離子抑制色譜法測定注射用醋酸奧曲肽中乙酸的含量

李婧華，劉桂霞，李盼盼，王智亮，姚　靜，李卓榮，山廣志#（.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京　00050；.濰坊市人民醫(yī)院，山東濰坊　604；.中國食品藥品檢定研究院，北京　00050）

離子抑制色譜法測定注射用醋酸奧曲肽中乙酸的含量

李婧華1＊，劉桂霞1，李盼盼1，王智亮2，姚靜3，李卓榮1，山廣志1#（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京100050；2.濰坊市人民醫(yī)院，山東濰坊261041；3.中國食品藥品檢定研究院，北京100050）

目的：采用離子抑制色譜法測定注射用醋酸奧曲肽中乙酸的含量，為藥典標準的完善提供參考。方法：色譜柱為Rezex ROA-Organic Acid H+，流動相為0.002 5 mol/L硫酸溶液，流速為0.5 ml/min，檢測波長為210 nm，柱溫為45℃，進樣量為100μl。結(jié)果：乙酸的檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.394 4～78.89μg/ml（r=0.999 9）；定量限為197.2 ng/ml，檢測限為78.89 ng/ml；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜2%；加樣回收率為104.71%～109.78%（RSD=1.34%，n=9）。結(jié)論：該方法環(huán)保、簡便、準確度和精密度良好，適用于測定注射用醋酸奧曲肽中乙酸的含量。

離子抑制色譜法；注射用醋酸奧曲肽；乙酸

醋酸奧曲肽（Octerotide Acetate）是人工合成的一種八肽環(huán)狀化合物，為生長抑素的衍生物，可有效抑制5-羥色胺、胃泌素、血管活性腸肽、促胰液素等激素的分泌，臨床多用于治療胰腺炎、消化道出血等癥［1-2］。合成醋酸奧曲肽的最后一步為將其制成乙酸鹽，因此檢測和控制醋酸奧曲肽中乙酸的含量對保證其質(zhì)量具有重要的意義。多肽藥物中乙酸的測定方法主要包括離子交換色譜法［3］、反相高效液相色譜法［4-8］、氣相色譜法［9-10］。2015年版《中國藥典》（四部）通則0872規(guī)定利用反相高效液相色譜法檢測合成多肽中的乙酸［11］，但在該方法中，乙酸出峰后還需耗費較長的時間于高比例有機相下洗脫多肽，以達到凈化色譜柱的目的；且筆者也曾用此方法檢測了醋酸奧曲肽中乙酸的含量，但由于乙酸含量較低，檢測效果不佳。以醋酸曲普瑞林為代表的某些多肽藥物，藥典規(guī)定除反相高效液相色譜法外，還可以按照2015年版《中國藥典》（二部）收載的離子交換色譜法來測定乙酸的含量［12］。但此方法對儀器的要求較高，檢測器則通常采用電導(dǎo)檢測器，通用性較差。氣相色譜法則是測定有機溶劑殘留的常見方法，但其常用的氫火焰離子化（FID）檢測器對乙酸的響應(yīng)度較其他有機溶劑低［4］，且檢測結(jié)果受氣流穩(wěn)定性的影響，重復(fù)性相對不佳。

離子抑制色譜法（IEC）常被用于復(fù)雜有機弱酸的分離檢測［13］，以及天然產(chǎn)物和藥物中反離子的檢測［14］。其經(jīng)典理論認為，色譜柱填料為有一定交聯(lián)度的全磺化氫離子（H+）型高容量離子交換樹脂，高密度的電荷使得樹脂顆粒間隙中的液體與樹脂微孔中吸留的液體之間形成了一層半透膜，即唐楠膜。當(dāng)強電離組分通過時，受到唐楠排斥作用而不能進入微孔，弱電離組分如乙酸則能夠進入微孔得到保留［15］。本文采用IEC法測定注射用醋酸奧曲肽中乙酸的含量，以期為藥典標準的完善提供參考。

1　材料

1.1儀器

Thermo U-3000型雙三元液相色譜儀，包括雙三元低壓梯度泵、自動在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、可變波長檢測器、變色龍7.2工作站（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Milli-Q Integral型超純水器（德國Merck Millipore公司）；XP205型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2藥品與試劑

