速效救心丸對大鼠血小板聚集率及環(huán)磷腺苷水平的影響

李益萍，羅良國，沈 磊，王肖龍

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速效救心丸對大鼠血小板聚集率及環(huán)磷腺苷水平的影響

李益萍1，羅良國2，沈 磊2，王肖龍1

目的 探討速效救心丸對血小板聚集的作用及機制。方法 采用比濁法測定速效救心丸、阿司匹林、阿魏酸哌嗪對二磷酸腺苷(ADP)、膠原和花生四烯酸(AA)誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集率和環(huán)磷腺苷(cAMP)水平的影響。結(jié)果 與空白組比較，速效救心丸中、高劑量組可顯著抑制ADP、膠原、AA誘導(dǎo)大鼠的血小板聚集(P<0.01)；速效救心丸高劑量組對AA誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集抑制作用較阿司匹林組好；速效救心丸可提高大鼠血小板內(nèi)cAMP的含量(P<0.05)。結(jié)論 速效救心丸能夠抑制大鼠ADP、膠原和AA誘導(dǎo)的血小板聚集，其機制可能通過增加cAMP的含量而發(fā)揮作用。

速效救心丸；血小板聚集；環(huán)磷腺苷；阿司匹林

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)是嚴重危害人類健康的常見病。血栓形成在CHD的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。 冠脈斑塊破裂可引起血小板聚集，繼發(fā)性血栓形成，致使血管阻塞和相關(guān)區(qū)域心肌缺血或壞死[1]。同時，冠脈介入治療導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷，也可引起血小板激活，支架內(nèi)血栓形成，為冠脈介入術(shù)后并發(fā)癥。因此，運用抗血小板聚集藥物是CHD或冠脈介入術(shù)后重要的治療措施。然而，目前臨床上常用的抗血小板藥物如阿司匹林、氯吡格雷等因其不良反應(yīng)或藥物抵抗等，一定程度上影響了其臨床運用及有效性。

因此，積極開展活血中藥的抗血小板機制研究具有潛在的臨床價值。

速效救心丸是治療冠心病、心絞痛的常用藥，具有行氣活血，祛瘀止痛的作用。速效救心丸主要由川芎、冰片等組成，其有效成分或衍生物可抑制血小板聚集[2-4]。但速效救心丸對血小板功能的影響至今未見詳細報道。本研究通過測定速效救心丸對血小板最大聚集率和血小板內(nèi)環(huán)磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)含量的影響，探討速效救心丸對血小板聚集的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級別 Wistar雄性大鼠，280 g～320 g，北京維通利華有限公司動物養(yǎng)殖中心提供，所有大鼠分籠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 藥物和試劑 生理鹽水、速效救心丸(天津中新藥業(yè)集團股份有限公司第六中藥廠生產(chǎn)，批號Z12020025)、阿司匹林(拜耳醫(yī)藥保健公司，批號13527270)、阿魏酸哌嗪片(成都亨達藥業(yè)有限公司，批號151001)；二磷酸腺苷(ADP)、膠原、BSA、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氯化鎂，花生四烯酸(AA)，EGTA，其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純；大鼠cAMP ELISA試劑盒(上海普盛生物科技有限公司)。

1.1.3 儀器和器材 Mettler-Toledc電子天平(上海梅特勒-托儀多公司)；TYXN-96多功能智能血液凝聚儀(上海通用)；Labsystems Multiskan MS Microplate Reader型酶標儀(芬蘭制造)；Bio-RAD TC-20細胞計數(shù)儀(日本 Sysmex公司)；渦旋振蕩器 votex-2(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；eppendorf Centrifuge 5430R型離心機(德國eppendorf)；Beckman coulter離心機(美國貝克曼)；15 mL 硅化離心管(corning)；10 mL無菌注射器(上?？等R德企業(yè)發(fā)展集團股份有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠灌胃 Wistar大鼠36只(280 g～330 g)，據(jù)體重和隨機數(shù)字表完全隨機區(qū)組分組，分為6組，按人-動物藥物劑量換算表予空白組(生理鹽水2 mL)、阿司匹林組(20 mg/kg)、速效救心丸救心丸高劑量組(120 mg/kg)、速效救心丸中劑量組(60 mg/kg)、速效救心丸低劑量組(30 mg/kg)、阿魏酸哌嗪組(60 mg/kg)，灌胃7 d，最后一次灌胃半小時后取血。

