骨髓間充質(zhì)干細胞對癲癇模型認知及海馬區(qū)GABAA受體表達的影響

黑悅 劉衛(wèi)平 魏禮洲 伊西才 陳曉燕

(第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

·功能神經(jīng)外科疾病研究·

骨髓間充質(zhì)干細胞對癲癇模型認知及海馬區(qū)GABAA受體表達的影響

黑悅 劉衛(wèi)平*魏禮洲 伊西才 陳曉燕

(第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

目的探究骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)移植對大鼠癲癇模型認知功能及海馬CA1區(qū)域γ氨基丁酸A受體(GABAARs)的表達的影響。方法成年雄性SD大鼠30只隨機分為正常組(n=10)，模型組(n=10)和實驗組(n=10)。采用匹魯卡品誘導癲癇模型，2 h后移植進行BMSCs移植，28 d后水迷宮檢測認知變化，免疫組化和實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測大鼠海馬CA1區(qū)GABAARs的表達變化。結(jié)果RT-PCR和免疫組化結(jié)果顯示，模型組相比正常組GABAAR α1表達水平(mRNA以及免疫組化染色強度)下調(diào)(Plt;0.05)而GABAAR α4上調(diào)(Plt;0.05)，移植組GABAARs相關(guān)改變比模型組輕微(Plt;0.05)，且認知功能改善明顯(Plt;0.05)。結(jié)論BMSCs移植可調(diào)節(jié)大鼠癲癇模型中海馬區(qū)域GABAARs表達水平并減輕癲癇相關(guān)認知障礙。

骨髓間充質(zhì)干細胞; 癲癇; 認知障礙; 細胞移植; GABAA型受體

癲癇是一種常見病，一方面病理機制十分復(fù)雜，基礎(chǔ)與臨床研究鮮有進展；另一方面相關(guān)治療藥物敏感性差，長期服用副作用大[1]。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植具有安全低毒、效果持久等特點，近年來演變?yōu)榘d癇治療的新興手段[2,3]。目前研究更多專注于BMSCs移植后的生物學特性，比如遷移，分化和整合等，但是對于移植后海馬區(qū)域整體的調(diào)控缺乏系統(tǒng)研究[4～7]。γ氨基丁酸(Gamma aminobutyric acid,GABA)能神經(jīng)傳導對癲癇疾病中神經(jīng)元興奮性和認知功能的調(diào)節(jié)有重要作用[8]。而GABAA型受體(GABAA receptors,GABAARs)介導了GABA能抑制性突觸信號，在癲癇發(fā)病后慢性期α1亞型(主要定位于突觸內(nèi)，參與快速相位抑制)表達下調(diào)，而α4亞型(主要定位于突觸外，參與連續(xù)的緊張性抑制)上調(diào)[7,9]。此種改變與癲癇相關(guān)認知障礙密切相關(guān)[10]。癲癇模型中移植后的BMSCs能夠遷移到海馬區(qū)域，有效降低癲癇發(fā)作頻率并緩解認知障礙，然而對海馬區(qū)域GABAARs的整體調(diào)節(jié)仍未明晰[5,6]。

本實驗擬通過建立匹魯卡品誘導的大鼠癲癇模型，應(yīng)用實時熒光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)，免疫組化和水迷宮技術(shù)觀察慢性期大鼠CA1區(qū)域的GABAARs表達變化以及認知功能的改善情況，以此闡明BMSCs移植在癲癇模型中的新的治療機制。

材料與方法

一、實驗動物和分組

全部健康成年Sprague Dawley(SD)大鼠(雄性，230～250 g)30只，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。實驗動物隨機分為正常組(n=10)，模型組(n=10)和移植組(n=10)。遇到有造模失敗或死亡，則將另外補充。

二、大鼠癲癇模型的制作

按照127 mg/kg體重腹腔注射氯化鋰，18～24 h后腹腔注射匹魯卡品(pilocarpine)350 mg/kg，注入前30 min腹腔注入東莨宕堿1 mg/kg，以拮抗其外周膽堿能反應(yīng)，觀察癲癇發(fā)作情況。癲癇發(fā)作等級按Racine標準判定[11]。當大鼠出現(xiàn)肢體陣攣或全身強直陣攣頻繁或持續(xù)1 h以上時，按300 mg/kg體重腹腔注射10%水合氯醛終止癲癇發(fā)作。在此次癲癇持續(xù)狀態(tài)之后對其進行24 h視頻監(jiān)測，將Racine分級Ⅲ級以上發(fā)作定義為有效發(fā)作。

三、骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)和移植

取2周齡SD雄性大鼠，腹腔麻醉(10%水合氯醛，3 mg/kg)后浸泡在75%酒精中15 min，取出雙側(cè)股骨骨髓，用5 ml生理鹽水反復(fù)沖洗后收集5 ml骨髓液，2 500 rpm/min離心20 min，生理鹽水洗2遍后加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基(alpha-minimum essential medium,α-MEM)，10%胎牛血清(fetal bovine serum,Hyclone,USA)接種于25 ml塑料培養(yǎng)瓶，放人37℃,5% CO2的孵箱中靜置培養(yǎng)48 h后換液。細胞鋪滿培養(yǎng)瓶平底80%左右時用胰酶消化傳代。取第三代骨髓間充質(zhì)干細胞待用。模型建立2 h后，腹腔麻醉(10%水合氯醛，3 ml/kg)，經(jīng)尾靜脈注射1 ml濃度為1×107個第三代骨髓間充質(zhì)干細胞，模型組和正常組經(jīng)尾靜脈注射1 ml生理鹽水。

