HPLC法測定八角楓藥材不同藥用部位中L（-）-八角楓堿的含量

王其勇，許亞玲（貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴陽　550004）

HPLC法測定八角楓藥材不同藥用部位中L（-）-八角楓堿的含量

王其勇＊，許亞玲#（貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴陽550004）

目的：建立測定八角楓藥材不同藥用部位（莖、根莖、須根及支根）中L（-）-八角楓堿含量的方法，為八角楓藥材的開發(fā)利用提供參考。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Thermo C18，流動相為甲醇-磷酸緩沖液（22∶78，V/V），流速為1.0 ml/min，檢測波長為259 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μl。結(jié)果：L（-）-八角楓堿的進(jìn)樣量線性范圍為0.020 62～0.257 80 μg（r=0.999 9）；定量限為1.7 ng，檢測限為0.5 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2%；加樣回收率為97.38%～98.86%（RSD=0.6%，n=6）。不同藥用部位中L（-）-八角楓堿含量，須根＞支根＞根莖＞莖。結(jié)論：該方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，適用于測定八角楓藥材不同藥用部位（莖、根莖、須根及支根）中L（-）-八角楓堿的含量。

高效液相色譜法；八角楓；L（-）-八角楓堿；不同藥用部位

八角楓收載于2003年版《貴州省中藥材及民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，為八角楓科植物八角楓Alangium chinense（Lour.）Harms及瓜木Alangium platani f olium（Sieb.Et Zucc.）Harms的干燥細(xì)須根（白龍須）或干燥支根（白金條）［1］，而2015年版《中國藥典》未收載該藥材。八角楓藥材生于280～1 800 m的山地或疏林中，喜溫暖潮濕氣候，分布于河南、陜西、甘肅、西藏南部、云南、四川、湖南、湖北、廣西、廣東、江西、江蘇、浙江、福建、臺灣、貴州等省區(qū)，全年均可采挖［2］。其在貴州全省均有分布，為貴州省少數(shù)民族用藥，具有祛風(fēng)通絡(luò)、散瘀鎮(zhèn)痛、麻醉及松弛肌肉等功效［3-5］，可用于治療風(fēng)濕疼痛、麻木癱瘓、心力衰竭、勞損腰痛、跌打損傷等證。其須根含生物堿（即八角楓堿），是松弛肌肉的主要活性成分，也是其毒性的主要來源［6-8］。八角楓藥材傳統(tǒng)以須根入藥，其他部位（支根、根莖、莖等）幾乎不用，這對其資源造成了極大的浪費(fèi)。如果其他部位也含有八角楓堿，那么這些部位就能和須根一樣入藥使用，從而提高八角楓藥材的使用率。筆者查閱相關(guān)文獻(xiàn)［9-14］，發(fā)現(xiàn)除須根外，均未有其他部位的分析研究以及有效成分測定的報(bào)道。因此，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）對八角楓藥材不同藥用部位進(jìn)行測定，以期為八角楓藥材的開發(fā)利用提供參考。

1　材料

1.1儀器

UltiMate 3000型HPLC儀，配有四元梯度泵、在線脫氣裝置、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、變色龍色譜處理系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；240型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2試劑

L（-）-八角楓堿對照品［阿法埃莎（天津）化學(xué)有限公司，批號：10110058，純度：94.0%］；甲醇（美國Tedia公司）為色譜純，三氯甲烷（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、庚烷磺酸鈉（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、冰乙酸（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）、磷酸二氫鉀（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）為分析純，水為自制超純水。

1.3藥材

本試驗(yàn)共收集到10批樣品（樣品信息見表1），均產(chǎn)于貴州省畢節(jié)地區(qū)織金縣，并由貴陽中醫(yī)學(xué)院陳德媛研究員鑒定為八角楓Alangium chinense（Lour.）Harms的干燥細(xì)須根、支根、根莖、莖。

