腎虛肝郁證遲發(fā)性性腺功能減退癥大鼠模型的建立與評(píng)價(jià)

周興，周青，賴永金

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007；2.萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院，江西萍鄉(xiāng)337000）

·基礎(chǔ)研究·

腎虛肝郁證遲發(fā)性性腺功能減退癥大鼠模型的建立與評(píng)價(jià)

周興1，周青1，賴永金2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007；2.萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院，江西萍鄉(xiāng)337000）

目的建立“腎虛肝郁證”遲發(fā)性性腺功能減退癥（Late onset hypogonadism，LOH）動(dòng)物模型，并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法以中醫(yī)理論“房勞過(guò)度傷腎”、“郁久傷肝”為指導(dǎo)，采用“退役種鼠（40周齡）+復(fù)合情志刺激+孤養(yǎng)”方法，建立“腎虛肝郁證”LOH動(dòng)物模型，與正常組（8周齡）比較，以血清總睪酮、懸尾實(shí)驗(yàn)、睪丸間質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、睪酮合成相關(guān)酶以及Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)為指標(biāo)。結(jié)果模型組大鼠出現(xiàn)一系列典型的LOH精神、心理、體能改變，與正常組比較，模型組大鼠血清總睪酮水平明顯降低，懸尾不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，睪丸組織Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)，睪酮合成相關(guān)酶類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（Steroidogenic Acute Regulatory Protein，StAR）[13]、細(xì)胞色素膽固醇側(cè)鏈裂解酶（Cytochrome P450 side-chain cleavage，P450scc）[14]、3β-羥甾脫氫酶（3beta-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD）mRNA和蛋白表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；模型組睪丸間質(zhì)變少，睪丸間質(zhì)細(xì)胞線粒體數(shù)量減少，出現(xiàn)水腫，線粒體嵴消失。結(jié)論“退役種鼠+復(fù)合情志刺激+孤養(yǎng)”方法復(fù)制“腎虛肝郁證”LOH模型切實(shí)可行，有較高的實(shí)用價(jià)值。

遲發(fā)性性腺功能減退癥；動(dòng)物模型；腎虛肝郁證

遲發(fā)性性腺功能減退癥（Late onset hypogonadism，LOH），普遍存在于中老年男性，患者出現(xiàn)體能下降、神經(jīng)精神異常、性功能減退等一系列臨床癥狀，嚴(yán)重影響了中老年男性的日常生活工作。其發(fā)

病主要是增齡導(dǎo)致的雄激素水平下降[1]，其他諸多因素，如內(nèi)分泌改變、慢性應(yīng)激、肥胖、不良生活方式、惡劣生活環(huán)境、生理-心理-社會(huì)改變等，也參與其中。因此，在LOH動(dòng)物模型復(fù)制中，老齡、低睪酮水平應(yīng)作為關(guān)鍵性觀察因素。中醫(yī)歷代文獻(xiàn)無(wú)“LOH”之名，可歸屬于“郁證”、“臟躁”、“陽(yáng)痿”、“不寐”“腎虛”等范疇，《素問(wèn)·上古天真論》云：“六八，陽(yáng)氣衰竭于上，面焦，發(fā)鬢斑白；七八，肝氣衰，筋不能動(dòng)；八八，天癸竭，精少，腎臟衰”?！澳I虛肝郁”證候貫穿于LOH的整個(gè)發(fā)展過(guò)程[2]。因此，在LOH動(dòng)物模型復(fù)制中，本研究又以中醫(yī)理論“郁久傷肝”、“房勞過(guò)度傷腎”為指導(dǎo)，選擇退役種鼠（房勞過(guò)度），采用孤養(yǎng)、慢性應(yīng)激等情志刺激（久郁），試圖模擬LOH的中醫(yī)發(fā)病過(guò)程，構(gòu)建“腎虛肝郁證”LOH動(dòng)物模型，并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物（1）造模組大鼠：SPF級(jí)Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠（退役種鼠），40周齡，體質(zhì)量（400±50）g，40只。購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001；（2）正常對(duì)照組大鼠：SPF級(jí)SD雄性大鼠，8周齡，體質(zhì)量230～250 g，15只。購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004。均飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，SPF級(jí)動(dòng)物專用飼料飼養(yǎng)，恒定溫度（21±3）℃、濕度（75±5）%，光-暗周期、動(dòng)物攝食及飲水條件按造模需要設(shè)定。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑大鼠血清睪酮檢測(cè)用ELISA試劑盒（上海巧伊生物科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：JEN-03），TRIZOL試劑（美國(guó)BIOMIGA公司），SYBR Green qRCR Mix（美國(guó)GeneCopoeia公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)GeneCopoeia公司），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：P0010），羊抗鼠二抗（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：CW0102），羊抗兔二抗（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：CW0103）。