四、水迷宮行為學分析

水迷宮測試一共分為兩步。首先為定位航行測試(place navigation)，各組大鼠(n=5)進行連續(xù)4 d的平臺尋找訓練。每天分別從4個象限固定的位置入水，時間限定為60 s，各象限之間間隔15 s，記錄大鼠不同入水點找到平臺所需的時間，即游泳潛伏期(4次游泳潛伏期平均值)。若其沒有找到平臺，則記為60 s，同時仍使大鼠站在平臺上15 s。而后是空間探索測試(spatial probe)，在第5天將平臺撤去后記錄大鼠從4個象限不同入水點到平臺所在象限停留時間以及穿越平臺所在區(qū)域的次數(shù)，時間設(shè)定為60 s，其余相同。

五、大鼠腦組織標本制備及GABAARs免疫組化染色

模型建立后第28天分別取各組5只SD大鼠，以200 ml生理鹽水灌注后用4%多聚甲醛灌注固定。常規(guī)石蠟包埋，常規(guī)脫蠟至水后檸檬酸抗原修復(fù)分別加入GABAAR α1(1∶500,Abcam,美國)和 GABAAR α4(1∶500,Sigma,美國)抗體，在4℃冰箱中賦予過夜，洗脫。滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育2 h。二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)染色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水透明并封片，光鏡下分析計數(shù)。

六、大鼠海馬CA1區(qū)域GABAARs的RT-PCR檢測

麻醉狀態(tài)下經(jīng)左心室持續(xù)灌注200 ml 0.01 mol/L PBS后，在冰上斷頭輕柔分離大鼠海馬CA1組織(而后可存放于-80℃冰箱中)，使用TRIzol試劑盒 (Invitrogen,美國)提取總RNA。RT-PCR反應(yīng)混合物包含SYBR?Premix ExTaqTMII (TaKaRa,大連)10 μl，正反引物各1 μl，cDNA 2 μl及6 μl無核酸酶的水。各引物序列分別為(GABAAR alpha1) 正:5'-CTC TGA CTA TCT TTG GGC CTG GAC-3' 和反:5'-TCC TCG TGA AGA CAG TGG TGT TG-3'; (GABAAR alpha4) 正5'-GCC CGG AAA ATT TTA CCC GTA TC-3' 和反:5'-GAG CTG TCA TGT TAT GGG AGA C-3'; (GAPDH) 正:5'-GCA TTG CTC TCA ATG ACA ACT T-3' 和反:5'-GGC CTC TCT CTT GCT CTC AGT-3'.。

七、統(tǒng)計分析

所有定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。雙因素方差分析用于水迷宮各參數(shù)分析，單因素方差分析用于檢測GABAARs的表達水平。以Plt;0.05為有統(tǒng)計學意義。

圖1 水迷宮認知測試
Fig 1 Learning and memory tests by Morris Water Maze
A:The escape latency; B:The percentage of time spending in the target quadrant; C:The number of platform crossings.
aP=0.0044,lt;0.01 for training 3 d;bP=0.0006,lt;0.001 for training 4 d and single probe tasks;cP=0.0288,lt;0.05 in the percentage of time spending in the target quadrant;dP=0.0411,lt;0.05 in the number of platform crossings compared to positive control group.
The data are Mean ± SD. N=5 per group.

圖2 GABAARs的免疫組化染色及RT-PCR結(jié)果
Fig 2 Immunohistochemical staining and RT-PCR results of GABAARs
A～F:Representative images of GABAAR α1 and α4-positive cells (positive control group and experimental group) in the hippocampal CA1 subfield (A～D) and quantification analysis among the three groups (E,F); G～H:The GABAAR α1 and α4 mRNA levels. BMSCs transplantation partly reversed the changes.
aP=0.0457,lt;0.05 of GABAAR α1,bP=0.0076,lt;0.01 of GABAAR α4,vspositivecontrol group;cP=0.0473,lt;0.05 of GABAAR α1,dP=0.0476,lt;0.05 of GABAAR α4vspositive control group.
The data are Mean±SD. Scale bar=20 μm.