表1　八角楓藥材10批樣品信息Tab 1　Information of 10batches of samples ofA.chinense

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Thermo C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-磷酸緩沖液（0.2 g庚烷磺酸鈉、2.0 g磷酸二氫鉀、0.3 ml磷酸置于1 000 ml量瓶中，加水定容，搖勻）（22∶78，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：259 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液精密稱取L（-）-八角楓堿對照品10.97 mg，置于100 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得對照品貯備液。精密量取上述貯備液5 ml，置于50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為10.31 μg/ml的對照品溶液。

2.2.2供試品溶液取樣品粉末（過四號篩）適量，約0.5 g，精密稱定，置于100 ml錐形瓶中，精密量取酸性甲醇溶液（取甲醇30 ml，用5%乙酸溶液稀釋至100 ml）25 ml，稱定質(zhì)量，置水浴上回流提取30 min，放冷，用酸性甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對照溶液取“2.2.2”項(xiàng)下酸性甲醇溶液作為陰性對照溶液。

2.3系統(tǒng)適用性與專屬性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以L（-）-八角楓堿峰計(jì)為6 500；保留時(shí)間為13.32 min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1　高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.L（-）-八角楓堿Fig 1　HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.L（-）-Anabasine

2.4線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液2、5、10、15、20、25 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得L（-）-八角楓堿的回歸方程為y=966 993.714 6x+544.252 9（r=0.999 9）。結(jié)果表明，L（-）-八角楓堿的進(jìn)樣量線性范圍為0.020 62～0.257 80 μg。

2.5定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限為1.7 ng；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測限為0.5 ng。

2.6精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，L（-）-八角楓堿峰面積的RSD=0.4%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號：20120601）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，L（-）-八角楓堿峰面積的RSD=0.2%（n= 7），表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號：20120601）粉末適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算平均含量。結(jié)果，L（-）-八角楓堿的平均含量為1.254 4 mg/g，RSD=1.2%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號：20120601）粉末適量，共6份，每份約0.25 g，精密稱定，置于100 ml錐形瓶中，精密加入一定質(zhì)量的L（-）-八角楓堿對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果詳見表2。

表2　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab 2　Results of recovery test（n=6）

2.10樣品含量測定

分別取10批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算L（-）-八角楓堿的含量，結(jié)果詳見表3。

表3　樣品含量測定結(jié)果（n=2，%）Tab 3　Results of content determination of sample（n=2，%）

3　討論

3.1提取溶劑的選擇

取甲醇、三氯甲烷以及酸性甲醇溶液各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，酸性甲醇溶液作為提取溶劑時(shí)，色譜峰峰形較好，主峰與相鄰峰的分離度＞1.5，且L（-）-八角楓堿的含量最高。因此，本試驗(yàn)選擇酸性甲醇溶液為提取溶劑。

3.2各部位八角楓堿的含量比較

八角楓藥材所含生物堿以L（-）-八角楓堿為主，通過本試驗(yàn)表明該藥材各部位均含有L（-）-八角楓堿，含量依次為須根＞支根＞根莖＞莖，其中須根為0.95%，支根為0.13%，根莖為0.030%～0.040%，莖為0.016%～0.018%。但是，須根是毒性最大的部位，會引起中毒情況，因此可降低須根的使用量，而增加支根和根莖的用量，這既可保證療效，又可減少使用該藥材而導(dǎo)致的中毒情況［15］。

3.3合理的開發(fā)利用

目前，對八角楓藥材須根的研究報(bào)道較多，比如對水楊苷、生物堿的含量測定，毒理以及臨床應(yīng)用等，但是對其他部位（支根、根莖、莖等）的研究報(bào)道較少，這與八角楓藥材的傳統(tǒng)用藥方式有關(guān)。該藥材主要以野生為主，傳統(tǒng)以須根入藥，其余部位幾乎很少使用。近年來，八角楓藥材在貴州省中成藥中的應(yīng)用逐漸增多，隨著使用量的增加，其野生資源也越來越少，而單用其他部位入藥又達(dá)不到相應(yīng)的療效，造成其他部位藥材使用率較低，形成資源浪費(fèi)。因此，打破用藥常規(guī)，合理的利用支根、根莖等藥用部位，將各部位配合使用以緩解須根資源不足很有必要。八角楓藥材在貴州以野生為主，四季均可采挖，不同產(chǎn)區(qū)及采收期收集的藥材其質(zhì)量會有不同，由于本試驗(yàn)收集的樣品有限，給出的試驗(yàn)數(shù)據(jù)未能全面反映該藥材的質(zhì)量情況，因此進(jìn)一步對生長環(huán)境、采收季節(jié)、產(chǎn)地加工等影響藥材質(zhì)量的因素進(jìn)行考察很有必要。

