快速溶劑萃取-HPLC法測定骨碎補(bǔ)中柚皮苷的含量

黃北雄，戴柏桉（廣西梧州食品藥品檢驗(yàn)所，廣西梧州　543002）

快速溶劑萃取-HPLC法測定骨碎補(bǔ)中柚皮苷的含量

黃北雄＊，戴柏桉（廣西梧州食品藥品檢驗(yàn)所，廣西梧州543002）

目的：為骨碎補(bǔ)中柚皮苷的提取及測定開辟新的途徑。方法：采用ASE350型快速溶劑萃取系統(tǒng)提取骨碎補(bǔ)中的柚皮苷；以高效液相色譜法測定骨碎補(bǔ)中柚皮苷的含量。色譜柱為Kinetex XB-C18，流動(dòng)相為甲醇-5%乙酸（25∶75，V/V），流速為0.8 ml/min，檢測波長為283 nm，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為10μl。結(jié)果：柚皮苷的進(jìn)樣量線性范圍為0.073 0～0.730 0μg（r=0.999 9））；定量限為0.73 μg，檢測限為0.022 μg；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2%；加樣回收率為98.92%～100.85%（RSD=0.72%，n=6）。結(jié)論：該方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于測定骨碎補(bǔ)中柚皮苷的含量。

高效液相色譜法；骨碎補(bǔ)；柚皮苷；快速溶劑萃取

骨碎補(bǔ)為水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortune（Kunze）J. Sm.的干燥根莖，氣微、味淡、微澀，有療傷止痛、補(bǔ)腎強(qiáng)骨、外用消風(fēng)祛斑的功效，可用于跌撲閃挫、筋骨折傷、腎虛腰痛、筋骨痿軟、耳鳴耳聾、牙齒松動(dòng)、外治斑禿、白癜風(fēng)等的治療［1］。現(xiàn)代藥理研究也表明骨碎補(bǔ)具有降血脂、降低胺基糖苷類抗生素的毒性和促進(jìn)骨吸收等作用［2］。柚皮苷是骨碎補(bǔ)的主要有效成分之一，2015年版《中國藥典》（一部）以柚皮苷作為其質(zhì)量評價(jià)的指標(biāo)。目前，骨碎補(bǔ)中柚皮苷的提取主要有煎煮法、加熱回流法、索氏提取法［3-4］、超聲萃取法、微波輔助萃取法［5-8］，測定方法有高效液相色譜法（HPLC）［9-11］和薄層-紫外分光光度法［12-13］，但是上述方法提取時(shí)間長、測定步驟煩瑣。因此，筆者利用美國Dionex公司的快速溶劑萃取系統(tǒng)對樣品進(jìn)行提取，縮短提取時(shí)間、提高效率，并采用HPLC法測定骨碎補(bǔ)中柚皮苷的含量，以期為骨碎補(bǔ)中柚皮苷的提取及測定開辟新的途徑。

1　材料

1.1儀器

ASE350型快速溶劑萃取儀（美國Dionex公司）；Ultimate 3000 DGLC型HPLC儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；XA205DU型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2試劑

柚皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：200001，純度：94.7%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3藥材

骨碎補(bǔ)（玉林市康華中藥飲片有限公司，批號：131206；廣西玉林市祥生中藥飲片有限責(zé)任公司，批號：140601；玉林市華濟(jì)中藥飲片有限公司；批號：14070301）經(jīng)廣西梧州食品藥品檢驗(yàn)所葉小強(qiáng)藥師鑒定為水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortune（Kunze）J.Sm.的干燥根莖。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Kinetex XB-C18（100 mm×4.6 mm，2.6 mm）；流動(dòng)相：甲醇-5%乙酸（25∶75，V/V）；流速：0.8 ml/min；檢測波長：283 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μl。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液精密稱取柚皮苷對照品適量，置于25 ml量瓶中，加甲醇制成每1 ml含柚皮苷36.5 μg的對照品溶液。

