六味地黃湯對快速衰老小鼠認知功能及Wnt3a、GSK-3β表達的影響

吳琨鵬，易健，彭千元，湯艷，黃昕，劉柏炎*

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410208；2.益陽醫(yī)學高等專科學校，湖南益陽413000）

六味地黃湯對快速衰老小鼠認知功能及Wnt3a、GSK-3β表達的影響

吳琨鵬1，易健1，彭千元1，湯艷1，黃昕2，劉柏炎2*

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410208；2.益陽醫(yī)學高等?？茖W校，湖南益陽413000）

目的研究六味地黃湯對D-半乳糖（D-gal）致快速衰老小鼠認知功能及Wnt3a、GSK-3β表達的影響。方法以500 mg/（kg·d）的D-半乳糖頸部皮下注射復制快速衰老小鼠模型，將動物隨機分為正常組，模型組，六味地黃（簡稱六味）高、中、低劑量組，VitE組，給予相應干預，歷時8周。觀察小鼠的體質(zhì)量變化，采用Morris水迷宮實驗評價小鼠的認知功能，免疫組化法、RT-qPCR法檢測Wnt3a、GSK-3β的表達。結(jié)果六味地黃湯對快速衰老小鼠體質(zhì)量及水迷宮實驗的影響：模型組與正常組比較，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；各用藥組與模型組比較，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；六味高劑量組與其他用藥組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；六味地黃湯對快速衰老小鼠認知功能及Wnt3a、GSK-3β表達的影響：模型組與正常組比較，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），各用藥組與模型組比較，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），六味高劑量組與其他用藥組比較，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)論六味地黃湯可以有效改善D-半乳糖致快速衰老小鼠的學習記憶障礙；增加衰老小鼠Wnt3a的表達，激活Wnt信號通路，下調(diào)GSK-3β的表達可能是六味地黃湯延緩衰老健腦益智的作用機制。

六味地黃湯；認知功能；Wnt3a；GSK-3β；抗衰老；熟地黃；山藥；山茱萸

衰老是伴隨年齡逐漸出現(xiàn)的機體退行性變化，其中腦衰老是一種不可避免的老化現(xiàn)象，核心癥狀就是認知功能障礙。隨著社會老齡化加重，流行病學研究表明認知功能障礙發(fā)病率越來越高，已經(jīng)成第四大致死因素。中醫(yī)學認為，腦為髓之海，腎藏精生髓通于腦，腎精充足，則髓海得養(yǎng)，神機運轉(zhuǎn)如常，反之，腎精虧損，髓?？仗摚瑒t腦的功能失常。六味地黃丸是中醫(yī)藥補益腎精的經(jīng)典方劑，出自于宋代錢乙的《小兒藥證直訣》，藥理學及臨床研究表明六味地黃湯可明顯改善年齡相關(guān)性認知功能障礙[1-2]。本研究則通過建立快速衰老模型，觀察六味地黃湯對衰老小鼠認知功能及Wnt3a、GSK-3β表達的影響，探討六味地黃湯抗衰老的可能機制，為臨床用藥提供理論支持。

1 材料

1.1 動物

昆明種成年小白鼠40只，雄性，健康清潔級，體質(zhì)量（20±2）g，動物購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，購進后常規(guī)喂養(yǎng)，合格證號：SCXK（湘）2011-0003。

1.2 藥物

六味地黃湯：熟地黃24 g，干山藥12 g，山茱萸12 g，澤瀉9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g。購自湖南中醫(yī)藥大學杏林藥房。按傳統(tǒng)方法煎煮，濃縮至每毫升4 g生藥，4℃冷藏備用。

1.3 試劑

D-半乳糖、SP-9 000（武漢博士德生物公司）；Wnt3a、GSK-3β免疫組化試劑盒（武漢博士德生物公司）；維生素E注射液（江西博萊大藥廠1 mL∶5 mg）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo），qPCR試劑盒（TaKaRa），trizol（ambion）。

