P-cadherin在‘高山美利奴羊’胚胎皮膚毛囊基板形成過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律

劉善博，岳耀敬，，郭婷婷，王天翔，史兆國(guó)，袁超，王喜軍，劉繼剛，劉建斌，張玲玲，郭健，牛春娥，孫曉萍，馮瑞林，李范文，楊博輝，

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院羊育種工程中心，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省綿羊繁育技術(shù)推廣站，甘肅 張掖 734031)

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P-cadherin在‘高山美利奴羊’胚胎皮膚毛囊基板形成過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律

劉善博1，岳耀敬1，2，郭婷婷2，王天翔3，史兆國(guó)1，袁超2，王喜軍3，劉繼剛3，劉建斌2，張玲玲2，郭健2，牛春娥2，孫曉萍2，馮瑞林2，李范文3，楊博輝1，2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院羊育種工程中心，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省綿羊繁育技術(shù)推廣站，甘肅 張掖 734031)

【目的】 研究P-cadherin在‘高山美利奴羊’皮膚毛囊(hairfollicle,HF)基板形成過(guò)程中的分布及表達(dá)情況，初步探討P-cadherin是否可以作為‘高山美利奴’羊毛囊基板的標(biāo)記物.【方法】 以90-114 d胎齡的‘高山美利奴羊’腹部皮膚作為材料，通過(guò)冰凍切片、HE染色、熒光定量PCR、免疫組化技術(shù)研究P-cadherin在毛囊基板形成過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律.【結(jié)果】 免疫組化結(jié)果顯示，P-cadherin在胚胎毛囊形成時(shí)期的表皮、表皮基底層、真皮、隆突基底層、基板以及毛芽中都呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá).熒光定量結(jié)果顯示，在胎齡90、96、102、108、114 d的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.016 7±0.008 4)(0.113 4±0.052 9)(0.937 8±0.245 3)(0.068 4±0.026 8)(0.062 3±0.045 6).90 d與96 d相比差異顯著(P=0.049 3<0.05)，96 d與102 d相比差異不顯著(P=0.088 9>0.05)，102 d與108 d相比差異顯著(P=0.023 5<0.05)，108 d與114 d相比差異不顯著(P=0.512 4>0.05).96 d以后的相對(duì)表達(dá)量高于90 d的相對(duì)表達(dá)量.90 d到102 d相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，102 d以后相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，108 d以后相對(duì)表達(dá)量趨于平穩(wěn)，但是略高于114 d的相對(duì)表達(dá)量，有降低的趨勢(shì).【結(jié)論】初步可以斷定P-cadherin可以作為‘高山美利奴羊’毛囊基板的標(biāo)記物.

甘肅‘高山美利奴羊’；毛囊基板；P-cadherin

影響細(xì)毛羊經(jīng)濟(jì)效益的主要性狀有羊毛的產(chǎn)量、細(xì)度、凈毛率等，這些性狀中產(chǎn)毛量與毛囊的(hair follicle,HF)發(fā)育有直接的關(guān)系.毛囊是控制毛絨生長(zhǎng)的器官.‘高山美利奴羊’次級(jí)毛囊形態(tài)發(fā)生時(shí)期已經(jīng)被確定[1-4].毛囊形態(tài)發(fā)生開(kāi)始于基板(placode，P)的形成，基板是間葉細(xì)胞凝集于排列整齊的表皮細(xì)胞下方形成的一種特殊結(jié)構(gòu)，這些特定的結(jié)構(gòu)之間的相互作用進(jìn)一步引起基板的生長(zhǎng)[5].基板作為毛囊發(fā)育的前體器官，其形成過(guò)程涉及一系列復(fù)雜的表皮和真皮之間的信號(hào)通路.目前在毛囊基板形態(tài)發(fā)生分子機(jī)制的研究中，多以多種類(lèi)型組織(真皮、表皮、毛囊等)混合的皮膚做為起始樣本，并未分離出勻質(zhì)性基板組織，這使得調(diào)控基板發(fā)生的關(guān)鍵基因生物差異有可能被平均值所掩蓋或是被誤認(rèn)做為技術(shù)噪音[6]，亟需尋找一種基板細(xì)胞標(biāo)志物，以高效分離基板細(xì)胞進(jìn)行基板單細(xì)胞功能基因組研究.

