黃芪甲苷對急性腦出血大鼠神經(jīng)功能的影響

謝 靖， 高惠春， 鄭 璽

(1石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 新疆 石河子 832008； 2阜康市人民醫(yī)院神經(jīng)科， 新疆 阜康 831500； 3解放軍第四七四醫(yī)院神經(jīng)科， 新疆 烏魯木齊 830000)

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黃芪甲苷對急性腦出血大鼠神經(jīng)功能的影響

謝 靖1△， 高惠春2， 鄭 璽3

(1石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 新疆 石河子 832008；2阜康市人民醫(yī)院神經(jīng)科， 新疆 阜康 831500；3解放軍第四七四醫(yī)院神經(jīng)科， 新疆 烏魯木齊 830000)

目的： 研究黃芪甲苷對急性腦出血大鼠神經(jīng)功能的影響，以及神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、Notch1和NF-κB蛋白表達的變化。方法: 注入自體動脈血建立實驗性急性腦出血大鼠模型，實驗分為假手術(shù)組、模型組、低劑量治療組和高劑量治療組；對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分，并考察腦系數(shù)及腦含水量； ELISA檢測血清中NSE水平；Western blot 法檢測Notch1和NF-κB表達變化。結(jié)果: 黃芪甲苷能夠減輕急性腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，顯著降低腦系數(shù)以及腦含水量，抑制急性腦出血大鼠血清中NSE水平以及Notch1和NF-κB蛋白的表達(P<0．05)。結(jié)論: 黃芪甲苷具有減輕急性腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損的作用，可能通過抑制急性腦出血大鼠血清中NSE水平以及腦組織中Notch1和NF-κB蛋白表達，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護作用。

急性腦出血； 神經(jīng)元特異性烯醇化酶； Notch1； NF-κB

急性腦出血(acute cerebral hemorrhage, ACH)主要指原發(fā)性非外傷性腦實質(zhì)內(nèi)出血，是急性腦血管病中最嚴重的一類疾病。中國急性腦出血疾病的發(fā)病率逐步提高，占急性腦血管病的20%～30%，病死率高達43%～51%，發(fā)病后患者一年內(nèi)的存活率約為38%[1]。

黃芪甲苷(astragaloside IV, AST)是中藥黃芪的主要有效成分之一，已有研究證明黃芪甲苷主要具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、抗炎、抗病毒等作用。報道指出黃芪甲苷在病毒性心肌炎中具有抗心肌細胞凋亡的作用，同時，通過抗自由基及抑制細胞凋亡而對局灶性缺血的腦組織具有保護作用[2-3]。韓金利等[4]研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷通過上調(diào)腦出血灶周圍組織的Bcl-2蛋白表達，并抑制Bax與caspase-3蛋白表達，抑制細胞凋亡，從而對出血的腦組織具有保護作用。黃芪甲苷可能通過上調(diào)ZO-1蛋白表達而抑制腦缺血再灌注后血腦屏障通透性的增高[5]。此外，黃芪甲苷通過減少炎癥物質(zhì)的作用從而減輕血腦屏障的損傷[6]，可改善腦血管通透性，從而減輕炎癥、腦水腫與腦缺血等癥狀。本研究通過建立實驗性急性腦出血大鼠模型，探討黃芪甲苷對急性腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損的作用，并初步探討其相關(guān)機制。

材 料 和 方 法

1 材料

健康Wistar大鼠40只，雌雄各半，體重(300±20) g，10～12周齡，由南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供，自由飲食，飼養(yǎng)環(huán)境的室溫為(22±2) ℃。

黃芪甲苷購自上海純優(yōu)生物科技有限公司，純度大于98%；神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)ELISA試劑盒購自ADL；抗Notch1抗體和NF-κB抗體購自天津賽爾生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 急性腦出血大鼠模型的建立 參照呂田明等[7]的方法建立大鼠急性腦出血模型，具體方法為采用10%水合氯醛腹腔注射(0.4 mL/100 g)，成功麻醉后，俯臥固定于腦立體定位儀上，水平針穿破耳鼓膜，固定門齒與門齒溝，切開頭部中央皮膚，暴露顱骨與前囪，以前囪為0點，前囪后0.2 cm，中線右側(cè)3 mm處用微型電鉆鉆直徑為1 mm的孔，用微量注射器吸取大鼠自體尾動脈血，以20 μL/min速度緩緩推進腦組織，注入血量為50 μL，進針深度為6 mm，留針30 min后拔出，用磷酸鋅黏固劑封閉，縫合，局部碘酒消毒。

