截斷型載脂蛋白E對神經(jīng)元tau蛋白和神經(jīng)細(xì)絲磷酸化的影響

董 翔 常 庚

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連 116011)

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截斷型載脂蛋白E對神經(jīng)元tau蛋白和神經(jīng)細(xì)絲磷酸化的影響

董 翔 常 庚

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連 116011)

目的 探討截斷型載脂蛋白(Apo)E對神經(jīng)元中tau蛋白和神經(jīng)細(xì)絲磷酸化的影響。方法 構(gòu)建真核表達(dá)重組體pEGFP-T-ApoE4，培養(yǎng)小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞系，并將pEGFP、pEGFP-ApoE4和pEGFP-T-ApoE4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞，采用免疫印跡法測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)磷酸化tau蛋白和神經(jīng)細(xì)絲含量。結(jié)果 不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組N2a細(xì)胞中磷酸化tau蛋白表達(dá)明顯不同，pEGFP-T-ApoE4組>pEGFP-ApoE4組>pEGFP-C3組(P<0.05)；不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組N2a細(xì)胞中磷酸化神經(jīng)細(xì)絲表達(dá)不同，pEGFP-T-ApoE4組>pEGFP-ApoE4組>pEGFP-C3組(P<0.05)。結(jié)論 截斷型ApoE能夠促進(jìn)N2a細(xì)胞tau蛋白和神經(jīng)細(xì)絲磷酸化，推測其可能是增加阿爾茨海默病(AD)患病風(fēng)險及促進(jìn)病程進(jìn)展的原因之一。

截斷型載脂蛋白E；N2a細(xì)胞；tau蛋白；神經(jīng)細(xì)絲；磷酸化

阿爾茨海默病(AD)以失語、失用、失認(rèn)、記憶障礙、執(zhí)行功能障礙及人格、行為改變等為特征〔1，2〕，AD患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)〔3〕，其主要病理基礎(chǔ)是老年斑形成和神經(jīng)元纖維纏結(jié)。研究表明〔4，5〕，載脂蛋白(Apo)E-ε4等位基因能顯著增加神經(jīng)元纖維纏結(jié)數(shù)量，而神經(jīng)元纖維纏結(jié)數(shù)量與AD程度呈正比。截斷型ApoE是ApoE4被蛋白酶水解C末端272～299位氨基酸殘基后的片段，研究表明〔6〕，截斷型ApoE4大量存在于神經(jīng)元纖維纏結(jié)中，并且可以加劇AD動物模型病理改變進(jìn)程。微管相關(guān)tau蛋白和神經(jīng)細(xì)絲過度磷酸化是形成神經(jīng)元纖維結(jié)的主要成分〔7〕，本研究探討ApoE4與tau蛋白和神經(jīng)細(xì)絲磷酸化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞系N2a細(xì)胞購自上海信則生物，胎牛血清(FBS)、Opti-MEM購自美國Hyclone公司，pEGFP-ApoE4由大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供，pEGFP-C3、DNA純化試劑盒及核酸片段回收試劑盒均購自美國Clontech公司，限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ、T4 DNA連接酶均購自美國NEB公司，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司，ApoE多克隆抗體購自北京利德曼生化公司，tau磷酸化抗體和神經(jīng)細(xì)絲磷酸化抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞系N2a細(xì)胞用FBS培養(yǎng)基在5%CO2條件下于37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液3 d更換一次，待細(xì)胞達(dá)到80%豐度左右時，進(jìn)行傳代或試驗。