注射用醋酸奧曲肽（上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號：1412801、130803Y、1410703，規(guī)格：0.1 mg/瓶）；三水合乙酸鈉對照品（德國Sigma公司，批號：WXBB4849V，純度：99.0%）；三氟乙酸、乙酸、甲酸為色譜純，硫酸為分析純，水為超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Rezex ROA-Organic Acid H+（300 mm×7.8 mm，8 μm）；流動相：0.002 5 mol/L硫酸溶液；流速：0.5 ml/min；檢測波長：210 nm；柱溫：45℃；進樣量：100 μl。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液精密稱取三水合乙酸鈉對照品18.45 mg（相當(dāng)于乙酸7.999 mg），置于200 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液5 ml，置于10 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2供試品溶液取樣品適量，加水溶解并稀釋，制成每1 ml含醋酸奧曲肽0.1 mg的供試品溶液。

2.2.3陰性對照溶液以水作為本試驗的陰性對照溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下陰性對照溶液、對照品溶液和供試品溶液各100 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞3；理論板數(shù)以乙酸峰計為6 160；保留時間為19.34 min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1　離子抑制色譜圖A.陰性對照；B.對照品；C.供試品；1.乙酸Fig 1　IEC chromatogramsA.negative control；B.reference substance；C.test sample；1.acetic acid

2.4專屬性試驗

取0.1%乙酸、0.1%甲酸及0.1%三氟乙酸溶液適量，混勻，作為專屬性試驗溶液。取上述溶液100 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖2。由圖2可知，在該色譜條件下，三氟乙酸在死時間內(nèi)被洗脫；甲酸與乙酸在色譜柱上保留情況良好，分離度為2.5。結(jié)果表明，常見有機酸基對乙酸的檢測無影響。

圖2　離子抑制色譜圖1.乙酸；2.甲酸；3.三氟乙酸Fig 2　IEC chromatograms1.acetic acid；2.formic acid；3.trifluoroacetic acid

2.5線性關(guān)系考察

精密稱取三水合乙酸鈉對照品適量，加水溶解制成乙酸質(zhì)量濃度分別為0.394 4、0.788 9、1.972、7.889、19.72、39.45、78.89μg/ml的系列溶液。取上述系列溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得乙酸的回歸方程為y=0.111 5 x－0.002 8（r=0.999 9）。結(jié)果表明，乙酸的檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.394 4～78.89μg/ml。

2.6定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下對照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時，得定量限；當(dāng)信噪比為3∶1時，得檢測限。結(jié)果，乙酸的定量限為197.2 ng/ml；檢測限為78.89 ng/ml。

2.7精密度試驗

取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，乙酸峰面積的RSD=1.98%（n= 6），表明儀器精密度良好。

2.8穩(wěn)定性試驗

取“2.2”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，乙酸峰面積的RSD=1.58%（n=6），表明供試品溶液在室溫下10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9重復(fù)性試驗

取樣品（批號：1412801）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，乙酸峰面積的RSD=1.34%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.10加樣回收率試驗

取樣品（批號：1412801）9瓶（每瓶含乙酸2.15 mg），分別轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，分別加入低、中、高質(zhì)量的三水合乙酸鈉對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1　加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）Tab 1　Result of recovery test（n=9）

2.11樣品含量測定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算乙酸的含量，結(jié)果見表2。

表2　樣品含量測定結(jié)果（n=3，%）Tab 2　Result of content determination of samples（n=3，%）

3　討論

3.1色譜柱的選擇

IEC法使用的固定相主要是高交換容量的陽離子交換樹脂。嚴晉嬰等［16］探討了IEC所用樹脂的特性，其指出若想要加快唐楠膜的平衡來達到高效分離的目的，樹脂應(yīng)具有較大的孔徑和恰當(dāng)?shù)慕宦?lián)度。而菲羅門公司生產(chǎn)的Rezex ROA-Organic Acid H+色譜柱的填料具有較大的孔徑和約8%的交聯(lián)度，非常適合分析以乙酸為代表的有機酸。因此，選擇Rezex ROA-OrganicAcid H+為本試驗的色譜柱。

3.2流動相的選擇

有機酸在水溶液中的離解平衡受pH的影響。降低pH可抑制有機酸的解離，從而延長有機酸在色譜柱上的保留時間。理論上，凡是能提供氫離子（H+）的溶液都可作為IEC的淋洗液。淋洗液主要分為3類：水、有機酸與無機酸。在本試驗中，筆者選擇（稀）硫酸為唯一的流動相，沒有使用任何有機溶劑，綠色環(huán)保；且多肽藥物在（?。┝蛩釀?chuàng)造的酸性條件下離子化而沒有保留，乙酸則幾乎不解離，保留情況良好。這簡化了主成分的洗脫過程，并使得乙酸的檢測不受干擾。因此，本試驗選擇（?。┝蛩釣榱鲃酉唷?/p>