2.2 實驗分組與樣本采集 采用隨機的方法將40只大鼠隨機分為4組：假手術(shù)組(sham組)，建模步驟同模型組，但不注入尾靜脈血；模型組(即ACH組)，給予相同劑量的生理鹽水灌胃，每天灌胃1次，共給藥21 d；低、高劑量AST治療組(AST-L組、AST-H組)在造模成功后分別給予黃芪甲苷100 mg/kg與200 mg/kg，每天灌胃1次，共給藥21 d。分別于給藥1 d、4 d、7 d、14 d、21 d時尾靜脈取血，4 000 r/min離心4 min，分離血清，置于-80 ℃冰箱中備用；給藥完成后，用10%水合氯醛過量麻醉，斷頭取腦，分離出腦內(nèi)血腫部位，液氮中保存。

2.3 神經(jīng)功能評分方法(neurological deficit score, NDS) 參照Longa等[8]的方法對模型進行評分，共分為5級：無神經(jīng)功能缺損，正常活動為0分；癱瘓側(cè)前肢不能充分伸展為1分；大鼠有向癱瘓側(cè)側(cè)旋的行為為2分；向癱瘓側(cè)傾倒為3分；無法自發(fā)行走，存在意識障礙為4分；觀察大鼠麻醉清醒后的形態(tài)，進行神經(jīng)功能評分，每天1次。

2.4 腦系數(shù)與腦水腫的測定 快速斷頭取腦后，稱量全腦重量，計算腦系數(shù)(%)=全腦重量/體重×100%；按冠狀面切開腦組織，分為左前、左后、右前和右后4個部分，濾紙吸干表面水分，稱量左后和右后兩部分濕重，置于95 ℃烘箱4 d，烘干至恒重，計算腦組織含水量(%)=(濕重-干重)×100%。

2.5 免疫酶聯(lián)測定血清中NSE的含量 按照試劑盒說明書進行操作，依次將相應的100 μL標準品加入酶標版的空白微孔，編號，再分別加入100 μL樣品血清至空白微孔；各孔分別加入50 μL的酶標記液，37 ℃孵育1 h，清洗，每孔加入底物A、 B液各50 μL，避光反應15 min，加入50 μL終止液終止反應，于酶標儀450 nm處讀取吸光度(A)值。

2.6 Western blot實驗 取各組大鼠血腫組織，加入蛋白裂解液，蛋白定量后，調(diào)整蛋白量。取適量裂解產(chǎn)物，上樣后進行SDS-PAGE。完成電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入5%的脫脂奶粉的TBST溶液，室溫放置1 h，TBST快洗1次，加入相應 I 抗孵育，4 ℃過夜，TBST液洗滌3次，加入相對應的 II 抗室溫孵育45 min，TBST液洗滌3次，加入ECL化學發(fā)光液孵育3 min，暗盒曝光，顯影沖洗，測定蛋白條帶的積分吸光度。

3 統(tǒng)計學處理

運用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，所有實驗數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，各組間差異采用單因素方差(one-way ANOVA)進行分析，采用Bonferroni校正的t檢驗分析兩兩數(shù)據(jù)間的差異，以P<0．05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 神經(jīng)功能缺損評分

假手術(shù)組的大鼠麻醉清醒后能正?；顒?；模型組的大鼠大多數(shù)向癱瘓側(cè)傾倒，個別出現(xiàn)無法自發(fā)行走，并隨時間推移而癥狀加重；低劑量治療組的大鼠剛開始出現(xiàn)向癱瘓側(cè)傾倒，向癱瘓側(cè)側(cè)旋，隨時間推移，癥狀減輕；高劑量治療組的大鼠剛開始出現(xiàn)向癱瘓側(cè)側(cè)旋的癥狀，隨時間推移癥狀減輕。與假手術(shù)組相比，模型組和治療組的NDS評分均顯著上升(P<0．05)，提示造模成功；與模型組相比，治療組大鼠的神經(jīng)功能缺損程度顯著減輕，且高劑量組減輕程度較大，見表1。

表1 各組大鼠腦出血神經(jīng)功能缺損評分表

*P<0．05vssham group;#P<0．05vsACH group.