1.3 真核表達(dá)重組體pEGFP-T-ApoE4的構(gòu)建 利用Primer5.0軟件設(shè)計引物，上游：5′-TTTTGAATTCTGATGAAGGTTCTGTGGGCTGCG-3′，加入EcoRⅠ酶切位點；下游：5′-TTTTGGATCCTCAGTCTTCCACCAGGGGCTCG-3′，加入BamHⅠ酶切位點和終止密碼子。用pEGFP-ApoE4當(dāng)模板擴(kuò)增截斷型ApoE4 cDNA片段，按照擴(kuò)增參數(shù)進(jìn)行設(shè)定，共循環(huán)25次后，繼續(xù)72℃延伸10 min。將擴(kuò)增片段與pEGFP-C3質(zhì)粒分別進(jìn)行BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，于1%瓊脂糖電泳后，回收片段，將截斷型-ApoE4 cDNA片段和pEGFP-C3大片段按照3.5∶1進(jìn)行混合，將T4 DNA連接酶加入后，在15℃水浴中進(jìn)行片段連接16 h。將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌HB101，進(jìn)行BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，獲得pEGFP-T-ApoE4重組體，進(jìn)行大量質(zhì)粒制備并進(jìn)行純化。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 ①pEGFP-T-ApoE4質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前1 d，將培養(yǎng)細(xì)胞用胰蛋白酶進(jìn)行消化后計數(shù)，并接種在預(yù)先放置poly-L-lysine涂層小皿的24孔板中，培養(yǎng)24 h，取一定量重組質(zhì)粒加入1/10體積3 mol/L乙酸鈉和2倍體積無水乙醇，于冰上放20 min，在4℃條件下于12 000 r/min進(jìn)行離心10 min，將上清棄去，用70%乙醇進(jìn)行洗滌2次，棄去上清，于無菌超凈臺晾干，按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。②質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：取純化質(zhì)粒DNA 2.7 μg稀釋至250 μl，取Lipofectamine2000 5 μl稀釋到250 μl，37℃放5 min，混勻靜置20 min，加入到含OPTI-MEM 1.5 ml的6孔板中，混勻，室溫培養(yǎng)6 h，換FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，加入800 μg/ml的G418進(jìn)行篩選2 w，3 d換液1次。2 w后400 μg/ml的G418篩選1個月，存活細(xì)胞為轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞。③穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并表達(dá)ApoE4的N2a細(xì)胞接種于250 ml培養(yǎng)瓶中，至85%豐度時，進(jìn)行無血清培養(yǎng)基2次洗滌后，預(yù)孵育2 h，無血清培養(yǎng)基洗滌1次后，過夜培養(yǎng)。收集培養(yǎng)基并保存。1 w收集2次，連續(xù)1個月。進(jìn)行離心、濃縮，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢查ApoE含量，并保存待用。

1.5 蛋白樣本的制備與測定 將N2a細(xì)胞接種在六孔板中培養(yǎng)25～35 h，使細(xì)胞豐度達(dá)到75%左右，轉(zhuǎn)染pEGFP、pEGFP-ApoE4和pEGFP-T-ApoE4質(zhì)粒后，培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞生長情況。移除培養(yǎng)基，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，加入200 μl細(xì)胞裂解液中進(jìn)行裂解后，將細(xì)胞刮下并移至EP管中進(jìn)行超聲破碎3次，每次10 s，進(jìn)行12 000 r/min離心10 min后，取上清。采用Western印跡測定蛋白含量：分別采用10%和7.5%分離膠分離tau蛋白和神經(jīng)細(xì)絲蛋白；向制備好的樣品中加入相應(yīng)體積4倍上樣緩沖液，振蕩20 s，水浴鍋煮沸5 min，將樣品用微量加樣器置入各泳道，根據(jù)蛋白含量不同加入不同體積，使各組蛋白總量一致。加樣后進(jìn)行蛋白電泳分離和電轉(zhuǎn)移；利用ECL顯色系統(tǒng)進(jìn)行免疫印跡顯色，并用掃描儀進(jìn)行掃描，利用Image-Pro Plus圖像處理軟件進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 利用SPSS17.0統(tǒng)計進(jìn)行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和表達(dá)情況 分別將pEGFP-C3、pEGFP-ApoE4、pEGFP-T-ApoE4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過的N2a細(xì)胞置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，除對照組細(xì)胞外，各轉(zhuǎn)染細(xì)胞均出現(xiàn)較強(qiáng)的熒光(圖1)。利用ApoE多克隆抗體進(jìn)行Western印跡檢測，四組轉(zhuǎn)染細(xì)胞均出現(xiàn)顯色條帶，對照組和pEGFP-C3、pEGFP-ApoE4轉(zhuǎn)染組條帶為34 kD，pEGFP-T-ApoE4轉(zhuǎn)染組為30 kD；以對照組為內(nèi)參照，pEGFP-ApoE4轉(zhuǎn)染組和pEGFP-T-ApoE4轉(zhuǎn)染組ApoE表達(dá)量分別為2.73±0.24和2.87±0.21，均高于pEGFP-C3轉(zhuǎn)染組蛋白表達(dá)量(0.46±0.12)，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

