高產(chǎn)果膠酶酵母菌株篩選及產(chǎn)酶條件研究

賈蘭蘭，程超，王金鑫，王發(fā)亮，王婧

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

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高產(chǎn)果膠酶酵母菌株篩選及產(chǎn)酶條件研究

賈蘭蘭，程超，王金鑫，王發(fā)亮，王婧

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

【目的】 篩選出具有地域特色高產(chǎn)果膠酶的酵母菌株，改善葡萄酒品質(zhì).【方法】 試驗(yàn)以156株酵母菌株為研究對(duì)象，經(jīng)初篩、復(fù)篩選出酶活力較高的菌株MQFEC-2，并利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)該菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化.【結(jié)果】 當(dāng)產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH值為5.0，產(chǎn)酶溫度為30 ℃，接種量為6.0%，產(chǎn)酶時(shí)間為72 h時(shí)，此菌株產(chǎn)酶的酶活力最高，通過驗(yàn)證試驗(yàn)得其產(chǎn)酶酶活為35.85 U/mL；各因素對(duì)酶活力影響大小依次為：產(chǎn)酶溫度>培養(yǎng)基初始pH值>產(chǎn)酶時(shí)間>接種量.

果膠酶；酵母菌株；篩選；產(chǎn)酶條件

果膠酶是能分解果膠物質(zhì)的一類酶的總稱，主要包括原果膠酶、果膠脂酶、果膠裂解酶以及多聚半乳糖醛酸酶四大類，因其能有效分解果肉組織中的果膠物質(zhì)，而廣泛應(yīng)用于食品加工及釀酒工業(yè)[1].在現(xiàn)代葡萄酒釀造中，果膠酶更是重要輔料，果膠酶能夠提高葡萄出汁率，促進(jìn)葡萄汁澄清，增強(qiáng)色素、單寧和果香的浸提效果，對(duì)葡萄酒品質(zhì)的改善和提升具有十分重要的作用[2-3].果膠酶作為工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中的一種重要輔料，產(chǎn)酶菌種的獲得一直是國內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一[4].

酵母菌是葡萄酒釀造中的重要微生物，原產(chǎn)地環(huán)境中可以篩選出充分展現(xiàn)該地域特色的酵母，并釀出風(fēng)格獨(dú)特、具有品種典型性的葡萄酒.酵母篩選已經(jīng)涉及到酵母菌株檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，提高葡萄酒的色澤，香氣和其他工藝性能等方面[5-8].葡萄酒酵母菌種性狀的好壞直接關(guān)系到葡萄酒的口感和風(fēng)味，決定葡萄酒品質(zhì)的優(yōu)劣，不同酵母菌種的代謝特征對(duì)葡萄酒釀造具有十分重要的意義[9].有研究表明，酵母產(chǎn)生的果膠酶能夠分解果膠，破壞葡萄組織，不僅能提高葡萄的出汁率，有利于葡萄酒的澄清，還能促進(jìn)色素的萃取和色澤的穩(wěn)定[10-11].

目前已經(jīng)獲得了一些生產(chǎn)微生物果膠酶的菌種，包括細(xì)菌、霉菌、酵母菌和放線菌.國內(nèi)對(duì)果膠酶研究始于20世紀(jì)60年代，目前仍然在果膠酶的菌種選育、生產(chǎn)工藝和應(yīng)用方面不斷研究.田英華等[12]選育了一株高產(chǎn)果膠酶的黑曲霉突變株HYA4，在優(yōu)化的發(fā)酵條件下酶活力達(dá)1 285 U/g.楊輝等[13]以蘋果渣為產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑，利用黑曲霉菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶活力為174.54 U/g.但對(duì)于葡萄酒釀造來說，葡萄汁或葡萄酒pH值介于2.9～3.5，只有酸性果膠酶能夠得到較好的效果，而目前對(duì)于酸性果膠酶高產(chǎn)酵母菌株的篩選研究報(bào)道較少，因此，從葡萄酒產(chǎn)區(qū)環(huán)境中篩選具有高活力的果膠酶酵母菌株，是得到高產(chǎn)果膠酶菌株的最直接方法.

