重組大鼠CC16蛋白質(zhì)對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠氣道上皮細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IL-6和IL-8的影響*

龐 敏， 王 冬， 李 婷， 王 丹， 袁麗榮， 郭 民， 王海龍

(山西醫(yī)科大學(xué) 1第一醫(yī)院呼吸科， 2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 山西 太原 030001)

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重組大鼠CC16蛋白質(zhì)對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠氣道上皮細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IL-6和IL-8的影響*

龐 敏1△， 王 冬1， 李 婷1， 王 丹1， 袁麗榮1， 郭 民2， 王海龍3

(山西醫(yī)科大學(xué)1第一醫(yī)院呼吸科，2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 山西 太原 030001)

目的： 觀察重組大鼠CC16蛋白質(zhì)(rCC16)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)大鼠氣道上皮(RTE)細(xì)胞腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-8表達(dá)的影響及其可能機(jī)制。方法: 體外培養(yǎng)RTE細(xì)胞，以不同劑量(0.5、1.0和2.0 mg/L)的rCC16預(yù)處理RTE細(xì)胞2 h，接著加入0.1 mg/L的LPS繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用RT-qPCR測(cè)定各組細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-8的mRNA表達(dá)；采用ELISA測(cè)定細(xì)胞上清中TNF-α、IL-6和IL-8的含量；采用Western blot法分析核因子(NF)-κB p65在細(xì)胞核中的分布。結(jié)果: LPS刺激RTE細(xì)胞可以顯著上調(diào)TNF-α、IL-6和IL-8的mRNA及蛋白水平的表達(dá)，給予不同劑量rCC16干預(yù)后，LPS誘導(dǎo)的上述炎癥介質(zhì)的表達(dá)被抑制，且rCC16對(duì)IL-6和IL-8的抑制作用呈劑量依賴性，隨著rCC16劑量的增加，抑制作用增強(qiáng)；而對(duì)TNF-α的抑制則沒有劑量依賴關(guān)系。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rCC16可以抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB p65的核轉(zhuǎn)移，且有劑量依賴性。結(jié)論: rCC16可能通過NF-κB信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)的RTE細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-8 mRNA及蛋白的表達(dá)。

CC16蛋白質(zhì)； 氣道炎癥； 脂多糖； 炎癥因子； 核因子κB

克拉拉細(xì)胞蛋白16(Clara cell protein 16，CC16)主要由位于氣道上皮的Clara 細(xì)胞分泌合成，在支氣管肺泡灌洗液中含量最豐富，具有抗炎活性[1]。眾多臨床標(biāo)本及動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，氣道CC16蛋白質(zhì)含量的減少，是引起氣道炎癥如慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)和哮喘發(fā)生發(fā)展的重要因素[2-3]，因此補(bǔ)充CC16蛋白質(zhì)被視為一種潛在的干預(yù)肺部炎癥的措施[4]。同時(shí)研究表明，炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6和IL-8在慢性氣道炎癥疾病發(fā)生發(fā)展中亦發(fā)揮關(guān)鍵作用，如TNF-α在炎癥發(fā)展初期可以促進(jìn)肺上皮細(xì)胞合成嗜酸細(xì)胞活化趨化因子，后者參與哮喘的進(jìn)程[5]； IL-6和IL-8促進(jìn)中性粒細(xì)胞的募集并激活中性粒細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，加劇肺部炎癥的發(fā)展[6]。本文在前期實(shí)驗(yàn)成功獲得重組大鼠CC16蛋白質(zhì)(recombinant rat CC16 protein,rCC16)且確定其安全劑量的基礎(chǔ)上[7-8]，研究CC16對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激大鼠氣道上皮(rat tracheal epithelial，RTE)細(xì)胞后炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-8表達(dá)的影響，并對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行初步研究。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