目前，P-cadherin常用于人和鼠等毛囊基板形態(tài)發(fā)生研究中的標(biāo)志物.P-cadherin屬于鈣粘素(Cadherin)家族里面的一種，由CDH3編碼，其表達(dá)受Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)節(jié).研究結(jié)果表明，HF從原始表皮開(kāi)始進(jìn)行初始分化時(shí)Wnt信號(hào)能夠促進(jìn)β-catenin的產(chǎn)生.當(dāng)胚胎表皮細(xì)胞重新定位形成上皮芽胞隨后形成成熟的HF時(shí)β-catenin/LEF1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物會(huì)使E-cadherin的表達(dá)量減少.因此，在這個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，間質(zhì)細(xì)胞上皮界面主要含有的是P-cadherin，作為毛發(fā)的前體細(xì)胞[7-8].目前對(duì)于P-cadherin在哺乳動(dòng)物組織尤其是在人類(lèi)和小鼠毛囊里面的分布和表達(dá)情況已經(jīng)有了比較深入的研究.其某些表達(dá)特性與報(bào)道的關(guān)于毛囊和表皮標(biāo)記物的特性有些相似.研究證明，其永恒存在于小鼠表皮，并且在外根鞘(ORS)以及最接近真皮乳頭的毛母質(zhì)細(xì)胞(HMCs)和次級(jí)毛芽(KCs)中表達(dá)[8].有報(bào)道顯示，P-cadherin在7-8周人類(lèi)胚胎皮膚中基底層細(xì)胞中有表達(dá)，但是在上皮細(xì)胞中不表達(dá)[9].此外，在人類(lèi)醫(yī)學(xué)的相關(guān)研究中證明P-cadhrin與脫發(fā)、禿發(fā)和多毛癥等毛發(fā)疾病密切相關(guān)[10-11].研究顯示，在人類(lèi)毛囊發(fā)育過(guò)程中，P-cadhrin是唯一一個(gè)在內(nèi)部毛母質(zhì)細(xì)胞(IHM)表達(dá)的鈣粘蛋白[8].但P-cadhrin是否是‘高山美利奴羊’毛囊基板的標(biāo)記物還需進(jìn)一步研究.

因此，本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和免疫組化技術(shù)，研究‘高山美利奴羊’胎兒皮膚HF形態(tài)形成過(guò)程中基板形成時(shí)期P-cadhrin在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況，初步研究P-cadhrin在‘高山美利奴羊’毛囊基板形態(tài)發(fā)生中的調(diào)控作用，以期為闡明P-cadhrin能否作為‘高山美利奴羊’毛囊基板形態(tài)發(fā)生調(diào)控中的標(biāo)記物和研究綿羊HF基板形成的分子調(diào)控機(jī)制研究提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在甘肅省綿羊繁育技術(shù)推廣站(原甘肅省皇城綿羊繁育試驗(yàn)場(chǎng))選擇體格均勻的經(jīng)產(chǎn)2～3歲‘高山美利奴母羊’15只，用同一只種公羊進(jìn)行人工授精，以人工授精日為第0日，分別于胚胎90、96、102、108、114 d日齡剖取胎兒，每次3只，在其體側(cè)部切取2 cm2的皮膚.0.9%生理鹽水沖洗處理后裝入凍存管，迅速投入液氮中保存?zhèn)溆?