本試驗(yàn)通過對(duì)156株野生酵母菌株進(jìn)行篩選和酶活測(cè)定，利用聚半乳糖醛酸瓊脂培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行初步篩選，以橘皮粉為產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑，經(jīng)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究，旨在篩選出具有地域特色高產(chǎn)果膠酶的酵母菌株，從而改善葡萄酒品質(zhì)，為釀造出更優(yōu)質(zhì)的葡萄酒提供相關(guān)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源 甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室收集保存的156株釀酒酵母菌株，繼代培養(yǎng)15代所得菌株.

1.1.2 YEPD培養(yǎng)基 酵母膏1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，瓊脂2.0%，121 ℃滅菌20 min.

1.1.3 聚半乳糖醛酸瓊脂培養(yǎng)基 聚半乳糖醛酸12.5 g、磷酸二氫鉀6.8 mL(pH 3.5)、酵母膏6.7 g、葡萄糖10 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL、121 ℃下滅菌20 min.

1.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基 桔皮粉2.0 g、硫酸銨0.2 g、酵母膏0.5 g、K2HPO40.2 g、MgSO40.2 g、NaCl 0.1 g、MnSO4·H2O 0.25 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.75 mg、蒸餾水100 mL、pH 6.0、121 ℃滅菌20 min.

聚半乳糖醛酸、半乳糖醛酸、釕紅均購自美國Sigma公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

827型pH計(jì)(瑞士萬通公司)；TD5A-WS型臺(tái)式低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；CP214型電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)；GZX-GF101-Ⅱ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；HH-S型電熱恒溫水浴鍋(金壇市恒豐儀器制造有限公司)；紫外-可見分光光度計(jì)(Thermo Fisher scientific公司)；SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；SPX-150-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；NRY-200型恒溫震蕩培養(yǎng)器(上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司).

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)酶菌株初篩 將分離純化的酵母菌株接種于聚半乳糖醛酸瓊脂培養(yǎng)基[14-16]，30 ℃培養(yǎng)4 d.用蒸餾水沖去平板上的菌落后，用0.08 g/100 mL的釕紅染色，2 h后觀察其顏色變化，出現(xiàn)紫色圈的說明其產(chǎn)果膠酶，紫色的深淺代表產(chǎn)酶強(qiáng)弱.

1.3.2 產(chǎn)酶菌株復(fù)篩 將初篩得到的紫色圈顏色較深的菌株接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在50 mL三角瓶中裝入30 mL培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH為5.0，轉(zhuǎn)速180 r/min，30 ℃培養(yǎng)48 h后，取產(chǎn)酶液8 000 r/min離心10 min，吸取上清液適當(dāng)稀釋后作為粗酶液，采用DNS法測(cè)定粗酶液中果膠酶活力，篩選出酶活力較高的菌株.

1.3.3 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照王薇等[17]的方法并修改.精確稱取1 g半乳糖醛酸用pH5.0的磷酸緩沖溶液定容至1 000 mL，獲得1 mg/mL的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液.取6支15 mL的刻度試管編號(hào)，并按表1加入試劑，沸水浴10 min后立即用流水冷卻，加蒸餾水定容至15 mL(以1號(hào)試管作為空白調(diào)零)，在540 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度.以吸光度為縱坐標(biāo)，半乳糖醛酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.兩次重復(fù)試驗(yàn)的均值用最小二乘法擬合一元線性方程y=ax+b，求出吸光度與半乳糖醛酸量的關(guān)系.

表1 標(biāo)準(zhǔn)樣配制

1.3.4 酶活性測(cè)定 參照王薇等[17]的方法并修改.取15 mL離心管加入1%的果膠溶液0.8 mL，50 ℃預(yù)熱3 min，加酶液0.2 mL，混合，50 ℃水解10 min，加DNS試劑2 mL，混合后于沸水浴中10 min，冷卻定容至15 mL，2 000 r/min離心分離10 min，取上清10 mL，空白調(diào)零，540 nm測(cè)定吸光度值.1 min水解果膠產(chǎn)生1 μg還原糖(以半乳糖醛酸計(jì))所需酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U).

1.3.5 產(chǎn)酶條件單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.5.1 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響 調(diào)節(jié)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的初始pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，將菌懸液按5.0%的接種量分別接入裝有30 mL不同pH值的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，取出產(chǎn)酶液，8 000 r/min離心10 min，取上清液分別測(cè)定酶活力.試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.3.5.2 產(chǎn)酶溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響 將菌懸液按5.0%的接種量接入裝有30 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，pH值為5.0，分別置于20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃下180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，后續(xù)步驟同1.3.5.1.