RTE細(xì)胞株(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心)；rCC16由本實(shí)驗(yàn)室制備，-70 ℃儲(chǔ)存；LPS(Sigma)；MEM-EBSS細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清(HyClone)；大鼠TNF-α、IL-6和IL-8酶聯(lián)免疫試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)；TRIzol、RT reagent Kit 和 SYBR Premix Ex Taq Kit(大連寶生物科技有限公司)；RIPA蛋白提取試劑、BCA蛋白定量試劑盒和胞漿胞核蛋白提取試劑盒(Thermo Scientific)；NF-κB p65抗體、GAPDH和histone H1抗體(Santa Cruz)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋科技有限公司)；其余試劑為國產(chǎn)分析純。3111型CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)；CKX41-A22PHP型倒置顯微鏡(Olympus)；UV-2602型紫外可見分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司)；PikoREAL實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀(Thermo Scientific)；Epoch酶標(biāo)儀(Biotek)；Tanon-2500R凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將RTE細(xì)胞用含20%胎牛血清的MEM-EBSS培養(yǎng)液(內(nèi)含100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d傳代1次。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組、LPS組、LPS+rCC16(0.5 mg/L)、LPS+rCC16(1 mg/L)和LPS+rCC16(2 mg/L)組。將5×105RTE細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，次日更換為無血清培養(yǎng)基，分別加入不同劑量的rCC16孵育2 h后，除對(duì)照組外，均加入0.1 mg/L 的LPS繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別收集培養(yǎng)液上清和細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞因子mRNA和蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)；對(duì)于NF-κB p65細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的檢測(cè)，則在加入LPS后1 h 收集細(xì)胞。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 RT-qPCR檢測(cè)TNF-α、IL-6和IL-8的mRNA表達(dá) 收集LPS刺激24 h的RTE細(xì)胞，加入 1 mL TRIzol裂解液，反復(fù)吹打至細(xì)胞充分裂解，按說明書提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量濃度后取1 μg按照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增。PCR的擴(kuò)增條件為95 ℃ 15 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)，將目的基因的Ct值用大鼠GAPDH的Ct值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，基因表達(dá)的相對(duì)倍數(shù)變化用比較閾值法(即2-ΔΔCt)表示。TNF-α的上游引物為5’-GAGATGTGGAACTGGCAGA-3’，下游引物為5’-GAGAACCTGGGAGTAGATAAGG-3’；IL-6的上游引物為5’-CAGTTGCCTTCTTGGGACT-3’，下游引物為5’-GCTCTGAATGACTCTGGCTT-3’；IL-8的上游引物為5’-CCCCCATGGTTCAGAAGATTG-3’，下游引物為5’-TTGTCAGAAGCCAGCGTTCAC-3’；GAPDH的上游引物為5’-GTGCCAGCCTCGTCTCATAG-3’，下游引物為5’-CTTTGTCACAAGAGAAGGCAG-3’。引物由中美泰和生物科技有限公司合成。

2.4 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α、IL-6和IL-8的含量 實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格參照試劑盒說明書操作。

2.5 Western blot 實(shí)驗(yàn) 收集LPS刺激1 h后的RTE細(xì)胞，分別按照RIPA和胞漿胞核蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白、胞核蛋白及胞漿蛋白，BCA法定量后取30 μg蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，蛋白條帶經(jīng)X片曝光，凝膠成像分析后，目的蛋白的表達(dá)量以目的蛋白吸光度與內(nèi)參照吸光度的比值表示。抗體稀釋比例為1∶1 000(NF-κB p65和histone H1)、1∶3 000 (GAPDH)和1∶5 000(辣根過氧化物酶標(biāo)記的II抗)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，SPSS 13.0軟件處理，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni 校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 rCC16抑制LPS誘導(dǎo)RTE細(xì)胞中TNF-α、IL-6和IL-8 mRNA表達(dá)

為保證PCR擴(kuò)增的特異性，我們首先檢測(cè)了TNF-α、IL-6和IL-8引物的熔解曲線，結(jié)果如圖1，各組引物僅出現(xiàn)單峰，說明引物具有特異性。

LPS刺激RTE細(xì)胞24 h后，TNF-α、IL-6和IL-8的mRNA含量較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)。給予不同劑量的rCC16干預(yù)后，IL-6和IL-8的mRNA含量較單純LPS組明顯降低，隨著rCC16 劑量的增加，對(duì)IL-6和IL-8的抑制作用增強(qiáng)，各干預(yù)劑量組與LPS組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。TNF-α的mRNA含量在rCC16劑量為0.5 mg/L時(shí)就呈現(xiàn)明顯抑制作用(P<0.01)，隨著rCC16的劑量增加，這種抑制作用有所減弱，但含量仍較LPS組低(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.The validity of melting curves of the primers for rat TNF-α (A), IL-6 (B) and IL-8 (C).

圖1 大鼠IL-6、IL-8和 TNF-α引物熔解曲線的檢測(cè)

Figure 2.The effect of rCC16 on LPS-stimulated mRNA expression of IL-6, IL-8 and TNF-α in the RTE cells was determined by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsLPS group.