結(jié) 果

一、水迷宮

如圖1所示，模型組相比正常組的游泳潛伏期有明顯差距(Plt;0.05)。實驗組(BMSCs移植)在訓練的3 d游泳潛伏期相比模型組顯著下降(aP=0.0044,lt;0.01)，而在4 d則更為明顯(bP=0.0006,lt;0.001)。而在隨后的空間探索測試中，實驗組相比模型組仍舊顯現(xiàn)出更強的探索能力(cP=0.0288,lt;0.05目標象限停留時間；dP=0.0411,lt;0.05穿越平臺所在區(qū)域的次數(shù))。

二、免疫組化

如圖2A-F所示，模型組GABAARα1陽性細胞相比正常組顯著增多(Plt;0.05)，而GABAARα4呈現(xiàn)相反的改變(Plt;0.05)。相比模型組，BSMCs移植(實驗組)不同程度的調(diào)節(jié)了這種雙向的GABAARs受體的變化(aP=0.0457,lt;0.05 GABAARα1;bP=0.0076,lt;0.01 GABAARα4)。

三、RT-PCR

與免疫組化結(jié)果相對應(yīng)，大鼠癲癇模型的海馬CA1區(qū)GABAARs mRNA水平也呈現(xiàn)相應(yīng)的雙向變化(Plt;0.05,圖2 G～H)。與此同時，實驗組相比模型組，GABAARs mRNA表達水平顯著改變(cP=0.0473,lt;0.05 GABAARα1,dP=0.0476,lt;0.05 GABAARα4)。

討 論

骨髓間充質(zhì)干細胞移植目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于治療腦損傷，亨廷頓病，肌萎縮側(cè)索硬化和癲癇等疾病[3]。雖然其分化能力有限，但旁分泌和遷移能力較強[12]，可以靶向遷移到海馬區(qū)域后可以旁分泌眾多細胞因子，比如GABA,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)等來改善微環(huán)境[5,6,13]。BMSCs移植后對在體GABA能系統(tǒng)的調(diào)控作用已有報道，然而其是否對癲癇慢性期大鼠海馬區(qū)GABAARs的表達產(chǎn)生影響仍未明晰。本研究結(jié)果顯示BMSCs移植后28 d，移植組在MWM各項指標以及GABAARs的表達變化中都不同程度的優(yōu)于模型組，提示BMSCs可以通過改變抑制性突觸中的關(guān)鍵分子靶點來調(diào)節(jié)GABA能神經(jīng)傳導，從而起到認知改善的作用。

認知障礙在嚙齒動物模型和人顳葉癲癇 (temporal lobe epilepsy,TLE)中均有發(fā)生[1]。關(guān)于癲癇相關(guān)認知認知障礙的潛在機制有許多假說，如標記GABA能細胞選擇性損傷以及海馬GABA神經(jīng)傳導水平下降等[14]。越來越多的證據(jù)表明作為海馬區(qū)域?qū)W習和記憶至關(guān)重要，調(diào)控海馬區(qū)域GABAARs的表達對認知障礙的改善有積極作用[15]。我們認為移植后BMSCs對GABAARs的調(diào)節(jié)在認知功能改善中扮演了重要角色。

本實驗通過建立匹魯卡品誘導的大鼠癲癇模型，觀察了BMSCs移植后對GABAARs表達以及癲癇相關(guān)認知障礙的改善作用。證明BMSCs移植可通過調(diào)節(jié)海馬CA1區(qū)GABAARs水平來達到認知功能改善的療效，為癲癇模型中干細胞移植提供了新的理論基礎(chǔ)。然而，BMSCs如何調(diào)控GABAARs，其中的信號通路和突觸結(jié)構(gòu)中的分子靶點仍有待進一步研究。

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EffectofbonemarrowmesenchymalstemcellsoncognitionandtheexpressionofGABAARsinthehippocampusinaratmodelofepilepsy

HEIYue,LIUWeiping,WEILizhou,YIXicai,CHENXiaoyan

DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xian710032,China

ObjectiveThe effect of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) transplantation on epilepsy-induced cognitive deficits and the altered expression of GABAA receptors (GABAARs) in the hippocampal CA1 subfield is discussed.MethodsA total of 30 adult male SD rats were randomly divided into negative control group (n=10),positive control group (n=10) and the experimental group (n=10). BMSCs transplantation was performed at 2 h after induction of SE. After 28 days,morris water maze (MWM) test was performed to detect the cognitive changes,and immunohistochemistry and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to evaluate the expression of GABAARα1 and α4 subunits in the hippocampal CA1 subfield.ResultsRT-PCR and immunohistochemistry showed that compared to normal group,GABAAR α1 expression (mRNA and immunohistochemical staining intensity) was decreased (Plt;0.05) while the expression of GABAAR α4 was increased (Plt;0.05) in the positive control group; BMSCs transplants partly reversed these changes (Plt;0.05),and MWM showed that cognitive ability in the experimental group was improved significantly (Plt;0.05) compared to positive control group.ConclusionBMSCs transplantation can regulate the expression of GABAARs in the hippocampus and restore the cognitive ability in a rat model of epilepsy.

Bone marrow mesenchymal stem cells; Epilepsy; Cognitive deficits; Cell transplantation; GABAA receptors

1671-2897(2016)15-293-04

R 742.1

A

陜西省科技統(tǒng)籌基金資助項目(2013KTCL03-08)；社會發(fā)展引導計劃-醫(yī)學研究基金資助項目(SF1423-2)

黑悅，碩士研究生， E-mail：15594680119@163.com

*通訊作者：劉衛(wèi)平，教授、主任醫(yī)師，博士生導師， Email：liuwp@ fmmu.edu.cn

2015-11-12；

2016-02-20)