參麥方對于大鼠心肌損傷保護作用的代謝組學研究

李 杰，胡 超，許龍龍，馬增春，梁乾德，湯響林，王宇光，譚洪玲，肖成榮，高 月,

(1.廣西醫(yī)科大學研究生學院，廣西 南寧 530000；2.軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850)

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參麥方對于大鼠心肌損傷保護作用的代謝組學研究

李 杰1，胡 超2，許龍龍2，馬增春2，梁乾德2，湯響林2，王宇光2，譚洪玲2，肖成榮2，高 月1,2

(1.廣西醫(yī)科大學研究生學院，廣西 南寧 530000；2.軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850)

目的 運用代謝組學方法研究參麥方對于由阿霉素所造成的大鼠心肌損傷的保護作用，探討參麥方在體內(nèi)發(fā)揮藥效的作用機制。方法 通過超高效液相色譜-飛行時間質譜(UPLC/TOF-MS)分析藥物作用后大鼠尿液的代謝物圖譜，采用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)尋找各組代謝物差異，變量重要性投影(VIP)及t檢驗篩選潛在內(nèi)源性標志物。結果 鑒定出琥珀酰腺苷、環(huán)磷酸腺苷、S-三甲基丁?；淞蛐刘０?、4-羥基環(huán)氧乙酸、苯丁酰谷氨酰胺、丁酸甲酯、3-羥基十四烯二酸、二氫硫辛酰胺、丙酮酸等14種內(nèi)源性代謝物。結論 參麥方可通過調節(jié)嘌呤代謝、部分氨基酸代謝、脂肪代謝和能量代謝等來發(fā)揮保護心肌損傷的作用。該研究解釋了參麥方在體內(nèi)發(fā)揮藥效的作用機制，為兩藥配伍的合理性及臨床聯(lián)合用藥治療疾病提供了理論依據(jù)。

參麥方；超高效液相色譜-飛行時間質譜；代謝組學；阿霉素；心肌損傷；作用機制

參麥方由人參和麥冬兩味中藥組成，源于《癥因脈治》的參脈飲，具有益氣固脫、養(yǎng)陰補心等功效。臨床上將其用于心血管疾病的治療，具有抗氧化、抗心肌缺血、減少心肌耗氧量、強心升壓等藥理學功能[1-2]。阿霉素(doxorubicin，DOX)具有廣譜的抗腫瘤活性，臨床上廣泛用于乳腺癌、卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤以及淋巴瘤等惡性腫瘤的治療，然而，其固有的劑量依賴性及累積性的心臟毒性對患者產(chǎn)生了極大的副作用，使其應用受到限制[3-5]。有研究表明[6]，參麥方可以有效減輕由阿霉素所引起的心肌損傷效應，為臨床尋找有效的阿霉素所致心肌損傷保護藥物提供了參考。本文從代謝組學角度[7]研究這種心肌損傷保護作用的物質基礎，為探討參麥配伍減毒增效、兩藥在體內(nèi)的作用機制及臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥液的制備 麥冬Ophiopogonjaponicus(批號20110917)，產(chǎn)地浙江慈溪；人參Panaxginseng(批號20110901)，產(chǎn)地吉林。麥冬、人參藥材由天津中醫(yī)藥大學提供。分別稱取人參、麥冬500 g，粉碎成粗顆粒后浸泡0.5 h，8倍量水煎煮提取2次，每次1 h，提取液減壓濃縮至500 mL，制成濃度為1 kg·L-1的人參藥液和麥冬藥液。參麥藥液為兩單藥等比例煎煮藥液，制備方法與單藥制備方法相同。

1.2 試劑 甲酸為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；乙腈為色譜純，購自Fisher Scientific公司；超純水由Millipore制備；超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測試盒購自南京建成生物工程研究所；注射用鹽酸多柔比星(DOX)購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司(產(chǎn)品批號15006911)。