圖2 RT-qPCR檢測(cè)rCC16對(duì)LPS誘導(dǎo)RTE細(xì)胞IL-6、IL-8和TNF-α mRNA表達(dá)的影響

2 rCC16抑制LPS誘導(dǎo)RTE細(xì)胞上清中TNF-α、IL-6和IL-8的表達(dá)

LPS刺激RTE細(xì)胞24 h后，細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-8的含量較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)。給予不同劑量rCC16干預(yù)后，IL-6和IL-8的含量較單純LPS組明顯降低，且隨著rCC16 劑量增加，對(duì)IL-6和IL-8的抑制作用增強(qiáng)，具有劑量依賴性，各干預(yù)劑量組與LPS組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。TNF-α的含量在rCC16劑量為0.5 mg/L時(shí)就呈現(xiàn)明顯抑制作用(P<0.01)，但隨著rCC16 劑量增加并未表現(xiàn)出抑制作用的增加，1 mg/L組的含量仍較LPS組低(P<0.05)，而2 mg/L組的含量與LPS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3。

3 rCC16抑制LPS誘導(dǎo)RTE中NF-κB p65的核轉(zhuǎn)移

LPS刺激RTE細(xì)胞1 h后，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB含量明顯增多，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。給予不同劑量rCC16干預(yù)后，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB含量較單純LPS組明顯降低，并具有劑量依賴性，且隨著rCC16 劑量增加，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB含量更少，與單純LPS組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。而細(xì)胞漿中NF-κB的含量則正好相反，各組細(xì)胞中NF-κB總蛋白的含量未見改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4。

Figure 3.The effects of rCC16 on LPS-stimulated protein expression of IL-6, IL-8 and TNF-α in the RTE cells detected by ELISA. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsLPS group.

圖3 ELISA檢測(cè)rCC16對(duì)LPS誘導(dǎo)RTE細(xì)胞IL-6、IL-8和TNF-α表達(dá)的影響

Figure 4.The effect of rCC16 on LPS-induced NF-κB p65 nuclear translocation in the RTE cells was tested by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsLPS group.

圖4 rCC16對(duì)LPS誘導(dǎo)RTE細(xì)胞中NF-κB p65核轉(zhuǎn)移的影響

討 論

CC16蛋白是一種肺組織特異性的內(nèi)源性抗炎因子，缺乏CC16的轉(zhuǎn)基因鼠肺部易受氧化劑、內(nèi)毒素?fù)p傷，且炎癥反應(yīng)增強(qiáng)[9]。在利用香煙煙霧制備的大鼠COPD模型中發(fā)現(xiàn)氣道炎癥出現(xiàn)時(shí)Clara細(xì)胞及其表達(dá)的CC16明顯減少，引起氣道抗炎能力下降，導(dǎo)致炎癥進(jìn)一步惡化[10-11]。在炎癥的發(fā)生發(fā)展中，炎癥因子發(fā)揮了關(guān)鍵作用。促炎因子TNF-α和LPS可誘發(fā)上皮細(xì)胞IL-8的表達(dá)[12]，IL-8是一種化學(xué)趨化因子，對(duì)中性粒細(xì)胞有強(qiáng)烈的趨化和激活作用，在COPD和以中性粒細(xì)胞為主的炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用；IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子，可以募集并激活中性粒細(xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì)如花生四烯酸代謝產(chǎn)物、緩激肽和組織胺等參與炎癥反應(yīng)[6]。進(jìn)一步地，這些細(xì)胞因子還可相互作用形成許多正反饋通路，導(dǎo)致“炎癥級(jí)聯(lián)效應(yīng)”的發(fā)生，使炎癥反應(yīng)持續(xù)和加重[13]。因此，降低炎癥因子的表達(dá)已經(jīng)成為治療炎癥性疾病的有效選擇。

前期研究顯示，rCC16可以降低LPS誘導(dǎo)的RTE細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotei-nase，MMP)-9的表達(dá)[8]，描繪出rCC16潛在的應(yīng)用價(jià)值。眾所周知，氣道上皮細(xì)胞除了機(jī)械屏障作用外，還有更重要的免疫炎癥防御作用，可產(chǎn)生許多炎癥介質(zhì)，募集炎性細(xì)胞，誘發(fā)異常的炎癥反應(yīng)，造成病理損傷[14]。本研究顯示，rCC16可以有效地降低LPS誘導(dǎo)的RTE細(xì)胞中TNF-α、IL-6和IL-8的表達(dá)，進(jìn)一步證明CC16蛋白質(zhì)的抗炎活性及應(yīng)用潛力。