1.1.3 主要儀器5424R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf），PCR儀（德國(guó)Eppendorf），Tannon1600R型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能），定量PCR儀（美國(guó)Life Technologies），VE 186轉(zhuǎn)移電泳槽（上海天能），SIMSV0000超純水儀（美國(guó)Millipore），Tanon 5500全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能）。

1.2 方法

1.2.1 造模方法以中醫(yī)“房勞過(guò)度傷腎”為理論基礎(chǔ)，選擇雄性SD退役種鼠（40周齡，40只），復(fù)制腎精虧虛證；同時(shí)參考金光亮[3-4]、周力[5]、于琦[6]等用于復(fù)制肝郁證的復(fù)合情志刺激造模法，每籠一只孤養(yǎng)，每日隨機(jī)給予以下不良刺激中的一種：（1）禁水（24 h）；（2）晝夜顛倒（8∶00-18∶00將動(dòng)物房門關(guān)上、拉下窗簾，置于黑暗環(huán)境；18∶00-8∶00打開日光燈，并使房間內(nèi)照度保持在300 Lux）；（3）禁食（24 h）；（4）夾尾（用25 mm長(zhǎng)尾票夾在距尾端1 cm處夾住鼠尾，30 min）；（5）噪音（70分貝，持續(xù)2 h）。每日1種，每種刺激不連續(xù)使用，每周隨機(jī)休息2 d，連續(xù)4周。正常對(duì)照組大鼠正常條件飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。

1.2.2 動(dòng)物分組造模完成后，斷尾采血0.8～1.2 mL，離心管分裝，3 000 r/min，離心10 min，分離出血清，-80℃冰箱冷凍保藏，ELISA法檢測(cè)血清睪酮濃度。參照何清湖[7]、周興[8]等的方法，統(tǒng)計(jì)得出15只8周齡SD雄性大鼠血清睪酮10%位數(shù)，以此為切點(diǎn)值，凡是經(jīng)復(fù)合情志刺激造模后，大鼠血清睪酮水平均低于該切點(diǎn)值的作為L(zhǎng)OH大鼠模型。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，15只8周齡SD雄性大鼠血清睪酮10%位數(shù)為1.91 ng/mL，以TT 1.91 ng/mL為切點(diǎn)值，40周齡SD雄性退役種鼠中，共有34只復(fù)合納入標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)選取6只，設(shè)為模型組；隨機(jī)選取8周齡SD雄性大鼠6只，設(shè)為正常對(duì)照組。

1.2.3 樣本取材造模及分組完成后，正常條件下繼續(xù)飼養(yǎng)4周，于末次給藥24 h后處死動(dòng)物，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。20%烏拉坦腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置并離心后取上清液分裝，-80℃凍存待檢。取一側(cè)睪丸置4%多聚甲醛固定，另一側(cè)睪丸取出適量組織置于凍存管，-80℃保存?zhèn)溆?，另取適量睪丸組織置2.5%戊二酸PE管內(nèi)固定。

1.2.4 大鼠一般情況觀察造模及實(shí)驗(yàn)期間密切觀察大鼠毛色、精神狀態(tài)、體質(zhì)量、活動(dòng)、飲水、飲食等情況變化。

1.2.5 大鼠懸尾試驗(yàn)（Tail suspension test）[9]本實(shí)驗(yàn)于造模前1 d、造模完成后第1天、第28天進(jìn)行。將大鼠尾端2 cm的部位固定在一水平木板上（木板離地1 m左右），使動(dòng)物呈倒掛狀。懸掛兩側(cè)用板隔開動(dòng)物視線，動(dòng)物為克服不正常的體位而掙扎活動(dòng)，但活動(dòng)一定時(shí)間后，出現(xiàn)間斷性“不動(dòng)”，顯示“失望”狀態(tài)。計(jì)算6 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間，并同時(shí)觀察大鼠掙扎幅度及抑郁狀態(tài)。此實(shí)驗(yàn)?zāi)芤欢ǔ潭鹊胤从硠?dòng)物的肌力及抑郁程度。

1.2.6 大鼠睪丸系數(shù)睪丸系數(shù)=雙側(cè)睪丸質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。

1.2.7 睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察采用HE染色，光鏡下觀察各組織形態(tài)學(xué)改變，在湖南中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室完成。