1.2.2 大鼠腹主動脈取血 Wistar大鼠行3%戊巴比妥稱定質(zhì)量麻醉，剪開皮膚肌肉，找到腹主動脈，3.8%枸櫞酸鈉潤洗的 10 mL 注射器，以腹主動分叉處向心端1 mm～3 mm處穿刺取血，取血后3.8%枸櫞酸鈉1∶9抗凝。

1.2.3 血小板的制備 取血后配平離心(1 000 r/min，8 min)取上清，為富血小板血漿(PRP)，其余血離心(3 000 r/min，15 min)取上清為貧血小板血漿(PPP)。

1.2.4 洗滌血小板的制備 PRP離心(2 500 r/min，10 min)，棄上清用改良臺式緩沖液洗滌兩次后定容吹打開(600 g，10 min)[5]，獲得血小板懸浮液，經(jīng)細胞計數(shù)儀使血小板計數(shù)調(diào)至4.5×108/mL。

1.2.5 加入不同誘導(dǎo)劑測血小板聚集率 采用比濁法在37℃條件下測定血小板聚集率。取 200 μLPRP， 分別加入 ADP(終濃度：15 μM)、膠原(終濃度：0.325 mg/mL)、AA(終濃度：0.05 mM)。血小板聚集率用血小板最大聚集率表示，結(jié)果用抑制率表示。 抑制率(%)=(空白組血小板聚集率—受試物處理組血小板聚集率)/空白組血小板聚集率×100%

1.2.6 血小板內(nèi)cAMP含量測定 血小板懸液加入 ADP(終濃度：20 μM)誘導(dǎo)血小板聚集。5 min 后，加入 10 mM EDTA 終止反應(yīng)，4 000 r/min，4℃離心 10 min，收集上清液。 -20℃凍存。cAMP 含量測定按照試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 組間比較使用單因素方差分析。P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01表示具有顯著差異。應(yīng)用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析，作圖使用GraphPad Prism6.07軟件。

2 結(jié) 果

2.1 各誘導(dǎo)劑對不同藥物干預(yù)后大鼠血小板聚集率的影響 ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率：速效高劑量組、阿魏酸哌嗪組與空白組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，并呈一定的量效關(guān)系趨勢。膠原誘導(dǎo)的血小板聚集率：阿司匹林組、速效中高低劑量組、阿魏酸組與空白組比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。AA誘導(dǎo)的血小板聚集率：阿司匹林組、速效高劑量組、阿魏酸哌嗪組與空白組比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；速效低劑量組與速效高劑量組比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；速效中劑量組與速效高劑量組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各誘導(dǎo)劑對不同藥物干預(yù)后大鼠的血小板聚集影響(±s)

2.2 各誘導(dǎo)劑對不同藥物干預(yù)后大鼠血小板抑制率的影響(見圖1) 阿司匹林組、速效高劑量組、速效中劑量組、速效低劑量組、阿魏酸哌嗪組對ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集的抑制率依次為9.05%、32.87%、11.84%、2.17%、27.55%；對膠原誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集的抑制率依次為55.03%、30.31%、30.97%、21.89%、34.21%；對AA誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集的抑制率依次為60.07%、72.42%、62.73%、10.86%、66.41%。阿司匹林對AA和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集有較大的抑制作用，對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集抑制作用較弱；高劑量速效救心丸及阿魏酸哌嗪對ADP、AA和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集均有有較大的抑制作用；同時，速效救心丸對ADP、AA和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

注：從左到右次序為阿司匹林組、速效救心丸高劑量組、速效救心丸中劑量組、速效救心丸低劑量組、阿魏酸哌嗪組。

圖1 不同誘導(dǎo)劑對不同藥物干預(yù)后血小板聚集抑制率的影響(n=6)

2.3 血小板內(nèi)cAMP含量的測定(見圖2) 模型組與空白組比存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明造模成功。

注：SXH為速效救心丸高劑量組；SXM為速效中劑量組；SXL為速效低劑量組；FA為阿魏酸哌嗪組；Blank為空白組；Control為空白組+20 μM ADP；其余各組均加入20 μM ADP。與空白組比，*P<0.05； 與對照組比，#P<0.05，## P<0.01。