圖1 熒光顯微鏡下不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞后表達(dá)熒光情況

圖2 不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞后蛋白表達(dá)情況(Western印跡)

2.2 截斷型ApoE過表達(dá)對tau蛋白和神經(jīng)細(xì)絲磷酸化影響 不同轉(zhuǎn)染組N2a細(xì)胞中磷酸化tau蛋白表達(dá)不同，pEGFP-T-ApoE4組>pEGFP-ApoE4組>pEGFP-C3組；不同轉(zhuǎn)染組N2a細(xì)胞中磷酸化神經(jīng)細(xì)絲表達(dá)不同，pEGFP-T-ApoE4組>pEGFP-ApoE4組>pEGFP-C3組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1、圖3)。

表1 不同轉(zhuǎn)染組N2a細(xì)胞中磷酸化tau蛋白和神經(jīng)細(xì)絲表達(dá)情況

圖3 不同轉(zhuǎn)染組N2a細(xì)胞中磷酸化tau蛋白和神經(jīng)細(xì)絲表達(dá)情況(Western印跡)

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)〔8，9〕，ApoE在AD病程進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，其同分異構(gòu)體ApoE4是AD的易感因子，能夠增加患病風(fēng)險并加速病程進(jìn)展。在AD病理過程中，神經(jīng)纖維纏結(jié)形成是主要病理改變，而過度磷酸化的tau蛋白和神經(jīng)細(xì)絲是神經(jīng)纖維纏結(jié)的重要組成成分〔10〕。有研究指出〔11〕，神經(jīng)纖維纏結(jié)中存在大量的截斷型ApoE4，而不是全長的ApoE4，提示截斷型ApoE4可能參與了神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成。

本研究成功構(gòu)建真核表達(dá)體，pEGFP-ApoE4和pEGFP-T-ApoE4質(zhì)粒在培養(yǎng)的細(xì)胞中成功表達(dá)。神經(jīng)細(xì)絲是神經(jīng)細(xì)胞中一種中等纖維，tau蛋白是神經(jīng)細(xì)胞中微管相關(guān)蛋白，兩者共同維持了神經(jīng)細(xì)胞的正常形態(tài)，能夠促進(jìn)微管組裝并維持穩(wěn)定和正常功能〔12〕，過度磷酸化的神經(jīng)細(xì)絲能夠抑制其與微管的相互作用，破壞細(xì)胞正常的構(gòu)架結(jié)構(gòu)，而磷酸化的tau蛋白則喪失生物學(xué)功能和活性，導(dǎo)致神經(jīng)元退化，是AD發(fā)病的重要原因〔13〕。本研究說明ApoE4過度表達(dá)能夠促進(jìn)tau蛋白磷酸化，而截斷型ApoE4過表達(dá)促進(jìn)tau蛋白磷酸化的作用要強(qiáng)于全長的ApoE4。ApoE4過度表達(dá)可以加速神經(jīng)細(xì)絲磷酸化，而截斷型ApoE4過表達(dá)對神經(jīng)細(xì)絲磷酸化的作用要強(qiáng)于全長ApoE4。綜上，ApoE4和截斷型ApoE4可以在N2a細(xì)胞中實現(xiàn)表達(dá)，過度表達(dá)的ApoE4和截斷型ApoE4均能夠?qū)е律窠?jīng)細(xì)絲和tau蛋白磷酸化，而截斷型ApoE4的作用更強(qiáng)，提示截斷型ApoE4可能是增加AD發(fā)病風(fēng)險和促進(jìn)AD病程進(jìn)展的原因之一，具體作用過程尚待進(jìn)一步研究。

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〔2015-01-21修回〕

(編輯 安冉冉/曹夢園)

常 庚(1981-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事癡呆研究。

董 翔(1975-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管疾病及癡呆研究。

R743

A

1005-9202(2016)20-4991-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.021