1.2.8 睪丸組織超微結(jié)構(gòu)觀察電鏡下觀察睪丸間質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院電鏡室完成。

1.2.9 血清睪酮測(cè)定采用ELISA法，根據(jù)睪酮ELISA試劑盒說(shuō)明書操作，在湖南師范大學(xué)生命科學(xué)院完成。

1.2.10 睪丸組織睪酮合成相關(guān)酶、Caspase-3 mRNA表達(dá)采用Real-time PCR法。根據(jù)Trizol RNA提取試劑盒說(shuō)明書方法提取睪丸組織總RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，確定Real-time PCR的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參數(shù)如下：見表1-2。

表1 Real-time PCR反應(yīng)體系

表2 Real-time PCR反應(yīng)條件參數(shù)

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找基因序列，設(shè)計(jì)Real-time PCR引物序列如下：StAR上游引物5’-G C A A A A G G C C T T G G G C A T A C-3’，StAR下游引物5’–T C T G T C C A T G G G C T G G T C T A-3’；P450 scc上游引物5’–T C A G C G A T G A C C T A T T C C G C-3’，P450 scc下游引物5’–A G T C T G G A G G C A T G T T G A G C-3’；3β-HSD上游引物5’–T G T C A T T G A T G T C T C A C A T G T C C-3’，3β-HSD下游引物5’-A G T A G A T G A A G G C T G G C A C A C-3’；Caspase-3上游引物5’-T C T A C C G C A C C C G G T T A C T A-3’，Caspase-3下游引物5’-C G T A C A G T T T C A G C A T G G C G-3’；ACTIN上游引物5’–A C T A T C G G C A A T G A G C G G T T-3’，ACTIN下游引物5’–A A T G C C T G G G T A C A T G G T G G-3’。

使用Life Technologies公司的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔCt法，計(jì)算目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。

1.2.11 睪丸組織睪酮合成相關(guān)酶、Caspase-3蛋白表達(dá)采用Western blot法。取大鼠睪丸組織，按20 mg：150～250 μL比例，加入RIPA裂解液，用玻璃勻漿器于冰上裂解勻漿，BCA工作液測(cè)定樣品蛋白濃度，SDS-PAGE電泳2～3 h，至溴酚蘭剛跑出即終止，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜2 h，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1～2 h，加入用TBST稀釋的一抗（4℃孵育過(guò)夜），再加入用TBST稀釋的HRP標(biāo)記二抗（室溫孵育1 h），孵育結(jié)束后，ECL發(fā)光顯色液顯色，在全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中拍照，曝光30、60、90 s，保存圖片，并用Lab-Works軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

正常組：大鼠一般情況良好，運(yùn)動(dòng)活潑有力，反應(yīng)敏捷，眼睛明亮有神，食欲健旺，鼠毛柔順濃密，潔凈有光澤，肌肉發(fā)達(dá)，脂肪豐滿，體質(zhì)量均勻增長(zhǎng)。模型組：經(jīng)4周的造模周期，大鼠出現(xiàn)精神萎靡，倦臥少動(dòng)，甚者蜷縮至墊料下面，眼睛暗淡少神，進(jìn)食減少，鼠毛枯干蓬亂萎黃，污濁無(wú)光澤，體質(zhì)量無(wú)明顯增長(zhǎng)。

2.2 造模組大鼠體質(zhì)量、懸尾試驗(yàn)、血清睪酮情況及與正常組比較

造模組大鼠造模前、后體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示雄性退役種鼠經(jīng)復(fù)合情志刺激

造模后，體質(zhì)量變化不明顯。

造模組大鼠造模前、后以及與正常對(duì)照組比較，大鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），提示老齡大鼠的行為能力較青年大鼠已經(jīng)出現(xiàn)下降，表現(xiàn)出肌力降低、一定程度的抑郁等，經(jīng)復(fù)合情志刺激造模后，其行為能力出現(xiàn)進(jìn)一步下降。

造模后，造模組大鼠血清睪酮水平與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示老齡大鼠血清睪酮水平明顯低于青年大鼠，符合LOH動(dòng)物模型要求。見表3。

表3 兩組大鼠造模前后情況比較（±s）

表3 兩組大鼠造模前后情況比較（±s）

注：與本組造模前比較▲P＜0.01；與正常對(duì)照組比較△P＜0.01。

組別造模組正常對(duì)照組t P n 40 15體質(zhì)量（g）造模前造模后613.65±54.66602.97±54.48△-222.19±19.52 38.152 0.000懸尾試驗(yàn)（s）造模前造模后睪酮（ng/mL）造模后258.43±4.30289.60±4.94▲△1.43±0.60△-186.47±6.443.95±1.33 63.372-9.728 0.0000.000