3.3進樣量的設(shè)定

本試驗供試品溶液中乙酸的含量較低，預(yù)試驗結(jié)果顯示，參照常規(guī)的試驗方法將進樣量設(shè)為20或10μl時，乙酸峰面積過小。因此，為保證檢測效果，特將進樣量設(shè)為100μl。

3.4檢測條件的選擇

在選擇檢測器時，考慮到硫酸與實驗室現(xiàn)有的電噴霧檢測器、電導(dǎo)檢測器均不是十分兼容，而經(jīng)紫外-可見全波長掃描驗證，乙酸的最大吸收波長在210 nm左右，而硫酸在210 nm波長附近幾乎沒有吸收，進一步結(jié)合2015年版《中國藥典》（四部）［11］中收載的標準，本試驗最終選擇使用紫外檢測器在210 nm波長下進行乙酸含量的檢測，通用性較強。

3.5常見有機酸的影響

筆者考察了甲酸和三氟乙酸對乙酸檢測的影響。三氟乙酸的酸性遠強于乙酸，于死體積處出峰；甲酸的酸性與乙酸十分接近，在色譜柱上保留良好，且甲酸與乙酸的分離度可達到2.5以上。這說明在本試驗測定條件下，常見有機酸基對乙酸的檢測無影響。隨著分析時間的增加，色譜柱存在一定的鈍化現(xiàn)象，因此乙酸和甲酸的分離度可以作為該色譜系統(tǒng)的適用性條件，當(dāng)其不符合要求時，考慮對色譜柱進行凈化。

3.6加樣回收率試驗結(jié)果

在加樣回收率試驗中，考慮到樣品中乙酸含量低，于是在制備溶液時是將9瓶注射用醋酸奧曲肽中的內(nèi)容物分別全部轉(zhuǎn)移至量瓶中；且由于該制劑中乙酸含量遠低于原料藥，檢測難度較大，加樣回收率結(jié)果偏高。本試驗僅對多肽藥物中乙酸的檢測方法進行了探索性研究，加樣回收率試驗的設(shè)計與試驗結(jié)果有待進一步地優(yōu)化及衡量。

3.7含量測定結(jié)果

2015年版《中國藥典》（二部）中［12］收載的醋酸奧曲肽原料藥標準規(guī)定乙酸含量應(yīng)為5.0%～12.0%，但對醋酸奧曲肽各制劑中乙酸的含量并沒有提出明確的限度。在本試驗中，注射用醋酸奧曲肽中的乙酸含量僅為2%左右，這可能與制劑中含有適量的輔料有關(guān)。

綜上所述，本試驗采用IEC法測定注射用醋酸奧曲肽中乙酸的含量，方法環(huán)保、簡便、準確度和精密度好，適用于測定注射用醋酸奧曲肽中乙酸的含量。

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（編輯：劉柳）

Content Determination ofAceticAcid in OctreotideAcetate for Injection by IEC

LI Jinghua1，LIU Guixia1，LI Panpan1，WANG Zhiliang2，YAO Jing3，LI Zhuorong1，SHAN Guangzhi1（1.Institute of Medicinal Biotechnology，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100050，China；2.Weifang People's Hospital，Shandong Weifang 261041，China；3.National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

OBJECTIVE：To determine the content of acetic acid in Octreotide acetate for injection by IEC，and provide reference for the improvement of pharmacopoeia standards.METHODS：The column was Rezex ROA-Organic Acid H+with mobile phase of 0.002 5 mol/L sulfuric acid at a flow rate of 0.5 ml/min，the detection wavelength was 210 nm，column temperature was 45℃，and injection volume was 100μl.RESULTS：The linear range of acetic acid was 0.394 4μg/ml-78.89μg/ml（r=0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2%；the limit of quantification was 197.2 ng/ml，and limit of detection was 78.89 ng/ml；recovery was 104.71%-109.78%（RSD=1.34%，n=9）.CONCLUSIONS：The method is environmental and simple with good accuracy and precision，and suitable for the content determination of acetic acid in Octreotide acetate for injection.

IEC；Octreotide acetate for injection；Acetic acid

R917

A

1001-0408（2016）27-3867-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.27.41

＊碩士研究生。研究方向：藥物分析。電話：010-63021345。E-mail：lijinghua010005@163.com

副研究員，博士。研究方向：藥物分析。E-mail：shanguangzhi@imb.pumc.edu.cn

（2016-04-01

2016-06-12）