TP-1000電子天平（中國湘儀天平儀器廠）；水迷宮動物行為學習記憶系統(tǒng)（法國Viewpoint）；BX-51光學顯微鏡及數(shù)碼攝影數(shù)字彩超圖像分析儀系統(tǒng)（日本Olympus公司），realplex2熒光定量PCR儀（德國艾本德公司），232HK離心機（德國HERMLE公司），BG-AUHWIDI核酸水平電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司），BD106核酸蛋白濃度測定儀（英國BioDrop公司），T100梯度PCR擴增儀、XRS+imager化學發(fā)光系統(tǒng)（美國BioRad公司）。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

適應性喂養(yǎng)2周后，小鼠死亡4只。余36只隨機分為正常組，模型組，六味地黃（簡稱六味）高劑量組、中劑量組、低劑量組，VitE組，每組6只。除正常組以外的小鼠予每日頸部皮膚75%酒精消毒后，D-半乳糖0.5 g/（kg·d）頸部皮下注射，正常組小鼠予生理鹽水相同體積皮下注射，周期為8周，復制快速衰老小鼠模型。中劑量組相當于60 kg體質(zhì)量人體表面積臨床等效劑量，高、中、低劑量組灌胃量分別為2、1、0.5 g/（kg·d），空白組、模型組每天給予等容積蒸餾水灌胃，陽性對照組給予VitE注射液灌胃[100 mg/（kg·d）]，各組灌胃體積均為10 mL/（kg·d），灌胃8周，治療前及治療后均用Morris水迷宮系統(tǒng)測定大鼠的學習記憶功能的變化。第8周行水迷宮試驗后所有小鼠行斷頸法處死，取腦組織采用免疫組化、RT-qPCR方法檢測小鼠腦內(nèi)Wnt3a、GSK-3β的表達。

2.2 觀察體質(zhì)量變化

所有動物自由進食，飲水，活動，每周稱質(zhì)量并記錄體質(zhì)量變化。

2.3 行為學測試

這個這個，當然能種。村長極力爭辯。一條尺把寬的溝，充其量占你八斗丘的二十分之一，說不定更少，對你有什么影響呢。

2.3.1 定位航行實驗實驗共歷時5 d，每天固定時間段，每個時間段訓練4次。第1次訓練時，將小鼠遠離目標象限面向池壁放入池中，記錄小鼠找到平臺的時間（逃避潛伏期），后3次即將小鼠分別從其余3個不同象限放入水中，歷時2 min。2 min內(nèi)找不到平臺者潛伏期記錄為120 s，每次訓練間隔20 s。4次訓練潛伏期的平均值作為小鼠當日的學

習成績[3]。

2.3.2 空間探索實驗第6天撤除平臺，將小鼠從任意一區(qū)入水，記錄小鼠在2 min內(nèi)跨越原平臺的次數(shù)[4]。

2.4 檢測小鼠腦內(nèi)Wnt3a、GSK-3β的含量

2.4.1 免疫組化方法檢測將保存在4%多聚甲醛中的腦組織取出，梯度脫水，石蠟切片，烤片（65℃）2 h后，常規(guī)脫蠟至水；高溫檸檬酸鹽液煮沸修復2 min，切片放入3%過氧化氫溶液中浸泡10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶；0.01 mol/L PBS泡洗3 min×3次；滴加正常山羊血清封閉15 min，并用PBS作空白對照；分別加入兩種抗體（Wnt3a和GSK-3β，濃度均為1∶100），各100 μL 37℃（2 h）；0.01 mol/L PBS泡洗3 min×3次；加入通用型生物素化二抗100 μL，37℃15 min，0.01 mol/L PBS泡洗3 min×3次；加入過氧化物酶標記鏈霉卵白素100 μL，37℃20 min，0.01 mol/L PBS泡洗3 min×3次；滴加DAB顯色劑，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。再于光學顯微鏡200倍鏡下隨機選取6個不重復視野，由圖像分析系統(tǒng)測算陽性細胞表達數(shù)量。