1.2 試劑和儀器

冰凍切片機(jī)(Leica 9500)、顯微鏡(Leica DM5500)，二甲苯、無(wú)水乙醇、冰醋酸、甲醇、多聚甲醛、中性樹(shù)脂、30%蔗糖溶液、30% H2O2、蘇木素、伊紅、OCT包埋劑，DAB顯色劑，1%PBS溶液等試劑均購(gòu)自福建邁新公司.一抗：P-cadherin SABC即用型試劑盒(BA0674)、二抗：IgG(SA1029)均購(gòu)自武漢博士德生物工程公司.TRNzol總RNA提取試劑盒(DP405)、Quant One Step RT-PCR kit(KR113)、SuperReal PreMix (SYBR Green)(FP204)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理 首先，將新鮮的皮膚組織樣在4%多聚甲醛中固定24 h后放在30%的蔗糖溶液中過(guò)夜.其次，用梯度酒精脫水.最后，對(duì)處理好的組織塊進(jìn)行修塊和包埋.

1.3.2 HE染色 對(duì)90、96 d的組織進(jìn)行冰凍切片，尋找基板形成時(shí)期的不同形態(tài).將冰凍切片機(jī)在-25 ℃提前預(yù)冷24 h后對(duì)包埋好的組織塊進(jìn)行切片，切片厚度為10 μm，貼片；將貼好的切片自然晾干，在4%多聚甲醛中浸泡30 min進(jìn)行固定；用PBS沖洗后進(jìn)行蘇木素輕度染色.

1.3.3 免疫組化 將冰凍切片機(jī)在-25 ℃提前預(yù)冷24 h后對(duì)包埋好的組織塊進(jìn)行切片，切片厚度為8 μm，貼片；將貼好的切片自然晾干，在4%多聚甲醛中浸泡30 min進(jìn)行固定；在30% H2O2+純甲醇50份混合的溶液中室溫浸泡30 min(此步的目的是將內(nèi)源性過(guò)氧化物酶進(jìn)行滅活)，用超純水洗1-2次；滴加5% BSA封閉液，室溫孵育20 min，將多余的封閉液甩去，此步不洗；滴加(1∶75)稀釋濃度的小鼠一抗，37 ℃孵育3 h.PBS洗3次，2 min/次；滴加生物素標(biāo)記的抗小鼠IgG，37 ℃孵育20 min，PBS洗3次，2 min/次；加SABC試劑，37 ℃孵育20 min，PBS洗4次，5 min/次；進(jìn)行DAB顯色，室溫下顯色5 min；蘇木素輕度復(fù)染約10 s，蒸餾水沖洗2～3 min；梯度酒精脫水、透明、封片、微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果、拍片.

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 HE染色及免疫組化結(jié)果

基板是由間質(zhì)細(xì)胞排列在表皮細(xì)胞的下方形成的一種特殊結(jié)構(gòu)，其形成大概分為4個(gè)時(shí)期：真核細(xì)胞在表皮下方均勻排列(圖1-A)；真核細(xì)胞逐漸聚集于表皮下方(圖1-B)；真核細(xì)胞繼續(xù)聚集形成隆突(圖1-C)；形成基板(圖1-D).免疫組化結(jié)果顯示P-cadherin在基板形態(tài)發(fā)生中都有表達(dá).其主要是在表皮(圖2-A-a)、真皮(圖2-A-b)、表皮中間層(圖2-B-a)、表皮基底層(圖2-B-b)、隆突底部(圖2-C-b)、基板(圖2-D-b)中表達(dá).

表1 P-cadherin基因的引物序列

A：a 表皮；b 真皮 (200×)；B：a 表皮；b 真皮 (200×)；C：a 表皮；b 隆突(200×)；D：a 表皮；b 基板 (200×).圖1 ‘高山美利奴羊’毛囊基板形成不同時(shí)期Fig.1 Different gestational fetal skin follicles substrate of Alpine Merino

A：a 表皮；b 真皮 (200×) ；B：a 表皮中間層；b 表皮基底層 (400×)；C：a 表皮；b 隆突(400×)；D：a 表皮；b 基板 (400×)；E：a 表皮；b 毛芽.圖2 ‘高山美利奴羊’毛囊基板形成不同時(shí)期P-cadherin的表達(dá)情況Fig.2 The expression patterns of P-cadherin in different gestational fetal skin follicles substrate of Alpine Merino