NF-κB是炎癥和免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通常的存在形式是由p65與p50兩個(gè)亞單位組成異二聚體并與其抑制物IκB結(jié)合而停留在細(xì)胞漿中。受到細(xì)胞內(nèi)外刺激時(shí)IκB磷酸化并與NF-κB脫離，NF-κB憑借核定位信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因特異的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合并激活該基因轉(zhuǎn)錄[15]。研究顯示TNF-α、IL-6和IL-8受NF-κB信號(hào)通路活化而調(diào)控[16]，為明確rCC16抑制上述炎癥因子產(chǎn)生的分子機(jī)制，我們檢測(cè)了rCC16對(duì)NF-κB/p65在LPS刺激下核定位的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rCC16可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB/p65的核轉(zhuǎn)移，這就說明了rCC16是通過NF-κB信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)TNF-α、IL-6和IL-8的表達(dá)。

本研究中發(fā)現(xiàn)rCC16對(duì)LPS誘導(dǎo)的IL-6和IL-8的抑制作用具有劑量依賴性，而對(duì)TNF-α的抑制作用反而在高劑量下有所減弱，這種現(xiàn)象的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，分析原因可能與TNF-α本身的復(fù)雜性有關(guān)。TNF-α可被其它促炎因子刺激而生成，同時(shí)它本身也是很強(qiáng)的促炎劑，它的增高可激活多條炎癥信號(hào)通路并誘導(dǎo)其它炎癥介質(zhì)的生成。Shashikant 等[17]利用不同劑量的重組人CC16蛋白質(zhì)聯(lián)合表面活性劑治療早產(chǎn)羊呼吸窘迫綜合征模型，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合治療與單純表面活性劑治療相比可降低血漿和肺內(nèi)IL-6、IL-8和TNF-α的含量，但在最佳劑量方面各炎癥介質(zhì)亦有所差別，這與本研究中的結(jié)果具有一致性。

綜上所述，本研究顯示rCC16可抑制LPS引起的RTE細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-8的表達(dá)，這種抑制作用是通過抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的活化而實(shí)現(xiàn)的。這就為肺部炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制研究和藥物治療提供了新的思路。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effect of recombinant rat CC16 protein on LPS-induced expression of TNF-α, IL-6 and IL-8 in rat tracheal epithelial cells

PANG Min1, WANG Dong1, LI Ting1, WANG Dan1, YUAN Li-rong1, GUO Min2, WANG Hai-long3

(1DepartmentofRespiration,TheFirstHospital,2CenterofLaboratoryAnimal,3CollegeofBasicMedicine,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:pangmin2009@126.com)

AIM: To explore the effect of recombinamt rat CC16 protein (rCC16) on LPS-induced expression of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) and IL-8 in the rat tracheal epithelial (RTE) cells. METHODS: The RTE cells were incubated with rCC16 at concentrations of 0.5, 1.0 and 2.0 mg/L in serum-free media for 2 h prior to LPS (0.1 mg/L) treatment for further 24 h. The cells were harvested for assessing the mRNA levels of TNF-α, IL-6 and IL-8 by RT-qPCR. The cell culture supernatants were collected for analyzing the protein levels of TNF-α, IL-6 and IL-8 by ELISA. In addition, the nuclear translocation of nuclear factor-κB (NF-κB) p65 was tested by Western blot.RESULTS: rCC16 inhibited LPS-induced IL-6 and IL-8 expression at both mRNA and protein levels in the RTE cells in a concentration-dependent (0～2 mg/L) manner, as demonstrated by RT-qPCR and ELISA. However, no concentration-dependent manner between the dose of rCC16 and TNF-α expression was observed, and rCC16 inhibited LPS-induced TNF-α expression at lower concentration (0.5 mg/L). rCC16 concentration-dependently inhibited the effects of LPS on the level of nuclear translocation of NF-κB p65.CONCLUSION: rCC16 suppresses LPS-mediated TNF-α, IL-6 and IL-8 production through inactivation of NF-κB activity in RTE cells.

CC16 protein; Airway inflammation; LPS; Inflammatory mediators; Nuclear factor-κB

1000- 4718(2016)10- 1843- 05

2016- 05- 30

2016- 06- 20

山西省回國留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(No. 2015-101)；山西省留學(xué)回國人員科技活動(dòng)擇優(yōu)資助項(xiàng)目(No. 2016-097)；山西醫(yī)科大學(xué)博士啟動(dòng)基金(No. 03201539)

△通訊作者 Tel: 0351-4639903; E-mail: pangmin2009@126.com

R363; R563.19

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.017

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