1.3 儀器 Acquity UPLC-Synapt MS超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀(Waters公司)，包含MassLynx V4.1質譜工作站(Waters公司)、Acquity HSS T3 色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters公司)；冷凍離心機(Heraeus Labofuge 400R)；純水儀(Millipore Simplicity)。

1.4 動物與分組 SD大鼠，♂，30只，清潔級，體質量(200±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物品種合格證編號SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學科學院動物中心，給予標準飼料和飲用水，12 h日夜節(jié)律，室內(nèi)溫度為(22±1)℃，相對濕度為40%～50%。

將大鼠隨機分為對照組、模型組、人參組、麥冬組和參麥組，每組6只。麥冬組灌胃麥冬水煎液，劑量為12 g·kg-1，人參組灌胃人參水煎液，參麥組灌胃參麥方，劑量為10 g·kg-1(均相當于人臨床最大給藥劑量的4倍)，每日1次，連續(xù)給藥14 d，對照組和模型組給予等體積的純凈水，每日1次，連續(xù)14 d。除對照組外,各組于灌胃給藥3 d后開始注射DOX，隔天給藥，每次3 mg·kg-1，累積劑量15 mg·kg-1[8]，對照組注射等體積生理鹽水。

1.5 樣本的收集與制備 將給藥d 14的大鼠置于代謝籠中收集24 h尿液，尿樣在4℃下3 000 r·min-1離心5 min，取上清進行分裝，-80 ℃保存。分析前，取解凍后尿樣100 μL，加入甲醇400 μL，渦旋2 min，過0.22 μm濾膜，置于進樣小瓶中，用于UPLC/TOF-MS分析。

尿液收集完成后，腹股動脈取血，血樣在4℃下3 000 r·min-1離心5 min得到血清樣品，-80 ℃保存，用于血生化分析。同時，取心臟組織置于10%福爾馬林溶液用于病理分析。

1.6 UPLC/TOF-MS條件 采用Acquity HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱，柱溫30 ℃，樣品室溫度4 ℃，流速0.5 mL·min-1，進樣量5 μL；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫條件：0～2 min，25%B；2～3 min，25%～30%B；3～17 min，30%～35%B；17～19 min，35%～25%B；19～20 min，25%B。

采用電噴霧電離離子源(ESI)，正離子V模式檢測：毛細管電壓3 kV，錐孔電壓3 kV，m/z范圍50～1 500，脫溶劑氣體流速900 L·h-1，錐孔氣流量50 L·h-1，離子源溫度100 ℃，脫溶劑溫度450 ℃，質量校正質核比m/z 556.277 1；負離子V模式檢測：毛細管電壓2.9 kV，錐孔電壓4 kV，m/z范圍50～1 500，脫溶劑氣體流速900 L·h-1，錐孔氣流量50 L·h-1，離子源溫度100 ℃，脫溶劑溫度450 ℃，質量校正質核比m/z 554.261 5。

1.7 統(tǒng)計學分析 質譜數(shù)據(jù)采用MassLynx 4.1軟件(Waters公司)進行處理。消除背景噪音后，進行數(shù)據(jù)讀取、色譜峰自動識別、峰對齊和歸一化等處理，利用MakerLynx XS對色譜圖分析，得到物質的保留時間、相對分子質量等信息。利用偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)對不同組之間的數(shù)據(jù)進行模式識別，通過散點圖S-plot及VIP-plot結果，從VIP(變量投射重要性)>1且統(tǒng)計學差異P<0.05的變量中找出潛在的內(nèi)源性標志物，結合本實驗室質譜數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫(kyoto encyclopedia of genes and genomes)、HMDB數(shù)據(jù)庫(human metabolome database),對標志物及涉及的相關代謝通路進行初步探討，利用GraphPad軟件進行繪圖和數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理。