2 黃芪甲苷對急性腦出血大鼠腦水腫形成的影響

如表2所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的腦系數(shù)和腦含水量均顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，黃芪甲肝對急性腦出血大鼠腦系數(shù)和腦含水量均顯著下降(P<0.05)，以高劑量療效較好。

3 黃芪甲苷對血清中NSE水平變化的影響

與假手術(shù)組相比，模型組的NSE水平顯著升高(P<0.05)，在4 d時達到最大值；與模型組相比，低、高劑量治療組的NSE水平均顯著下降(P<0.05)，其中高劑量治療組下降程度較大，見表3。

表2 各組大鼠腦系數(shù)和腦含水量的變化

Table 2.The changes of brain coefficient and water content (%.Mean±SD.n=10)

GroupBraincoefficientBrainwatercontentSham0．34±0．0272．19±3．04ACH0．56±0．04?76．47±1．43?AST?L0．41±0．03#73．14±1．08#AST?H0．37±0．02#72．38±1．27#

*P<0．05vssham group;#P<0．05vsACH group.

表3 大鼠血清中NSE水平的變化

*P<0．05vssham group;#P<0．05vsACH group.

4 各組大鼠血腫腦組織中Notch1蛋白表達的變化

如圖1所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血腫腦組織中Notch1的蛋白表達顯著上升(P<0．05)；與模型組相比，低、高劑量治療組大鼠血腫腦組織中Notch1的蛋白表達顯著下降(P<0．05)，高劑量治療組降低幅度更大。

5 各組大鼠血腫腦組織中NF-κB蛋白表達的變化

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血腫腦組織中NF-κB的蛋白表達顯著上升(P<0．05)；與模型組相比，低、高劑量治療組大鼠血腫腦組織中NF-κB的蛋白表達顯著下降(P<0．05)，高劑量治療組降低幅度更大，見圖2。

討 論

NSE主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，作為糖酵解途徑的一種關(guān)鍵生物酶，以腦組織中含量最多，常作為腦出血所致神經(jīng)損傷的標志物。當腦組織損傷時，細胞膜被破壞，釋放NSE進入腦脊液或通過血腦屏障進入外周血[9]。有報道指出腦出血后急性期患者血清NSE顯著增高，常在2～5 d時出現(xiàn)最大值[10]；腦出血量越大，NSE水平升高越顯著[11]。腦出血急性期血清中NSE含量的峰值與血腫大小和神經(jīng)功能缺損評分呈正相關(guān)[12]。本實驗中發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能夠顯著改善急性腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損的程度，降低腦系數(shù)和腦含水量，并降低急性腦出血大鼠血清中的NSE，提示黃芪甲苷具有保護神經(jīng)功能的作用。

Figure 1.The expression of Notch1 in hematoma tissue of each group. Mean±SD.n=3.*P<0．05vssham group;#P<0．05vsACH group.

圖1 各組大鼠血腫組織中Notch1的蛋白表達變化

Figure 2.The expression of NF-κB in hematoma tissue of each group. Mean±SD.n=3.*P<0．05vssham group;#P<0．05vsACH group.

圖2 各組大鼠血腫組織中NF-κB的蛋白表達變化

Notch信號通路和NF-κB與腦損傷后的炎癥反應有關(guān)。Notch在缺血性腦損傷部位激活后，引起淋巴細胞的增殖和細胞因子的分泌，進而促進免疫炎性反應[13]。研究表明Notch在腦缺血性損傷時的表達異常上升，增加炎癥反應并促進神經(jīng)細胞凋亡[14]。NF-κB是一種可以啟動免疫和炎癥反應相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在腦出血的血腫周圍區(qū)表達顯著增加，Notch信號通路通過調(diào)控NF-κB的表達來調(diào)節(jié)缺血后炎癥基因的表達[15]。研究發(fā)現(xiàn)，腦出血發(fā)生后，NF-κB開始活化，并在1～3 d內(nèi)達到峰值[16]。本實驗中發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷對腦組織神經(jīng)具有保護作用，可能與Notch1和NF-κB的表達有關(guān)，

本研究通過觀察黃芪甲苷對實驗性急性腦出血大鼠模型的影響，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷具有抑制腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損的作用，可能通過調(diào)節(jié)Notch1和NF-κB蛋白表達，從而發(fā)揮保護腦神經(jīng)組織的作用。

[1] Ferro JM. Update on intracerebral heamorrhage[J]. J Neurol, 2006, 253(8):985-999.

[2] 曲友直，趙燕玲，李 敏，等.黃芪甲苷對腦缺血再灌注后血腦屏障的保護作用及occludin蛋白表達的影響[J].卒中與神經(jīng)疾病，2010, 17(2):92-94.

[3] 朱燕輝，嚴奉祥. 黃芪甲苷及其生物學活性[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2008, 8(4):781-783.