2.4.2 RT-qPCR檢測mRNA的相對量用trizol提取總RNA；于核酸蛋白溶度測定儀上測定RNA的溶度和質(zhì)量；行RNA瓊脂糖凝膠電泳，見兩條明顯的28 S、18 S的區(qū)帶；采用兩步法逆轉(zhuǎn)錄cDNA；20 μL體系擴增qPCR。采用2-ΔΔCt值進行相對定量，反映目的基因表達水平，其數(shù)值越大，表達越強。詳見表1。

表1 聚合酶鏈式反應物引物序列及反應溫度、擴增長度

根據(jù)qPCR儀自動分析并計算結(jié)果，qPCR結(jié)果以Ct值表示，相對定量采用比較Ct法：以β-actin基因為管家基因，ΔCt為目的基因和管家基因的Ct值差。ΔΔCt表示對照組與處理組間的ΔCt差異。

2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 六味地黃湯對小鼠體質(zhì)量變化的影響

隨著D-半乳糖頸部皮下注射時間的延長，模型組小鼠毛色明顯暗淡無光澤，神倦嗜睡，體質(zhì)量增加緩慢，呈現(xiàn)出明顯衰老體征。各組小鼠初始體質(zhì)量分析無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；而終末體質(zhì)量模型組與正常組、用藥組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；各組終末體質(zhì)量及增質(zhì)量均與正常組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），六味高劑量組與VitE組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

表2 六味地黃湯對小鼠體質(zhì)量的影響（±s，n=6，g）

表2 六味地黃湯對小鼠體質(zhì)量的影響（±s，n=6，g）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與六味高劑量組比較，#P＜0.05。

組別正常組模型組六味高劑量組六味中劑量組六味低劑量組VitE組F值P值初始體質(zhì)量19.9±0.1 20.0±0.4 19.9±0.2 19.9±0.2 19.7±0.7 20.1±0.6 0.508 0.768終末體質(zhì)量增質(zhì)量50.5±3.530.5±3.5 39.4±3.3**19.4±3.3** 46.2±2.6*▲▲29.2±2.5*▲▲45.2±2.1*▲▲#26.2±2.2*▲▲#44.2±2.2*▲▲#24.4±2.7*▲▲#45.0±4.1*▲▲#23.3±0.5*▲▲#16.66315.847 0.006

3.2 六味地黃湯對小鼠學習記憶能力的影響

定位航向?qū)嶒灒涸炷Ｇ案鹘M小鼠組間無差異（P＞0.05），造模后小鼠潛伏期明顯延長，平均逃避潛伏期，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。模型組小鼠的平均逃避潛伏期較其他5組明顯延長（P＜0.01），具有顯著統(tǒng)計學意義。六味高劑量組與中劑量組、低劑量

組、VitE組三組平均潛伏期比較具有顯著性差異（P＜0.01）。

空間探索實驗：造模前各組小鼠跨臺次數(shù)無差異（P＞0.05）造模后次數(shù)減少，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。模型組大鼠的跨臺次數(shù)明顯少于其他5組，具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；六味中劑量組與低劑量組及VitE比較具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表3。

表3 六味地黃湯對小鼠潛伏期及跨臺次數(shù)的影響（±s，n=6）

表3 六味地黃湯對小鼠潛伏期及跨臺次數(shù)的影響（±s，n=6）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01；與六味高劑量組比較，##P＜0.01；與六味中劑量組比較，●P＜0.05。

組別正常組模型組六味高劑量組六味中劑量組六味低劑量組VitE組F值P值逃避潛伏期（s）前后18.6±5.919.8±9.0 18.6±6.7101.5±13.2** 18.6±6.430.5±9.1▲▲19.3±6.349.5±8.9▲▲##18.8±5.862.3±5.8▲▲##19.5±6.964.1±11.1▲▲##0.72852.235 0.6080.000跨臺次數(shù)（次/120 s）前后14.5±1.114.0±2.0 13.7±2.23.8±1.3** 14.0±2.013.5±2.2▲▲13.8±1.510.0±1.0▲▲##14.0±2.17.8±1.4▲▲##●14.2±1.77.8±1.1▲▲##●0.14523.901 0.9800.000