1.3.5.3 產(chǎn)酶時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 將菌懸液按5.0%的接種量接入裝有30 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，pH值為5.0，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，每隔24 h測(cè)定酶活.

1.3.5.4 接種量對(duì)果膠酶活性的影響 將菌懸液分別按3.0%、4.0%、5.0%、6.0%和7.0%的接種量接入裝有30 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的50 mL的三角瓶，pH值為5.0、30 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h，后續(xù)步驟同1.3.5.1.

1.3.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定菌株產(chǎn)酶條件的正交試驗(yàn)因素和水平，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以酶活作為產(chǎn)酶條件優(yōu)化選擇的依據(jù).試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.4 數(shù)據(jù)處理

分析結(jié)果采用SPSS 17.0、Excel等軟件進(jìn)行處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)果膠酶酵母菌株篩選

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以半乳糖醛酸含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1.半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=1.077 1x-0.026 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 8，吸光度與半乳糖醛酸含量呈良好的線性關(guān)系.

圖1 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of galactose uronic acid

2.1.2 菌株篩選及酶活測(cè)定 從本實(shí)驗(yàn)室保存的釀酒酵母菌株中篩選分離產(chǎn)果膠酶菌株，由于聚半乳糖醛酸酶是果膠酶的重要組分，其活力在很大程度上代表了果膠酶的活力.因此利用它專一性地分解聚半乳糖醛酸中兩個(gè)非酯化半乳糖醛酸間的糖苷鍵，使其很快從大分子降解為分子量較小的低聚糖類，由于釕紅染料可與分子量較小的低聚糖形成紫色復(fù)合物，因此以形成的紫色圈直徑大小為依據(jù)，進(jìn)行平板初篩.通過初篩得到18株具有較深紫色圈的酵母菌株.將當(dāng)選的菌株進(jìn)一步進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，并測(cè)定搖瓶條件下的果膠酶活性大小，得到一株酶活相對(duì)較高的酵母菌株MQFEC-2，其酶活力為31.19 U/mL(表2).將選定菌株繼代15代以上，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

表2 高產(chǎn)果膠酶菌株酶活

2.2 產(chǎn)酶條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 由圖2可知，該菌株酶活力在不同pH值范圍呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì).當(dāng)pH值為5.0時(shí)，菌株產(chǎn)酶能力最高，酶活力達(dá)到33.23 U/mL.pH值在5.0～8.0酶活力逐漸降低，且在7.0～8.0降低趨勢(shì)較為明顯.原因在于酵母菌株產(chǎn)生的果膠酶為酸性水解酶，pH值過低或過高會(huì)影響酶的活性，造成菌株產(chǎn)酶能力降低.因此，菌株最佳產(chǎn)酶pH值為5.0.

圖2 初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effects of initial pH value on enzyme producing

2.2.2 產(chǎn)酶溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 由圖3可知，該菌株酶活力在不同溫度范圍呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時(shí)酶活力最高，酶活力達(dá)到31.21 U/mL.溫度在20～30 ℃酶活力逐漸升高，且在25～30 ℃增幅明顯，在30～35 ℃酶活力逐漸降低.原因在于產(chǎn)酶溫度過高或過低都不利于菌株生長(zhǎng)，進(jìn)而影響代謝產(chǎn)物果膠酶的產(chǎn)生和釋放.因此，菌株的最佳產(chǎn)酶溫度為30 ℃.

圖3 產(chǎn)酶溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of fermentation temperature on enzyme producing

2.2.3 產(chǎn)酶時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 由圖4可知，該菌株酶活力在不同產(chǎn)酶時(shí)間范圍呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì).當(dāng)產(chǎn)酶時(shí)間為72 h時(shí)，菌株的產(chǎn)酶能力最高，酶活力可以達(dá)到32.82 U/mL.產(chǎn)酶時(shí)間在24～72 h時(shí)，酶活力升高；在72～120 h時(shí)，酶活力逐漸降低.說明產(chǎn)酶時(shí)間較短或較長(zhǎng)都會(huì)影響菌株生長(zhǎng)，進(jìn)而影響果膠酶的產(chǎn)生.因此，菌株最佳產(chǎn)酶時(shí)間為72 h.

