并定名于1980年，屬于肽(包括多肽)類物質(zhì)，具有對抗、殺滅細(xì)菌，抗真菌、抗病毒、抑制細(xì)胞毒作用及溶胞作用。還可能在動脈粥樣硬化患者的腦動脈內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)層平滑肌細(xì)胞中發(fā)揮作用，有些防衛(wèi)素具抑制細(xì)胞呼吸活動能力，或?qū)?xì)胞體積、趨化性和有絲分裂起調(diào)節(jié)作用，抑制天然殺傷細(xì)胞活動[10]。三聯(lián)組氨酸核苷酸結(jié)合蛋白1(histidine triad nucleotide-binding protein 1,HINT1)廣泛參與腫瘤、神經(jīng)精神疾病等人類疾病的病理生理過程，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，探討其酶活性、腫瘤抑制、神經(jīng)病理之間的內(nèi)在聯(lián)系是一個(gè)重要的研究方向[11]。氯芐乙胺(septin)蛋白是一系列分子量在30～65 ku之間，并在結(jié)構(gòu)上比較保守的蛋白家族。最早的septin 蛋白是在酵母中發(fā)現(xiàn)的，隨后發(fā)現(xiàn)在其他真核生物體內(nèi)，如真菌、哺乳動物等也廣泛存在著septin蛋白家族。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其在人體內(nèi)的作用越來越突出，參與了細(xì)胞分裂、物質(zhì)運(yùn)輸和細(xì)胞凋亡等重要過程，并與人類多種疾病有著重要關(guān)系，尤其是與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系密切[12]。

有意思的是，鑒定出上調(diào)蛋白48個(gè)，而下調(diào)蛋白177個(gè)，宏觀上說明DNT較正常腦組織代謝有降低，合成的多達(dá)177種蛋白的數(shù)量減低，更傾向發(fā)育不良，所以是一種特殊的神經(jīng)上皮腫瘤，預(yù)后較好，與神經(jīng)上皮惡性變有本質(zhì)上的不同。

基于iTRAQ技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究為腦腫瘤尤其是與發(fā)育不良相關(guān)的腫瘤提供了廣泛而實(shí)用的分子生物學(xué)信息。本文對DNT相對于正常腦組織的差異蛋白做了一個(gè)全面篩選實(shí)驗(yàn)，鑒定出了225種差異蛋白，但對這些蛋白在DNT發(fā)生發(fā)展中的具體病理生理機(jī)制，其生物學(xué)功能及參與的信號通路對DNT的具體影響機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。對備選的生物標(biāo)記物的特異性仍有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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ApplicationofiTRAQtechnologyinscreeningdifferentiallyexpressedproteinsofdysembryoplasticneuroepithelialtumor

LIAOQiulin,ZHANGWei,PENGDayun,WANGWei,ZHANGHaiyan,CHENXiaodong

DepartmentofPathology,GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou510010,China

ObjectiveTo screen differentially expressed proteins of dysembryoplastic neuroepithelial tumor (DNT) by the proteomics analysis using isobaric tags for relative and absolute quantification (iTRAQ) combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS /MS).MethodsThe patients were classified in 2 groups:DNT (n=2) and normal brain tissue (n=2). After quantification and enzymolysis of the protein extract from the admix specimens of the two groups,the iTRAQ regents 113 and 117 were used to label the peptides of the two groups,respectively. Then，the mixture of the peptides was analyzed by 2D-LC-MS /MS. The MS data were searched against the International UniProt-Human using the Mascot2.3.02 for peptide identification and quantification.ResultsA total of 2663 proteins were identified from the International UniProt-Human. Based on the condition of screening differentially expressed proteins,comparing with normal brain tissue,48 proteins were significantly up-regulated (gt;1.3-fold) and 177 were significantly down-regulated.ConclusionThe differentially expressed proteins of DNT identified by proteomic analysis using iTRAQ are reliable. The iTRAQ technology provides a good platform to identify more significant biomarkers of DNT.

Dysembryoplastic neuroepithelial tumor (DNT); Proteomics; Isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ); Biomarker

1671-2897(2016)15-506-04

R 739

A

廣東省科技計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(2012B031800177)

廖秋林，主治醫(yī)師，E-mail:lin_success@126.com

*通訊作者：陳曉東，主任醫(yī)師，E-mail:cxdong1966@yahoo.com.cn

2015-08-16；

2015-10-18)