3.3 六味地黃湯對小鼠腦內(nèi)Wnt3a、Gsk3β表達的影響

3.3.1 免疫組化方法與正常組比較模型組，Wnt3a陽性細胞數(shù)少，Gsk-3β陽性細胞數(shù)多，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），用藥各組與模型組比較，Wnt3a表達多，Gsk-3β表達少，差異具有顯著意義（P＜0.01），組間內(nèi)，六味高劑量組與其他用藥組比較，Wnt3a表達多，而GSK-3β表達較少，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），六味中劑量組與VitE組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），詳見表4。

3.3.2 RT-qPCRWnt3a、GSK-3β的表達呈負相關(guān)，模型組Wnt3a mRNA相對量少，GSK-3βmRNA相對量多，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），組間內(nèi)，六味高劑量組與其他用藥組比較，Wnt3a mRNA相對量多，而GSK-3β表達較少，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），六味中劑量組與VitE組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），詳見表4。

4 討論

人口老齡化趨勢增加了老年認知功能障礙的患病率，早期干預治療是延緩衰老的最有效的措施。中醫(yī)學認為，腎和腦的關(guān)系最密切，“腎生髓，通于腦”說明腎精是腦生成的物質(zhì)基礎(chǔ)，腦為髓海，補腎益精中藥能生髓壯骨，亦可護腦益智健腦，這些是毋庸置疑的[5-7]。因此治療衰老性認知功能障礙多從補腎填精論治。六味地黃湯是滋補肝腎的經(jīng)典名方，能健腦益智，長期給予六味地黃湯可改善空間記憶能力及部分改善條件性逃避反應能力，促進神經(jīng)干細胞的增殖，促進認知功能的恢復[8]，但對其作用機制尚不明確。

表4 六味地黃湯對快速衰老小鼠腦內(nèi)Wnt3a、GSK-3β表達的影響（±s，n=6）

表4 六味地黃湯對快速衰老小鼠腦內(nèi)Wnt3a、GSK-3β表達的影響（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01；與高組比較，##P＜0.01；與中組比較，●P＜0.05。

組別正常組模型組六味高劑量組六味中劑量組六味低劑量組VitE組F值P值Wnt3a陽性細胞數(shù)mRNA相對量91.6±7.45.7±0.3 74.6±10.4**1.0±0.2** 112.6±18.2▲▲5.8±0.6*▲▲91.1±7.7▲▲##4.6±0.3▲▲##90.0±14.0▲▲##4.5±0.7▲▲##88.8±5.9▲▲##●3.1±0.7▲▲##●6.7677.125 GSK-3β陽性細胞數(shù)mRNA相對量58.3±6.20.3±0.1 98.0±8.2**1.0±0.1** 56.7±6.4▲▲0.3±0.1* 70.2±10.3▲▲##●0.4±0.2▲▲##72.5±10.9▲▲##0.5±0.1▲▲##73.4±9.3▲▲##●0.6±0.2▲▲##●102.910.5 0.000

在Wnt信號通路中Wnt3a是最常見的Wnt家族配體，它與細胞膜上的受體Frizzed結(jié)合，抑制下游GSK-3β的活性，使細胞內(nèi)β-catenin數(shù)量增多，后者達到一定水平后進入細胞核，與TCF/LEF結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄因子，誘導相應的靶基因的表達，激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路，進而對細胞的增殖分化及細胞周期進行調(diào)節(jié)[9]。經(jīng)典的Wnt信號通路在細胞間粘附及分化方面發(fā)揮著重要作用，是神經(jīng)發(fā)育的一條重要通道[10]。在體外神經(jīng)干細胞培養(yǎng)過程中，加入有活性的Wnt3a蛋白可減少神經(jīng)球的形成，促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞的分化[11]。腦缺血損傷下再灌注組的Wnt3a的表達明顯高于假手術(shù)組，其是損傷細胞增殖的重要激活劑[12-13]，GSK-3β是經(jīng)典的通路上一個重要的負性調(diào)控因子，其活性升高可抑制Wnt通路，使得GSK-3β對p-eatenin的磷酸化修增強并促進其降解，進而促進細胞的凋亡[14]，GSK-3β引起神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵，在老化的神經(jīng)細胞中GSK-3β的含量明顯增多[15]。