2 結果

2.1 尿液代謝輪廓分析 采用UPLC/TOF-MS進行樣本的分離以及數(shù)據(jù)的采集，F(xiàn)ig 1為大鼠尿液正、負離子模式下，各組總離子流基峰強度色譜圖(base peak intensity chromatogram , BPI)。由圖可以看出，組與組之間的大鼠尿液代謝輪廓略有不同，而具體差異情況還需進行進一步的比較分析。

Fig 1 Base peak intensity chromatograms in positive ion mode and negative ion mode in each group

A：Control group; B：Model group; C：Ginseng group; D：Ophiopogon japonicus group; E：Shen-Mai group

2.2 PLS-DA分析結果 為研究給予參麥方后大鼠內(nèi)源性物質代謝影響的大小，采用MakerLynx XS軟件對數(shù)據(jù)進行組間PLS-DA分析，樣品的分析結果如Fig 2和Fig 3所示。在PLS-DA圖中，每1個點代表1個樣本，不同顏色代表不同的組別，從圖中可以看出，對照組與其他各組在正、負離子模式下均得到了明顯的區(qū)分，其他各組之間可以看出有所區(qū)別，說明各組之間存在差異。

Fig 2 PLS-DA score plot in positive ion mode from urine of rats

Control group;Model group;Ophiopogon japonicus group;

2.3 代謝組學分析結果 將對照組和模型組尿樣數(shù)據(jù)進行正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)，從中得出其S-plot及VIP-plot。選取S-plot兩端具有明顯差異，同時滿足VIP > 1的變量，再用t檢驗對篩選到的差異變量進行驗證，符合P<0.05的被認為是具有明顯差異的化合物。結果在各組中找到14種具有明顯差異的潛在標志物，結合本實驗室質譜數(shù)據(jù)庫、二級質譜、KEGG數(shù)據(jù)庫、HMDB數(shù)據(jù)庫作為輔助工具，鑒定出其中的14個化合物(Tab 1)，各組中標志物含量相對變化情況見Fig 4。

Fig 3 PLS-DA score plot in negative ion mode from urine of rats

Control group;Model group;Ophiopogon japonicus group;

2.4 生化指標結果 為驗證阿霉素是否對心肌造成損傷以及參麥方復方和單方對心肌損傷的保護作用，測量大鼠各組血清的SOD、MDA及LDH含量。Tab 2結果顯示，與對照組相比，模型組MDA及LDH含量明顯增加(P<0.01)，SOD活性明顯降低(P<0.01)。人參組能夠明顯降低MDA與LDH含量，增加SOD的活性，而人參與麥冬合用后，效果更加明顯，間接證明麥冬的加入刺激了人參中有效成分的溶出，兩藥合用起到增效作用。

Tab 1 Potential biomarkers in rats affected by Shenmai decoction

**P<0.01vscontrol group

Fig 4 The content changes of endogenous metabolites

CON: Control group; DOX: Model group; RS: Ginseng group; MD: Ophiopogon japonicus group; SM: Shen-Mai group.*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;#P<0.05，##P<0.01vsmodel group

Tab 2 Comparison of content of SOD,

GroupSOD/kU·L-1MDA/μmol·L-1LDH/U·L-1Control262.9±17.43.83±0.15147±52Model225.2±13.3**5.5±0.42**413±49**RS235.6±14.74.28±1.03#245±87##SM257.6±17.6##4.07±0.51##235±125##MD228.1±12.14.38±1.29277±122#

**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsmodel group

2.5 病理指標結果 為驗證阿霉素是否對心肌組織造成損傷，以及參麥方復方和單方對心肌損傷的保護作用，取大鼠心臟作病理切片，得到結果如Fig 5所示。結果顯示，單獨給予阿霉素后，出現(xiàn)部分區(qū)域帶狀心肌肥大，肌束變粗，心肌橫紋不清，肌漿均質淡染，心肌間出血等病變(Fig 5B)。麥冬組(Fig 5D)與模型組差別并不明顯，人參組(Fig 5C)較模型組心肌損傷略有減輕，而參麥組(Fig 5E)的心肌損傷明顯改善。