2.2.2供試品溶液取樣品粗粉0.1 g，按1∶1的比例加入硅藻土后混勻，裝于10 ml萃取池中，再用硅藻土填滿萃取池，在ASE350型快速溶劑萃取儀控制面板編程進(jìn)行萃取試驗(yàn)（萃取壓力為1 700 psi，溶劑為甲醇，萃取溫度為120℃，循環(huán)次數(shù)為2次，萃取時(shí)間為5 min，沖洗體積為100%）。萃取結(jié)束后，將萃取液轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以柚皮苷峰計(jì)為5 000；保留時(shí)間為5.73 min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1　高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；1.柚皮苷Fig 1　HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；1.naringin

2.4快速萃取條件的確定

2.4.1靜態(tài)萃取溫度平行取樣品粗粉適量，共5份，按1∶1的比例加入硅藻土后混勻，裝于10 ml萃取池中，用硅藻土填滿萃取池，參考2015年版《中國藥典》（一部）“骨碎補(bǔ)含量測定項(xiàng)下”水浴的溫度，分別設(shè)定提取溫度為80、100、120、140、160℃進(jìn)行提取，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定并計(jì)算柚皮苷的含量。結(jié)果，120℃時(shí)柚皮苷的提取量最高，超過120℃以后柚皮苷的提取量呈遞減趨勢，同時(shí)色譜圖中未知雜質(zhì)成分增多。因此，本試驗(yàn)選擇120℃為提取溫度。

2.4.2循環(huán)次數(shù)平行取樣品粗粉適量，共3份，按1∶1的比例加入硅藻土后混勻，裝于10 ml萃取池中，用硅藻土填滿萃取池，分別設(shè)定循環(huán)次數(shù)為1、2、3次進(jìn)行提取，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定并計(jì)算柚皮苷的含量。結(jié)果，循環(huán)次數(shù)為2次和3次時(shí)柚皮苷的提取量最高。為節(jié)約提取時(shí)間，故本試驗(yàn)的循環(huán)次數(shù)選擇2次。

2.4.3靜態(tài)萃取時(shí)間平行取樣品粗粉適量，共4份，按1∶1的比例加入硅藻土后混勻，裝于10 ml萃取池中，用硅藻土填滿萃取池，分別設(shè)定靜態(tài)萃取時(shí)間為3、5、7、9 min進(jìn)行提取，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定并計(jì)算柚皮苷的含量。結(jié)果，提取時(shí)間為5、7、9 min時(shí)，柚皮苷的含量最高。為節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間，故本試驗(yàn)選擇靜態(tài)萃取時(shí)間為5 min。

2.4.4沖洗體積平行取樣品粗粉適量，共6份，按1∶1的比例加入硅藻土后混勻，裝于10 ml萃取池中，用硅藻土填滿萃取池，分別設(shè)定沖洗體積為0、40%、80%、100%、120%、150%進(jìn)行提取，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定并計(jì)算柚皮苷的含量。結(jié)果，沖洗體積為100%、120%、150%時(shí)柚皮苷的含量最高。為節(jié)約試驗(yàn)成本，故本試驗(yàn)沖洗體積選擇為100%。

2.5線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液0、2、5、10、15、20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得柚皮苷的回歸方程為y=1 888.8x+8.980 5（r=0.999 9）。結(jié)果表明，柚皮苷的進(jìn)樣量線性范圍為0.073 0～0.730 0μg。

2.6定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得柚皮苷的定量限為0.73 μg；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得柚皮苷的檢測限為0.022 μg。

2.7精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，柚皮苷峰面積的RSD=0.04%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，柚皮苷峰面積的RSD=0.99%（n=7），表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號：131206）粗粉適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，柚皮苷峰面積的RSD=1.47%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.10加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號：131206）粗粉適量，共6份，每份0.05 g，精密稱定，分別精密加入一定質(zhì)量的柚皮苷對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果詳見表1。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab 1　Results of recovery test（n=6）

2.11樣品含量測定

取3批樣品粗粉適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算柚皮苷的含量，結(jié)果詳見表2。

表2　樣品含量測定結(jié)果（n=3）Tab 2　Results of content determination of samples（n=3）

3　討論

本試驗(yàn)比較了甲醇-乙酸-水（35∶4∶65，V/V/V）、甲醇-5%乙酸（25∶75，V/V）兩種不同比例的流動(dòng)相，通過預(yù)試驗(yàn)表明，甲醇-5%乙酸（25∶75，V/V）為流動(dòng)相時(shí)，柚皮苷峰與相鄰色譜峰的分離效果較好、峰型較好。故本試驗(yàn)選擇甲醇-5%乙酸（25∶75，V/V）為流動(dòng)相。

綜上所述，本方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于測定骨碎補(bǔ)中柚皮苷的含量。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部［S］.2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：256.