VitE是體內(nèi)不可獲缺的抗氧化的維生素，腦損傷后局部活性氧大量升高，而VitE干預后，SOD含量增加，MDA含量下降，小鼠學習記憶能力明顯改善[16]，VitE亦調(diào)節(jié)Ca2+的穩(wěn)態(tài)，抑制抗氧化應激導致

的mDNA的損傷從而改善D-半乳糖誘致衰老小鼠學習記憶障礙[17]，故實驗以VitE作為陽性對照組。本實驗表明D-半乳糖頸部皮下注射后小鼠認知功能下降模型建立，各用藥組與模型組在體質(zhì)量、增重，逃避潛伏期、跨臺次數(shù)及Wnt3a、GSK-3β表達方面的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中，六味地黃湯高劑量組增重多，逃避潛伏期短、垮臺次數(shù)多，Wnt3a表達顯著，而GSK-3β含量少，與其他各組比較差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），實驗結(jié)果顯示了六味地黃湯抗衰老的積極作用，結(jié)合當前的研究，我們推斷提高Wnt3a的表達，抑制GSK-3β的含量，激活Wnt經(jīng)典信號通路是六味地黃湯改善認知功能障礙的可能機制。

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（本文編輯楊瑛）

Effects of Liuwei Dihuang Decoction on Recognition and the Expression of Wnt3a and GSK-3β in Senescence Accelerated Mice

WU Kunpeng1,YI Jian1,PENG Qianyuan1,TANG Yan2,LIU Baiyan2*
（1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China；2.Yiyang Medical College,Yiyang,Hunan 413000,China）

Objective To study the effect of Liuwei Dihuang Decoction（LWDHD）on recognition，Wnt3a and GSK-3β in D-galactose induced senescence accelerated mice.Methods The senescence accelerated mice were injected 500 mg/（kg·d）of D-galactose subcutaneously copy rapid，the animals were randomly divided into normal group，model group，high dose，medium dose and low dose of LWDHD groups and VitE group，which were given different processing.After gavage 10 mL/（Kg·d）for eight weeks，the mice body quality change was changed，cognitive function in mice was evaluated by line Morris water maze experiment，the expression of Wnt3a and GSK-3β were detected by immunohistochemical and RT-qPCR methods.Results Compared with normal group and other groups，the weight gain of body mass in model group was lesser（P＜0.05），the incubation period was longer and cross platform times was more（P＜0.05）；Compared with normal group，the diffrences of the body quality increases，the incubation period and cross platform number in high dose of LWDHD group were not statistically significant（P＞0.05）；Compared with VitE group，the body quality and the ability of learning and memory in low dose of LWDHD group have no statistical significance（P＞0.05）；The high dose of LWDHD group and other groups were statistically significant（P＜0.05）.The result showed high consistency by immunohistochemical method and RT-qPCR detection.Compared with the model group，the low expression of Wnt3a，high activity of GSK-3β in high dose of LWDHD group，the difference was statistically significant（P＜0.01）；Compared with the medium and low dose of LWDHD groups and VitE group，the high

Liuwei Dihuang Decoction；cognitive function；Wnt3a；GSK-3β；anti-aging；Radix Rehmanniae Preparata；Rhizoma Dioscoreae；Fructus Corni

R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.03.003

2015-09-11

國家自然科學基金項目（81202694），湖南省自然科學基金項目（2015JJ2105）。

吳琨鵬，女，在讀碩士研究生，從事中醫(yī)藥防治心腦血管疾病研究。

*劉柏炎，男，教授，博士研究生導師，E-mail：liubaiyan@126.com。

expression of Wnt3a and low activity of GSK-3β in the high dose of LWDHD group were statistically significant（P＜0.01）. Conclusion Liuwei Dihuang Decoction can improve the learning and memory dioders in D-galactose induced senescence accelerated mice.The mechanism of Liuwei Dihuang Decoction in anti-aging and promoting intelligence could be increasing the Wnt3a expression in aging mice，activation of Wnt signaling pathways，and down-regulating GSK-3β expression.