3 討論

本研究采用UPLC/TOF-MS檢測灌服參麥方的心肌損傷大鼠的尿液內(nèi)源性代謝物變化，對參麥方在體內(nèi)的物質基礎、作用機制及兩藥配伍增效研究進行了初步探討，經(jīng)PLS-DA和OPLS-DA分析，共鑒定了14種相關的內(nèi)源性標志物，涉及嘌呤代謝、纈氨酸、酪氨酸等氨基酸代謝、脂肪代謝、三羧酸循環(huán)等途徑。

脫氧腺苷(deoxyadenosine)、環(huán)磷酸腺苷(adenosine 2′,3′-cyclic phosphate)和琥珀酰腺苷(succi-nyladenosine)是參與嘌呤合成與分解的重要物質，與其他分子共同調節(jié)著嘌呤代謝的正常運轉[9]。模型組兩物質含量明顯改變，說明阿霉素引起了嘌呤代謝的紊亂，而其他給藥組使得這種變化得以緩解，對嘌呤代謝起調節(jié)、穩(wěn)定作用。

Fig 5 Pathological variation of heart in rat after the treatment (HE×20)

A：Control group; B：Model group; C：Ginseng group; D：Ophiopogon japonicus group; E：Shen-Mai group

S-三甲基丁酰基二氫硫辛酰胺[S-(3-methylbutanoyl)-dihydrolipoamide-E]是合成纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的中間體，這3種氨基酸可刺激骨骼肌蛋白質合成，促進骨骼肌葡萄糖的攝取，間接調節(jié)糖酵解中的丙酮酸脫氫酶，控制丙酮酸進入三羧酸循環(huán)[10]。阿霉素間接影響了這3種氨基酸的代謝與合成，而參麥方對這種改變起到了很好的調節(jié)作用。4-羥基環(huán)氧乙酸(cis-4-hydroxycyclohexylacetic acid)參與體內(nèi)酪氨酸代謝，酪氨酸代謝的紊亂可能誘發(fā)酪氨酸血癥，引起白化病、苯丙酮酸尿癥、神經(jīng)系統(tǒng)損害等多種疾病[11]，參麥方有效地維持了由阿霉素引起的酪氨酸代謝異常，使機體保持穩(wěn)定狀態(tài)。

苯丁酰谷氨酰胺(phenylbutyrylglutamine)是苯基丁酸的次生代謝產(chǎn)物，苯基丁酸用于消除一些先天性疾病因子[12]。阿霉素誘發(fā)機體細胞凋亡，產(chǎn)生炎癥，使得苯丁酰谷氨酰胺增多，參麥方提高了機體免疫力，有效抑制阿霉素所帶來的細胞毒性，保護、修復了心肌細胞。丁酸甲酯(3-butyn-1-al)為丁酸代謝的中間產(chǎn)物，與十四烷二酸(tetradecanedioic acid)、3-羥基十四烯二酸(3-hydroxytetradecanedioic acid)共屬于脂肪酸代謝范疇，心肌所需能量一部分來自游離的脂肪酸，另一部分能量由碳水化合物代謝提供[13]，其含量的變化說明了參麥方對于心肌能量代謝起到調節(jié)作用。

丙酮酸(pyruvic acid)是糖類、蛋白質和脂肪三大代謝的中間體，其在線粒體內(nèi)氧化脫羧生成乙酰CoA,進而進入三羧酸循環(huán)供機體利用。阿霉素破壞了細胞內(nèi)線粒體功能，使線粒體損傷，進而造成丙酮酸堆積，影響機體正常代謝[14]，參麥方對這種應激損傷起到了很好的保護作用。二氫硫辛酰胺(dihydrolipoamide)參與調節(jié)體內(nèi)的糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)、丙氨酸和天冬氨酸代謝等眾多代謝通路的代謝，具有重要的生理意義。阿霉素對二氫硫辛酰胺的生成產(chǎn)生了較為明顯的抑制，而參麥方也明顯改善了這種抑制作用，對機體代謝的部分通路起到保護作用。