2.2 熒光定量結(jié)果

對(duì)熒光定量數(shù)據(jù)進(jìn)行SPSS分析，結(jié)果顯示：在胎齡90、96、102、108、114 d的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.016 7±0.008 4)(0.113 4±0.052 9)(0.937 8±0.245 3)(0.068 4±0.026 8)(0.062 3±0.045 6).90 d與96 d相比差異顯著(P=0.049 3<0.05)，96 d與102 d相比差異不顯著(P=0.088 9>0.05)，102 d與108 d相比差異顯著(P=0.023 5<0.05)，108 d與114 d相比差異不顯著(P=0.512 4>0.05).96 d以后的相對(duì)表達(dá)量都要高于90 d的相對(duì)表達(dá)量(圖3).90 d到102 d相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，102 d以后相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，108 d以后相對(duì)表達(dá)量趨于平穩(wěn)，但是略高于114 d的相對(duì)表達(dá)量，有降低的趨勢(shì).

圖3 不同胎齡的‘高山美利奴羊’胎兒皮膚毛囊基板中P-cadherin相對(duì)表達(dá)量Fig.3 The relative expression of P-cadherin in different gestational fetal skin follicle placode of Alpine Merino

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)‘高山美利奴羊’腹部皮膚進(jìn)行定點(diǎn)、定量的研究，發(fā)現(xiàn)P-cadherin在‘高山美利奴羊’毛囊基板形態(tài)發(fā)育時(shí)期的表皮、真皮、隆突區(qū)、隆突基底層、基板和毛釘中都有表達(dá).這與之前報(bào)道的在P-cadhrin小鼠表皮組織里面有表達(dá)并且是持續(xù)表達(dá)相符合[13].從熒光定量的結(jié)果可以看出從表皮細(xì)胞開(kāi)始聚集到基板形成時(shí)期P-cadhrin96 d以后P-adherin的表達(dá)量逐漸降低，這與之前所報(bào)道的在人類(lèi)毛發(fā)生長(zhǎng)周期中期P-cadherin的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸減弱的趨勢(shì)相一致[14]，證明P-cadherin在表皮終末分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[15].另外，本試驗(yàn)結(jié)果中基板形成時(shí)期P-adherin的相對(duì)表達(dá)量(圖2)都要明顯高于表皮中的表達(dá)量(圖2)，這與報(bào)道的人類(lèi)基板中的表達(dá)量明顯高于表皮中的表達(dá)量相一致[7].

目前，已經(jīng)報(bào)道的一些關(guān)于毛囊干細(xì)胞和表皮干細(xì)胞的標(biāo)記物具有一定的特征：

1) 在細(xì)胞中所處的位置不同：位于細(xì)胞膜的有整合素、CD34、CD200和ABCG2(轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超蛋白家族)等；位于細(xì)胞質(zhì)的有角蛋白和巢蛋白等；位于細(xì)胞核的有p63、Tcf3(人類(lèi)T細(xì)胞因子)、Lgr5、Lhx2、Sox9和NFATc1(活化T細(xì)胞核因子1)等[16].

2) 特定的表達(dá)部位：ABCG2集中表達(dá)于表皮基底層和毛囊隆突區(qū)[17].Sox9集中表達(dá)于毛囊的外根鞘[18].CK14在云南半細(xì)毛羊毛囊干細(xì)胞中表達(dá)，在成纖維細(xì)胞中則不表達(dá)[19].p63在角膜緣的基底細(xì)胞表達(dá)但是在角膜表面的短暫增殖細(xì)胞則不表達(dá)[20].

3) 特定的表達(dá)種屬：CD34只在小鼠毛囊中表達(dá)，但不在人類(lèi)中表達(dá)[21].

4) 不同時(shí)期或者不同部位表達(dá)量不同：β1整合素在ESCs細(xì)胞表面高度表達(dá)，但是在細(xì)胞有絲分裂后卻不表達(dá)[22].