[4] 韓金利，劉廣輝，劉海洋，等.黃芪對大鼠腦出血灶周圍神經(jīng)元caspase-3表達的影響[J]. 寧夏醫(yī)科大學學報, 2013, 35(5):489-491.

[5] Qu YZ, Min L, Yan LZ, et al. Astragaloside IV atte-nuates cerebral ischemia-reperfusion-induced increase in permeability of the blood-brain barrier in rats[J]. Eur J Pharmacol, 2009, 606(1-3):137-141.

[6] 吳大正，胡之璧. 黃芪皂苷甲對組胺引起的大鼠腦軟膜微血管內(nèi)皮增加的影響[J]. 中國中藥雜志, 2001, 26(12):850-853.

[7] 呂田明，陸兵勛，李中秋. 兩次注射自體動脈血法構(gòu)建大鼠尾狀核腦出血模型[J]. 中國臨床康復，2005, 9(5):86-87.

[8] Longa EZ, Weinstein PR, Carvlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989, 20(1):84-91.

[9] Jung CS, Lange B, Zimmermann M, et al. CSF and serum biomarkers focusing on cerebral vasospasm and ischemia after subarachnoid hemorrhage[J]. Stroke Res Treat, 2013, 2013:560305.

[10]Bharosay A, Bharosay VV, Varma M, et al. Correlation of brain biomarker neuron specific enolase (NSE) with degree of disability and neurological worsening in cerebrovascular stroke[J]. Indian J Clin Biochem, 2012, 27(2):186-190.

[11]何曉英，孟宜良，榮本兵，等.腦出血患者血清中神經(jīng)元特異性烯醇化酶的臨床意義[J]. 瀘州醫(yī)學院學報, 2003, 26(2):120-122.

[12]王光海，田代實，郭國際. 腦出血急性期血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶的動態(tài)變化和意義[J].中國急救醫(yī)學, 2003, 23(12):845-846.

[13]Arumugam TV, Chan SL, Jo DG, et al. Gamma secretase-mediated Notch signaling worsens brain damage and functional outcome in ischemic stroke[J]. Nat Med, 2006, 12(6):621-623.

[14]程建華，劉 雙，韓 釗，等.姜黃素通過調(diào)控Notch通路促進大鼠腦缺血后神經(jīng)干細胞增殖和遷移[J].中國病理生理雜志，2013，29(5)：878-882.

[15]Wei Z, Chigurupati S, Arumugam TV, et al. Notch activation enhances the microglia-mediated inflammatory response associated with focal cerebral ischemia[J]. Stroke, 2011, 42(9):2589-2594.

[16]Wang J, Dore S. Inflammation after intracerebral hemorrhage[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2007, 27(5):894-908.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of astragaloside IV on neurological function in acute cerebral he-morrhage rats

XIE Jing1, GAO Hui-chun2, ZHENG Xi3

(1DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospitalofMedicalCollege,ShiheziUniversity,Shihezi832008,China;2DepartmentofNeurology,FukangPeople’sHospital,Fukang831500,China;3DepartmentofNeurology,No. 474HospitalofPLA,Wulumuqi830000,China.E-mail:xiejing19788@163.com)

AIM: To investigate the effect of astragaloside IV on neurological function and the protein expression of neuron-specific enolase (NSE), Notch1 and NF-κB in acute cerebral hemorrhage (ACH) rats.METHODS: ACH model in rats was established via injection of autologous blood, and the rats were divided into 4 groups: sham, ACH, ACH+astragaloside IV (100 mg/kg) and ACH+astragaloside IV (200 mg/kg) groups. The impairment of neurological function in each group was graded, and the brain coefficient and water content were calculated. The serum level of NSE was measured by ELISA. Additionally, the expression of Notch1 and NF-κB was determined by Western blot. RESULTS: Astragaloside IV improved the neurological function and decreased the brain coefficient and water content in ACH rats. Moreover, the ACH-induced increase in NSE was inhibited after astragaloside IV treatment. Similarly, astragaloside IV also significantly attenuated the expression of Notch1 and NF-κB in ACH rats.CONCLUSION: Astragaloside IV attenuates the impairment of neurological function in ACH rats, which may be through decreasing the NSE level and down-regulating the expression of Notch1 and NF-κB.

Acute cerebral hemorrhage; Neuron-specific enolase; Notch1; NF-κB

1000- 4718(2016)10- 1905- 04

2016- 04- 12

2016- 07- 25

△通訊作者 Tel: 0993-2858492； E-mail： xiejing19788@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.028

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