圖4 產(chǎn)酶時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of fermentation time on enzyme producing

2.2.4 接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 由圖5可知，該菌株酶活力在不同接種量范圍呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì).當(dāng)接種量為6.0%時(shí)，菌株的產(chǎn)酶能力最高，酶活力達(dá)到32.12 U/mL.接種量在3.0%～6.0%，酶活力升高；接種量在6.0%～7.0%酶活力逐漸降低，且在6.0%～7.0%降低的趨勢(shì)較為明顯.說明接種量過小，導(dǎo)致前期菌體生長(zhǎng)過慢，使得產(chǎn)酶周期

圖5 接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effects of inoculum size on enzyme producing

延長(zhǎng)；接種量過大，導(dǎo)致初期菌體生長(zhǎng)迅速，營養(yǎng)物過多用于細(xì)胞合成，使酶合成下降.因此，菌株的最佳接種量為6.0%.

2.2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以酶活力為考察指標(biāo)，對(duì)pH值(A)、溫度(B)、接種量(C)和產(chǎn)酶時(shí)間(D)4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果見表3.對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過直觀分析和極差分析得到最優(yōu)組合，按照正交試驗(yàn)選擇的最佳產(chǎn)酶條件進(jìn)行菌株產(chǎn)酶試驗(yàn)，驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果.

表3 L9(34)正交試驗(yàn)及結(jié)果

由表3的數(shù)據(jù)結(jié)果可得出影響酶活力變化因素的主次順序?yàn)椋築>A>D>C；由K值可以確定其正交試驗(yàn)的最優(yōu)組合為A2B2C2D2.即產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH值為5.0，產(chǎn)酶溫度為30 ℃，接種量為6%，產(chǎn)酶時(shí)間為72 h.用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4.由表4方差分析可知，因素A、B和D在P<0.05水平上有顯著性差異，因素C差異不顯著.

表4 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

*表示差異顯著(P<0.05).

2.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 由于L9(34)正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)組合在L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中未出現(xiàn)，所以需對(duì)正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn).在初始pH為5.0，產(chǎn)酶溫度為30 ℃，接種量為6%，產(chǎn)酶時(shí)間為72 h的條件下進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證菌株產(chǎn)酶效果，重復(fù)3次.測(cè)得酶活力為35.85 U/mL，比正交試驗(yàn)中最優(yōu)組合的產(chǎn)酶效果好.可見，經(jīng)正交試驗(yàn)所確定的是最佳產(chǎn)酶條件.