從本試驗(yàn)免疫組化結(jié)果可以看出在綿羊毛囊基板形成時(shí)P-cadherin有一定的表達(dá)部位，其集中在表皮、表皮基底層、隆突基底層和基板基底層表達(dá).從熒光定量結(jié)果可以看出P-cadherin在毛囊發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)量不同：從90 d間葉細(xì)胞開(kāi)始聚集到96 d基板和毛芽形成，相對(duì)表達(dá)量顯著增加；從102 d初級(jí)毛囊產(chǎn)生到108 d形成再分化次級(jí)毛囊一直到114 d次級(jí)毛囊產(chǎn)生相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，108 d和114 d趨于平穩(wěn)，但是仍然低于96 d.因此，可以初步斷定P-cadherin可以作為‘高山美利奴羊’毛囊基板的標(biāo)記物.

4 結(jié)論

本研究對(duì)P-cadherin在‘高山美利奴羊’毛囊基板形態(tài)發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)變化規(guī)律進(jìn)行了初步研究，得出P-cadherin參與‘高山美利奴羊’毛囊基板形態(tài)發(fā)生的調(diào)控，并且可以初步斷定P-cadherin可以作為‘高山美利奴羊’毛囊基板的標(biāo)記物.

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(責(zé)任編輯 李辛)

Expression ofP-cadherinin the process of formation in alpine merino sheep embryo skin follicle placode

LIU Shan-bo1,YUE Yao-jing1,2,GUO Ting-ting2,WANG Tian-xiang3,SHI Zhao-guo1,YUAN Chao2, WANG Xi-jun3,LIU Ji-gang3，LIU Jian-bin2,ZHANG Ling-ling2,GUO Jian2,NIU Chun-e2, SUN Xiao-ping2,FENG Rui-lin2,LI Fan-wen3,YANG Bo-hui1,2

(1.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Sheep Engineering Breeding Center,Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730050,China；3.Gansu Province Sheep Breeding Technology Promotion Station,Zhangye 734031,China)

【Objective】 To analyze the expression ofP-cadherinon Alpine Merino sheep skin during hair follicle (HF) placode morphogenesis,and to develop a marker of hair follicle placode.【Method】 Gansu Alpine sheep skin from 90 d to 114 d gestational age of on the abdomen was used as material,through the frozen sections,hematoxylin and eosin (HE) staining,fluorescence quantitative PCR and immunohistochemistry of technology to research the expression ofP-cadherinduring hair follicle placode morphogenesis.【Result】P-cadherinwas expressed in the epidermis,the basal layer of the epidermis,dermis,carina basal layer,placode and hair buds during hair follicle placode morphogenesis.The relative expression levels of 90 d,96 d,102,108 d,114 d were (0.008 4±0.016 7)(0.113 4±0.052 9)(0.937 8±0.245 3)(0.068 4±0.026 8)(0.062 3±0.045 6),respectively.There was a significantly different between 90 d and 96 d (P=0.049 3<0.05),and 102 d and 108 d (P=0.023 5<0.05).No significant was found between 96 d and 102 d (P=0.088 9>0.05),and 108 d and 114 d (P=0.512 4>0.05).After 90 d,the relative expression level gradually increased,the relative expression level of 102 d reached the maximum,and the relative expression amount decreased gradually after 102 d,and the relative expression level was stable after 108 d.【Conclusion】P-cadherincan be used as a marker of Alpine Merino sheep hair follicle placode.

Alpine Merino sheep;hair follicle placodes;P-cadherin

劉善博(1988-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖.E-mail:liushanbo2013@163.com

楊博輝，男，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)檠虻倪z傳育種.E-mail:yangbh2004@163.com

國(guó)家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系 “分子育種崗位”(Nycytx-40-3)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院“細(xì)毛羊資源與育種”創(chuàng)新工程(CAAS-ASTIP-2015-LIHPS)；國(guó)家自然科學(xué)青年基金“基于單細(xì)胞測(cè)序研究非編碼RNA調(diào)控綿羊次級(jí)毛囊發(fā)生的分子機(jī)制”(31402057)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(BRF1610322014006).

2015-09-06；

2016-01-11

S 826.9+1

A

1003-4315(2016)05-0001-06