2.3 造模后兩組大鼠情況比較

造模完成后，正常條件下繼續(xù)飼養(yǎng)4周，比較兩組大鼠造模后第1天、第28天情況變化。

2.3.1 睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察病理切片顯示，正常對(duì)照組大鼠各級(jí)生精細(xì)胞發(fā)育正常，層次清晰，睪丸間質(zhì)正常。模型組大鼠初級(jí)精母細(xì)胞數(shù)量減少，精子細(xì)胞壞死紊亂，大量吞噬細(xì)胞產(chǎn)生，精子大量減少，睪丸間質(zhì)變少，細(xì)胞與細(xì)胞間分界不清。見圖1。

圖1 睪丸組織HE染色圖（×400）

2.3.2 睪丸組織超微結(jié)構(gòu)觀察電鏡結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞線粒體多，線粒體聚集，形成線粒體鞘，線粒體體積大，線粒體嵴清晰，線粒體無(wú)水腫。模型組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中線粒體數(shù)量明顯減少，線粒體體積小，部分線粒體水腫，線粒體嵴不清晰，嵴水腫。見圖2。

2.3.3 兩組大鼠體質(zhì)量、睪丸指數(shù)、懸尾試驗(yàn)、睪酮濃度變化造模后第1天、第28天比較，模型組在體質(zhì)量、懸尾不動(dòng)時(shí)間、睪酮濃度方面無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；正常對(duì)照組體質(zhì)量增加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組懸尾不動(dòng)時(shí)間、睪丸指數(shù)、睪酮濃度與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表4。

圖2 睪丸間質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)圖

2.3.4 兩組大鼠睪酮合成相關(guān)酶、Caspase-3 mRNA表達(dá)（RT-PCR）兩組造模后第28天比較，模型組Caspase-3 mRNA表達(dá)明顯升高，StAR、P450scc、3β-HSD mRNA表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表5。

2.3.5 兩組大鼠睪酮合成相關(guān)酶、Caspase-3蛋白表達(dá)（Western Blot）兩組造模后第28天比較，模型組Caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高，StAR、P450scc、3β-HSD蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表6、圖3。

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于LOH動(dòng)物模型的復(fù)制，主要有以下方法：（1）自然老化造模[10]；（2）化學(xué)藥物誘導(dǎo)

造模，藥物如環(huán)磷酰胺[7]。自然老化造模一般用18-20月齡的大鼠，該模型與LOH的生物學(xué)特性較為接近，但造模周期太長(zhǎng)，國(guó)內(nèi)大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心都不生產(chǎn)，因此來(lái)源稀少，價(jià)格昂貴。利用環(huán)磷酰胺的生殖毒性，造成睪丸間質(zhì)細(xì)胞受損、睪酮合成酶活性降低，睪酮水平下降，能在一定程度模擬LOH特征，但需要使用外源性藥物干預(yù)，同時(shí)對(duì)于LOH存在的自主神經(jīng)紊亂等癥狀難于復(fù)制。同時(shí)，國(guó)內(nèi)針對(duì)LOH的中醫(yī)證候模型的復(fù)制還幾乎是空白。

表4 造模后兩組大鼠體質(zhì)量、睪丸指數(shù)、懸尾試驗(yàn)、睪酮濃度情況比較（±s，n=6）

表4 造模后兩組大鼠體質(zhì)量、睪丸指數(shù)、懸尾試驗(yàn)、睪酮濃度情況比較（±s，n=6）

注：與本組第1 d比較▲P＜0.05；與正常對(duì)照組比較△P＜0.01。

組別睪丸指數(shù)（%）正常對(duì)照組模型組體質(zhì)量（g）1 d28 d 217.03±18.68295.63±23.07▲605.15±92.27598.55±88.94懸尾試驗(yàn)（s）1 d28 d 190.17±5.53182.67±3.27 287.00±4.56280.33±6.47△睪酮（ng/mL）1 d28 d 3.48±1.424.41±0.94 1.29±0.451.35±0.29△1.15±0.10 0.55±0.06△t -10.098-8.076-33.095-33.0073.6037.65212.626 P 0.0000.0000.0000.0000.0050.0000.000