氨苯蝶啶(triamterene)給藥后的上調對于促進尿液排放有積極作用[15]，對于由心力衰竭、慢性腎炎引起的水腫有很好的治療作用。二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine)是內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制劑，可以通過多種機制導致內(nèi)皮功能障礙，誘發(fā)疾病[16]，模型組含量明顯升高，對于機體產(chǎn)生不利影響，而參麥組將這種影響趨于正常水平。γ-生育酚(gamma-CEHC)是維生素E的代謝物，維生素E是體內(nèi)重要的抗氧化劑，阿霉素的毒性作用使得機體產(chǎn)生大量自由基[17]，參麥方通過協(xié)助機體清除自由基而發(fā)揮保護作用。

以上生物標志物以及相關代謝通路從體內(nèi)代謝角度綜合解釋了參麥方保護由阿霉素所引起的心肌損傷的作用機制，驗證了參麥方對于保護、修復心肌細胞，減少心肌耗氧量，增強細胞免疫力等方面的作用效果，同時也證明了人參與麥冬合用增效的配伍規(guī)律，為臨床尋找有效的阿霉素所致心肌損傷保護藥物提供了依據(jù)。

(致謝：本實驗在軍事醫(yī)學科學院動物中心和軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所完成，在此特別感謝參與本實驗的所有老師和同學。)

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A metabolomics study on Shen-Mai decoction’sprotection of myocardial injured rats

LI Jie1, HU Chao2, XU Long-long2, MA Zeng-chun2, LIANG Qian-de2,TANG Xiang-lin2, WANG Yu-guang2, TAN Hong-ling2, XIAO Cheng-rong2, GAO Yue1,2

(1.GraduatedSchool,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530000,China;2.InstituteofRadiationMedicine,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China)

Aim With metabolomics method, to study Shen-Mai decoction’s function on protecting the myocardial injured rats caused by doxorubicin for probing into the functioning mechanism of Shen-Mai decoction’s medical effect. Methods By means of UPLC-TOF-MS, the metabolites of urine of the rats treated by Shen-Mai decoction were analyzed. Then, the differences between each group of the metabolites were sought with PLS-DA (the partial least square discriminant analysis) and OPLS-DA (the orthogonal partial least squares discriminant analysis). VIP (variable importance in projection) andttest were used to screen out potential biomarkers. Results Fourteen endogenous metabolites such as succinyladenosine, adenosine 2′, 3′-cyclic phosphate, S-(3-methylbutanoyl)-dihydrolipoamide-E, cis-4-hydroxycyclohexylacetic acid, phenylbutyrylglutamine, 3-butyn-1-al, 3-hydroxytetradecanedioic acid, dihydrolipoamide and pyruvic acid, etc. were characterized. Conclusions The results indicate that Shen-Mai decoction can protect the body from myocardial injury by regulating purine metabolism, some acid metabolism, fat metabolism and energy metabolism, etc. The study expounds the functioning mechanism for Shen-Mai decoction’s medical effect in the body and provides theoretical grounds for the rationality of the two medical herbs’ compatibility and their combination in clinical treatment of diseases.

Shen-Mai decoction; UPLC/TOF-MS; metabolomics; doxorubicin; myocardial injury; mechanism

2016-08-26，

2016-09-31

國家自然科學基金資助項目(No 81274127)；國家重點基礎研究發(fā)展計劃資助項目(No 2012CB518402，2011CB505304)

李 杰(1989-)，男，碩士生，研究方向：中藥藥理學,E-mail: lipsjie@sina.cn;

高 月(1963-)，女，博士，研究員，博士生導師，研究方向：中藥藥理學,通訊作者,E-mail: gaoyue@bmi.ac.cn

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.032.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.016

A

1001-1978(2016)11-1559-07

R-332；R289.5；R322.11；R542.22； R979.14