［2］劉振麗，呂愛平，張秋海，等.骨碎補(bǔ)脂溶性成分研究［J］.中國中藥雜志，1999，24（4）：222.

［3］張琳，楊中林.水提法與醇提法對骨碎補(bǔ)中總黃酮含量的影響比較［J］.江蘇藥學(xué)與臨床研究，2004，12（3）：30.

［4］伍奕，蔣曉煌，蔣孟良，等.骨碎補(bǔ)中柚皮苷含量測定方法的優(yōu)化研究［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（3）：48.

［5］方婧，楊洪軍，付梅紅，等.微波協(xié)助提取在中藥飲片含量測定中的應(yīng)用（4）：微波法與藥典法測定骨碎補(bǔ)中柚皮苷含量比較［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（6）：75.

［6］高軍，劉富春.正交試驗(yàn)優(yōu)選枳實(shí)中柚皮苷的提取工藝［J］.中國藥房，2014，25（35）：3 291.

［7］李園園，石磊，張振巍，等.混合均勻設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)選枳苓六妙口服液中藥材的提取工藝［J］.中國藥房，2013，24（39）：3 685.

［8］高穎，房德敏，王巨存，等.蘇氏接骨膠囊中骨碎補(bǔ)和菟絲子的質(zhì)量控制［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（4）：333.

［9］張紅旭，郭輝.HPLC法測定骨碎補(bǔ)酊中柚皮苷含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2006，21（2）63.

［10］岳春華，李順祥.從骨碎補(bǔ)中制備新北美圣草苷和柚皮苷對照品的研究［J］.中草藥，2008，39（4）：529.

［11］李遇伯，孟繁浩，潘曉峰，等.HPLC同時(shí)測定骨碎補(bǔ)藥材中新北美圣草苷和柚皮苷的含量［J］.藥物分析雜志，2006（6）：808.

［12］呂勇均，邱宗蔭.中藥骨碎補(bǔ)提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中國藥業(yè)，2007，16（23）：26.

［13］陳潔.薄層-紫外分光光度法測定骨碎補(bǔ)中柚皮甙的含量［J］.中醫(yī)正骨雜志，2007，19（3）：76.

（編輯：劉柳）

Determination of Naringin in Davallia mariesii byAccelerated Solvent Extration-HPLC

HUANG Beixiong，DAI Baian（Guangxi Wuzhou Institute for Food and Drug Control，Guangxi Wuzhou 543002，China）

OBJECTIVE：To develop a new way for the extration and determination of naringin in Davallia mariesii.METHODS：Naringin in D.mariesii was extracted by ASE350 accelerated solvent extraction system；HPLC was performed for the content determination of naringin in D.mariesii，the column was Kinetex XB-C18with mobile phase of methanol-5%acetic acid（25∶75，V/V）at a flow rate of 0.8 ml/min，detection wavelength was 283 nm，column temperature was 40℃，and injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range of naringin was 0.073 0-0.730 0μg（r=0.999 9）；the limit of quantitation was 0.73 μg，the limit of detection was 0.022 μg；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recovery was 98.92%-100.85%（RSD=0.72%，n=6）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and specific，and can be used for the content determination of naringin in D.Mariesii.

HPLC；Davallia mariesii；Naringin；Accelerated solvent extraction

R917

A

1001-0408（2016）27-3875-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.27.44

＊副主任藥師。研究方向：食品藥品檢驗(yàn)。電話：0774-3886969。E-mail：392271494@qq.com

（2015-12-19

2016-07-16）