表5 兩組大鼠睪丸組織睪酮合成相關(guān)酶（2-ΔCt×10-3）、Caspase-3 mRNA（2-ΔCt×10-4）表達(dá)（±s，n=5）

表5 兩組大鼠睪丸組織睪酮合成相關(guān)酶（2-ΔCt×10-3）、Caspase-3 mRNA（2-ΔCt×10-4）表達(dá)（±s，n=5）

注：與正常對(duì)照組比較▲P＜0.01。

組別正常對(duì)照組模型組Caspase-3 3.18±0.54 14.66±4.46▲StAR 29.62±12.25 5.53±3.47▲P450scc 22.88±14.51 2.75±0.90▲3β-HSD 30.96±17.38 6.59±3.78▲t -8.4946.0094.5484.410 P 0.0000.0000.0010.001

表6 兩組大鼠睪丸組織睪酮合成相關(guān)酶、Caspase-3蛋白表達(dá)（±s，n=5，Caspase-3、StAR、P450scc、3β-HSD/Actin）

表6 兩組大鼠睪丸組織睪酮合成相關(guān)酶、Caspase-3蛋白表達(dá)（±s，n=5，Caspase-3、StAR、P450scc、3β-HSD/Actin）

注：與正常對(duì)照組比較▲P＜0.01。

組別正常對(duì)照組模型組Caspase-3 0.16±0.02 0.39±0.09▲StAR 0.38±0.01 0.16±0.08▲P450scc 0.70±0.22 0.49±0.17▲3β-HSD 0.45±0.03 0.27±0.03▲t -4.6465.6221.5029.679 P 0.0040.0010.0040.000

圖3 大鼠睪丸組織Caspase-3，睪酮合成相關(guān)酶StAR、P450scc、3β-HSD蛋白的表達(dá)電泳圖

基于現(xiàn)階段中西醫(yī)對(duì)LOH發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)的認(rèn)識(shí)，本研究團(tuán)隊(duì)在以往研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合上述造模方法，選用“退役種鼠+復(fù)合情志刺激+孤養(yǎng)”方法，構(gòu)建“腎虛肝郁證”LOH動(dòng)物模型。40周齡雄性退役種鼠，價(jià)格低廉，易于購(gòu)買，相比較于18-20月齡的大鼠，其飼養(yǎng)周期明顯縮短；同時(shí)，種鼠由于反復(fù)配種需要，其老化速度明顯快于普通的成年大鼠；中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，腎藏精，主生殖，房室過(guò)度，暗耗腎精，可出現(xiàn)“腎精虧損”的證候；此外，模擬LOH發(fā)病的慢性應(yīng)激、環(huán)境、心理等因素，采用復(fù)合情志刺激結(jié)合孤養(yǎng)方法，中醫(yī)理論認(rèn)為，肝主疏泄，長(zhǎng)期不良情志刺激、孤養(yǎng)可引發(fā)“肝郁證”的出現(xiàn)，從而復(fù)制出“腎虛肝郁”證候類型的LOH動(dòng)物模型。本模型的優(yōu)勢(shì)在于，一方面運(yùn)用的是自然老化大鼠，無(wú)需藥物干預(yù)，能最大程度復(fù)制LOH的發(fā)病過(guò)程，種鼠的運(yùn)用能加速其老化進(jìn)程，節(jié)約了時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本；另一方面結(jié)合孤養(yǎng)、復(fù)合情志刺激等方法，復(fù)制出“腎虛肝郁”證候類型，為研究LOH提供了很好的中醫(yī)證候動(dòng)物模型，應(yīng)該是一種比較可靠且操作性較強(qiáng)的造模方法。

造模結(jié)束后，模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、蜷臥少動(dòng)、進(jìn)食減少，懸尾不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P＜0.01）等一系列典型的LOH精神心理、體能改變，同時(shí)模型組大鼠血清總睪酮水平明顯低于正常對(duì)照組大鼠（P＜0.01），均符合LOH動(dòng)物模型要求。

關(guān)于增齡影響睪酮合成，進(jìn)而可能影響LOH發(fā)病，其機(jī)制之一是睪丸間質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。李維仁[11]等研究證實(shí)，老年人睪丸間質(zhì)細(xì)胞胞漿中，細(xì)胞器較少，可見大量腫脹的線粒體，線粒體嵴消失，少見有脂滴，這與睪酮合成功能降低密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠睪丸間質(zhì)變少，睪丸間質(zhì)細(xì)胞線粒體數(shù)量明顯減少，體積小，水腫明顯，線粒體嵴消失。引發(fā)這一現(xiàn)象的重要原因可能與睪丸間質(zhì)細(xì)胞過(guò)度凋亡有關(guān)，蔡崇岳[12]等研究顯示，衰老大鼠睪丸組織中Caspase-3表達(dá)明顯增強(qiáng)。而作為誘導(dǎo)細(xì)胞