3 討論

本試驗(yàn)以橘皮粉為產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑，經(jīng)搖瓶發(fā)酵產(chǎn)果膠酶，而后采用DNS法測(cè)酶活力，研究表明：該菌株在培養(yǎng)基初始pH值為5.0，產(chǎn)酶溫度為30 ℃，接種量為6%，產(chǎn)酶時(shí)間為72 h時(shí)，果膠酶酶活力最高，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)得到果膠酶酶活力為35.85 U/mL.在菌種篩選中，國內(nèi)外研究者通過測(cè)定酶作用產(chǎn)物中的還原糖含量來反應(yīng)酶水解聚半乳糖醛酸的程度.原因在于以聚半乳糖醛酸為底物可突出果膠酶是通過水解果膠釋放出可溶性的果膠物質(zhì)，并且產(chǎn)物中都含有半縮醛羥基；酶對(duì)聚半乳糖醛酸的水解作用越大，得到半縮醛羥基就越多，也說明產(chǎn)物中的還原糖含量越高.華寶玉等[18]從桔子園土壤和腐爛的水果等處篩選得到1株產(chǎn)果膠酶活力較強(qiáng)的菌株M3，確定該菌株為聚多曲霉，其菌株的最佳產(chǎn)酶溫度為30 ℃，這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果相仿.張浩森等[19]從富含果膠質(zhì)的果園土壤中篩選出一株產(chǎn)果膠酶活力較強(qiáng)的菌株，該菌株的最佳發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間為72 h，這與本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致.李喻等[20]從腐爛的蘋果中定向分離篩選出一株適合液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)果膠酶的菌株YL-9，初步鑒定為擴(kuò)展青霉；通過正交試驗(yàn)結(jié)果可知，在此優(yōu)化發(fā)酵條件下，酶活力可達(dá)8.52 U/mL，這與本試驗(yàn)篩選所得酵母所產(chǎn)的果膠酶酶活力有一定差異，主要是因?yàn)楫a(chǎn)酶菌種不同，對(duì)于果膠酶的酶活定義有所差別.此外試驗(yàn)數(shù)據(jù)說明接種量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響不明顯，產(chǎn)酶時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響試驗(yàn)中，72 h和最后得到的最優(yōu)工藝是相符的，可是酶活力32.82 U/mL和最后驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果酶活力35.85 U/mL，差距較大.原因在于當(dāng)接種量為5%時(shí)，由于接種量相對(duì)較小會(huì)導(dǎo)致前期菌體生長(zhǎng)過慢，使得產(chǎn)酶周期延長(zhǎng)，故在72 h時(shí)產(chǎn)酶較少，酶活力不高；而當(dāng)接種量為6%時(shí)，酵母菌體初期生長(zhǎng)較為穩(wěn)定，生長(zhǎng)所需的營養(yǎng)物都用于細(xì)胞合成，酶的合成速率會(huì)提高，故接種量的改變會(huì)對(duì)酶活力產(chǎn)生一定影響.相比而言，產(chǎn)酶溫度、培養(yǎng)基初始pH值和產(chǎn)酶時(shí)間對(duì)酶活力的影響是更大的，尤其是產(chǎn)酶溫度.在單因素試驗(yàn)中通過觀察圖2-5可以初步發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶溫度、培養(yǎng)基初始pH值和產(chǎn)酶時(shí)間的改變對(duì)酶活影響是較大的(折線圖的變化趨勢(shì)較為明顯，酶活的增幅、減幅較為顯著)；并且表4方差分析結(jié)果也顯示因素A、B和D在P<0.05水平上有顯著性差異，更能說明產(chǎn)酶溫度、培養(yǎng)基初始pH值和產(chǎn)酶時(shí)間對(duì)酶活力的影響更顯著.

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)156株酵母菌株通過平板初篩，得到18株具有較深紫色圈的酵母菌株，通過搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，得到一株酶活較高的菌株MQFEC-2，酶活為31.19 U/mL.通過優(yōu)化其產(chǎn)酶條件，得出該菌株最佳產(chǎn)酶條件為產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH值5.0，產(chǎn)酶溫度30 ℃，接種量6%，產(chǎn)酶時(shí)間72 h，在此條件下酶活達(dá)到了35.85 U/mL，提高了4.66 U/mL，各因素對(duì)酶活力影響大小依次為：產(chǎn)酶溫度>培養(yǎng)基初始pH值>產(chǎn)酶時(shí)間>接種量.

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(責(zé)任編輯 趙曉倩)

Screening of high pectinase-producing yeast strain and optimization of its fermentation condition

JIA Lan-lan,CHENG Chao,WANG Jin-xing,WANG Fa-liang,WANG Jing

(College of Food Science and Engineering,Gansu Key Lab of Viticulture and Enology,Lanzhou 730070,China)

【Objective】 In order to screen higher pectinaseproducing yeast strain to improve the quality of wine.【Method】 The MQFEC-2 strain with a higher enzyme activity was selected through primary and secondary screening from 156 wild yeast strains,its fermentation condition was optimized by single factor and orthogonal tests.【Result】 The highest enzyme activity with 35.85 U/mL was obtained when the initial pH value of fermentation medium was 5.0,fermentation temperature was 30 ℃,inoculum amount was 6% and fermentation time was 72 h.The order of importance of factors on enzyme activity was as follows: fermentation temperature,initial media pH value,fermentation time and inoculum amount.

pectinase；yeast strain；screening；fermentation condition

賈蘭蘭(1991-)，女，本科生，研究方向?yàn)樯锕こ?E-mail：jiall11@homelink.com.cn

王婧，女，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槭称钒踩鞍l(fā)酵微生物.E-mail：wangjing@gsau.edu.cn

2014年甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)SRTP科研訓(xùn)練計(jì)劃(20141017).

2015-09-01；

2015-12-02

TS 261.1+1

A

1003-4315(2016)05-0154-07