綜上所述，本方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，適用于測定八角楓藥材不同藥用部位（莖、根莖、須根及支根）中L（-）-八角楓堿的含量。

［1］貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［S］.貴陽：貴州科技出版社，2003：11.

［2］鮑家科.貴州省中藥及民族藥材質(zhì)量原植（動）物彩色圖鑒：上［M］.貴陽：貴州科技出版社，2009：8.

［3］全國中草藥匯編組.全國中草藥匯編：上［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1982：14.

［4］南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典：上冊［M］.2版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：32-34.

［5］浙江醫(yī)科大學(xué).八角楓堿肌肉松弛作用的研究［J］.新醫(yī)藥學(xué)雜志，1974（10）：45.

［6］楊倉良.毒藥本草［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，1993：172.

［7］張昌華，王登文，許小明，等.八角楓中毒死亡1例［J］.法醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（2）：155.

［8］張長銀，張禮俊，胡永良，等.小鼠急性八角楓中毒的病理學(xué)觀察［J］.法醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（5）：329.

［9］劉毅，張麗艷，張永萍，等.高效液相色譜法測定黔產(chǎn)民族藥材八角楓中毒藜堿的含量［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29（11）：962.

［10］石鉞，楊帥，李開通.高效液相色譜法測定風(fēng)濕定膠囊中毒藜堿的含量［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29（1）：87.

［11］梁從慶，李書淵，房志堅(jiān).HPLC法測定風(fēng)濕定片中毒藜堿的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2004，15（4）：268.

［12］張化為，崔春利，宋逍，等.風(fēng)濕定膠囊中毒藜堿限量測定［J］.陜西中醫(yī)，2007，28（9）：1 232.

［13］戚寶嬋，康強(qiáng)，李子，等.HPLC法測定養(yǎng)陰清肺丸中芍藥苷的含量［J］.中國藥房，2012，23（32）：3 053.

［14］許亞玲，羅曼，周蘭，等.RP-HPLC法測定小建中片中桂皮醛的含量［J］.中國藥房，2012，23（32）：3 044.

［15］王其勇，許亞玲，鐘宏波.八角楓不同藥用部位的高效液相指紋圖譜測定［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（2）：133.

（編輯：劉柳）

Content Determination of L（-）-Anabasine in Different Medicinal Parts ofAlangium chinense by HPLC

WANG Qiyong，XU Yaling（Guizhou Institute for Food and Drug Control，Guiyang 550004，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of L（-）-Anabasine in different medicinal parts（stem，rhizome，fibrous root，rootlet）of Alangium chinense，and provide reference for its development and utilization.METHODS：HPLC was performed on the column of Thermo C18with mobile phase of methanol-phosphate buffer solution（22∶78，V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 259 nm，column temperature was 30℃；the injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range of L（-）-Anabasine was 0.020 62-0.257 80 μg（r=0.999 9）；the limit of quantitation was 1.7 ng，limit of detection was 0.5 ng；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recovery was 97.38%-98.86%（RSD=0.6%，n=6）.The content of L（-）-Anabasine in different medicinal parts was the fibrous root＞the rootlet＞the rhizome＞the stem.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，reproducible and specific，and suitable for the content determination of L（-）-Anabasine in different medicinal parts（stem，rhizome，fibrous root，rootlet）of A.Chinense.

HPLC；Alangium chinense；L（-）-Anabasine；Different medicinal parts

R917

A

1001-0408（2016）27-3877-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.27.45

＊副主任藥師。研究方向：藥物分析。電話：0851-86807025。E-mail：qiyoo_king@sina.com

主任藥師。研究方向：藥物分析。電話：0851-86808035。E-mail：499929857@qq.com

（2015-10-29

2016-07-07）