凋亡關(guān)鍵分子的Caspase家族，其Caspase-3是處于最核心位置，它的高水平表達(dá)可誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的增加。本研究也證實(shí)，模型組大鼠睪丸組織中Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高。

關(guān)于增齡影響睪酮合成的另一可能機(jī)制是，增齡對(duì)睪酮合成酶活性與表達(dá)的影響。在睪酮合成過(guò)程中，類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（Steroidogenic Acute Regulatory Protein，StAR）[13]、細(xì)胞色素膽固醇側(cè)鏈裂解酶（Cytochrome P450 side-chain cleavage，P450scc）[14]、3β-羥甾脫氫酶（3beta-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD）[15]均是睪酮合成的關(guān)鍵酶。靳會(huì)卿[16]等研究顯示，自然衰老大鼠（18月齡）睪丸組織中StAR、P450scc、3β-HSD蛋白表達(dá)水平顯著低于青年組大鼠（4月齡）；李維仁[11]等研究也證實(shí)，老年人組（70～90歲）睪丸組織中StAR、P450scc蛋白表達(dá)水平顯著低于青年組（20～30歲）（P＜0.05）。本研究顯示，模型組大鼠睪丸組織中StAR、P450scc、3β-HSD mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著低于正常對(duì)照組，與靳會(huì)卿[16]等的研究一致。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)以中醫(yī)理論“房勞過(guò)度傷腎”、“郁久傷肝”為指導(dǎo)，選擇退役種鼠（房勞過(guò)度），采用孤養(yǎng)、慢性應(yīng)激等情志刺激（久郁）方法，模擬LOH的中醫(yī)發(fā)病過(guò)程，構(gòu)建“腎虛肝郁證”LOH動(dòng)物模型，出現(xiàn)有臨床典型的LOH癥狀?；诔⒔Y(jié)構(gòu)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)研究證實(shí)，模型組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)改變、Caspase-3表達(dá)增強(qiáng)以及StAR、P450scc、3β-HSD表達(dá)下降，均符合LOH發(fā)病機(jī)制的現(xiàn)代研究。因此，可以認(rèn)為“退役種鼠+復(fù)合情志刺激+孤養(yǎng)”方法構(gòu)建的“腎虛肝郁證”LOH動(dòng)物模型是成功的，符合中醫(yī)理論特色。

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（本文編輯賀慧娥）

Establishment and Evaluation of Rat Model of Late Onset Hypogonadism of Liver Constraint and Deficiency of Kidney-type

ZHOU Xing1，ZHOU Qing1，LAI Yongjin2
(1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha Hunan 410007,China；2.Pingxiang Chinese Medicine Hospital,Pingxiang,Jiangxi 337000,China)

Objective To establish late onset hypogonadism（LOH）rat models with kidney-asthenia and liver depression syndrome and evaluate their value in research.Methods The rat models with kidney-asthenia and liver depression syndrome were established by using retired mated rat（40 weeks）+various emotional stimulation+social isolation methods，which is guided by TCM theory”sexual excess injury kidney essence”and”depressed anger damaging the liver”.Compared with the control group（8 weeks），the serum testosterone，tail suspension test，Leydig cells ultrastructure，the expression of testosterone synthetase and mRNA and protein of Caspase-3 were observed.Results A series of spirit，psychological health and physical fitness on LOH were observed.Compared with the normal group，serum testosterone levels in the model rats were decreased significantly，TST times increased significantly，the expressions of Caspase-3 were increased，the related testosterone synthetase StAR，P450scc，3β-HSD were decreased，the differences were statistically significant（P＜0.01）.Also the testis interstitium was less，thequantityofLeydigcellsmitochondrionwasreducedandthemitochondrialcristaeinthemodelgroup was disappeared.ConclusionThe LOH rat models with kidney-asthenia and liver depression syndrome can be established by using retired mated rat（40 weeks）+various emotional stimulation+social isolation methods，which are with high practical values.

late onset hypogonadism；models；animals；kidney-asthenia and liver depression syndrome

R256.5；R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.03.009

2015-12-02

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81202706）。

周興，男，副主任醫(yī)師，博士，從事中西醫(yī)結(jié)合男科學(xué)專業(yè)。