圖2 不同藥物對血小板內(nèi)cAMP的影響(n=6)

3 討 論

冠脈斑塊的破裂或PCI術(shù)導(dǎo)致的血管內(nèi)皮受損，血小板在血管損傷部位的活化聚集，進而形成血栓[6]。AA、ADP以及血管內(nèi)皮下暴露的膠原等誘導(dǎo)劑在血小板活化和聚集過程中起著重要的作用。cAMP是調(diào)節(jié)血小板功能的抑制性細胞內(nèi)第二信使，細胞內(nèi)cAMP水平增加，可以抑制血小板聚集，反之，則血小板聚集作用增強。AA代謝生成的血栓素A2(TXA2)和致密顆粒中釋放的ADP與血小板表面相關(guān)受體結(jié)合，可使胞內(nèi)cAMP濃度下降，引起血小板聚集，導(dǎo)致血栓形成[7-8]。目前臨床上常用的抗血小板藥物阿司匹林和P2Y12抑制劑氯吡格雷主要通過抑制AA和ADP途徑起到抗血小板聚集作用，并已成為冠心病二級預(yù)防以及冠脈介入術(shù)后基礎(chǔ)用藥[9]。然而，這些藥物的運用也存在一定的缺陷：不良反應(yīng)較多(如出血、胃腸功能紊亂、變態(tài)反應(yīng)、中毒反應(yīng)、對肝腎的損害等)；由于多數(shù)藥物作用途徑單一，不能抑制其他血小板激活通路，可引起復(fù)發(fā)性缺血事件；部分病人會出現(xiàn)阿司匹林或/和氯吡格雷藥物抵抗[10-11]。因此，研制出高效、安全性好的抗血小板藥物一直是研究的熱點。

中醫(yī)藥具有多方位、多靶點的干預(yù)作用特點，活血化瘀中藥在臨床上應(yīng)用廣泛并療效確切，對中醫(yī)藥抗血小板聚集作用的深入研究具有積極的臨床意義。

速效救心丸是臨床效果確切的治療冠心病經(jīng)典中成藥，研究表明其具有血管擴張、抗炎、抗氧化、調(diào)脂及促進血管新生的作用[12]，但對血小板功能影響的報道較少。本研究發(fā)現(xiàn)：①中、高劑量速效救心丸能夠抑制大鼠ADP、膠原和AA誘導(dǎo)的血小板聚集，低劑量速效救心丸僅能抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集。不同劑量的速效救心丸抗血小板聚集作用具有一定的量效關(guān)系。②與對照組相比，中、高劑量速效救心丸能夠提高大鼠血小板內(nèi)cAMP的含量，而低劑量速效救心丸有增高血小板內(nèi)cAMP含量的趨勢，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。提示速效救心丸可能通過cAMP途徑起到抗血小板聚集的作用。③阿司匹林能夠降低膠原和AA誘導(dǎo)的血小板聚集，但不能拮抗ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。阿魏酸哌嗪能夠抑制大鼠ADP、膠原和AA誘導(dǎo)的血小板聚集，其抑制療效與高劑量速效救心丸相似，提示速效救心丸發(fā)揮抗血小板聚集作用可能與川芎的有效成分有關(guān)。阿司匹林與阿魏酸哌嗪均能提高大鼠血小板內(nèi)cAMP的含量。速效救心丸能夠抑制多種誘導(dǎo)劑引起的血小板聚集，在本實驗中高劑量組對AA誘導(dǎo)的血小板聚集率顯示最強的抑制作用。

速效救心丸能夠抑制大鼠ADP、膠原和AA誘導(dǎo)的血小板聚集，其機制可能通過增加cAMP的含量而起到抑制血小板活化的作用。速效救心丸抑制血小板聚集作用呈現(xiàn)多環(huán)節(jié)、多靶點的特點，為其冠心病臨床治療提供了新的理論依據(jù)。

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(本文編輯王雅潔)

國家自然科學(xué)基金項目(No.8157364)；上海市中醫(yī)臨床重點實驗室(No.14D Z2273200)；上海市科委課題(No.14401972202)

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院(上海201203)；2.上海市浦東新區(qū)唐鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生中心

王肖龍，E-mail：wxlqy0214@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.15.010

1672-1349(2016)15-1729-04

2016-04-22)