依維莫司對大鼠實(shí)驗(yàn)性IgA腎病的作用

周 敏， 唐惠玲

(江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇 淮安 223003)

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依維莫司對大鼠實(shí)驗(yàn)性IgA腎病的作用

周 敏， 唐惠玲△

(江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇 淮安 223003)

目的： 觀察依維莫司對大鼠實(shí)驗(yàn)性IgA腎病的作用并初步探討其機(jī)制。方法: 建立實(shí)驗(yàn)性IgA腎病大鼠模型，實(shí)驗(yàn)共分為正常對照(control)組、模型組(IgA組)和依維莫司給藥組；測定給藥后各組大鼠尿紅細(xì)胞、尿蛋白和尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)的含量；免疫熒光染色檢測腎組織中IgA沉淀情況；Western blot法檢測髓樣分化因子88(MyD88)、TLR4、NF-κB、IL-4和IL-13的蛋白表達(dá)水平；實(shí)時熒光定量PCR檢測IL-4與IL-13的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果: 依維莫司能夠抑制實(shí)驗(yàn)性IgA腎病大鼠尿紅細(xì)胞、尿蛋白和尿NAG含量的升高， 抑制MyD88、TLR4、NF-κB和IL-4和IL-13蛋白表達(dá)水平的上調(diào)，以及抑制IL-4和IL-13 mRNA表達(dá)水平的上調(diào)。結(jié)論: 依維莫司能降低IgA腎病大鼠尿紅細(xì)胞、尿蛋白和尿NAG含量，其作用可能與其調(diào)節(jié)MyD88、TLR4、NF-κB、IL-4與IL-13的表達(dá)有關(guān)。

依維莫司； IgA腎??； 髓樣分化因子88； NF-κB； TLR4； IL-4； IL-13

IgA腎病是臨床上最常見的一種原發(fā)性腎小球腎炎，主要表現(xiàn)在腎小球系膜區(qū)有IgA或以IgA為主的免疫球蛋白顆粒樣或團(tuán)塊狀沉積引起的病理性變化，主要有無癥狀性血尿、腎病綜合征、急性腎炎及腎功能不全等臨床癥狀，以往認(rèn)為IgA腎病的預(yù)后良好，但仍有約25%～30%的患者發(fā)展為終末期腎病[1]。目前，IgA腎病還缺乏特異性的治療方法，主要根據(jù)患者不同的臨床表現(xiàn)和病狀采取不同的治療措施。

依維莫司(everolimus，Eve)是一種口服哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抑制劑，是mTOR 的選擇性抑制劑。腎移植后長期慢性損傷的發(fā)病率和死亡率較高，而依維莫司具有抗增殖和抗遷移能力，這使它應(yīng)用于腎移植受者時，具有潛在的保護(hù)腎功能和抗惡性腫瘤作用[2]。Budde等[3]進(jìn)行了一項(xiàng)多中心的隨機(jī)對照試驗(yàn)，154 例患者于腎移植術(shù)后使用依維莫司，發(fā)現(xiàn)依維莫司比環(huán)孢素更有效改善患者的腎小球?yàn)V過率，證實(shí)依維莫司有改善腎功能的作用。但尚未有文獻(xiàn)報道依維莫司用于IgA腎病的治療，本實(shí)驗(yàn)通過建立IgA腎病大鼠模型，觀察依維莫司對IgA腎病大鼠的尿液中紅細(xì)胞、尿蛋白和尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAG)的影響，并初步探討相關(guān)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動物和試劑

健康Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，SPF級，體重(220±20) g，10周齡，雌雄各半，購自南京君科生物工程有限公司，室溫22 ℃±2 ℃，晝夜12 h，定時定量飲水喂食。

依維莫司(瑞士諾華制藥有限公司)；牛血清蛋白、脂多糖、四氯化碳(Sigma)；蓖麻油(上?；瘜W(xué)試劑廠)；熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物公司)；髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)、Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、IL-4和IL-13抗體(Santa Cruz)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物造模與分組 將SD大鼠進(jìn)行為期7 d的常規(guī)飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)共分為正常對照(control)組、IgA腎病模型組(IgA組)和Eve給藥組，每組12只，按照湯穎等[4]的方法建立實(shí)驗(yàn)性IgA腎病大鼠模型，除正常對照組外，其它各組大鼠以10% BSA灌胃(400 kg·kg-1·d-1)共6周；于第6周和第8周末尾靜脈注射0.05 mg脂多糖(每只1次)；皮下注射蓖麻油0.5 mL與四氯化碳0.1 mL，每周1次共9周。于第9周末，心臟取血處死4只模型組大鼠，取腎臟組織做免疫熒光檢查。正常對照組在相應(yīng)時間給予等體積蒸餾水灌胃，生理鹽水皮下注射和尾靜脈注射。第10周開始，給藥組大鼠灌胃依維莫司1.5 kg·kg-1·d-1，共30 d。

2.2 尿紅細(xì)胞、尿蛋白和尿NAG含量水平的測定 給藥結(jié)束后，將各組大鼠置于代謝籠中飼養(yǎng)，自由飲食，收集24 h尿液，送淮安市食品藥品檢驗(yàn)所檢驗(yàn)科測量尿紅細(xì)胞、尿蛋白和尿NAG的水平。2.3 免疫熒光染色 給藥結(jié)束后處死大鼠，摘除腎臟，用組織包埋劑OCT包埋，放入-80 ℃冰箱中冷凍，切片，晾干，PBS緩沖液洗滌 5 min 3次，滴加FITC標(biāo)記的IgA抗體(1∶50)，放入37 ℃恒溫箱中孵育30 min，PBS洗滌5 min 3次，滴入甘油進(jìn)行封片，于熒光顯微鏡觀察IgA的沉淀情況與綠色熒光的強(qiáng)度，-為無熒光；±為弱熒光；+熒光弱但清晰；++熒光明亮；+++強(qiáng)熒光。

2.4 Western blot法檢測MyD88、TLR4、NF-κB、IL-4和IL-13蛋白的表達(dá)水平 采用蛋白裂解液裂解各組大鼠腎組織細(xì)胞，收集蛋白后定量，調(diào)整蛋白量。取適量裂解產(chǎn)物，上樣后進(jìn)行SDS-PAGE。完成電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉的TBST溶液，室溫封閉1 h，孵育相應(yīng) I 抗，4 ℃過夜，室溫孵育相應(yīng) II 抗1 h， 化學(xué)發(fā)光法顯色，成像掃描分析系統(tǒng)測定蛋白條帶的積分吸光度。

2.5 實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)檢測IL-4與IL-13的mRNA表達(dá)水平 嚴(yán)格按照TRIzol說明書要求，提取大鼠腎臟組織細(xì)胞的總RNA，蛋白定量后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。IL-4的上游引物序列為5’-GCTGTCACCCTGTTCTG-3’，下游引物序列為5’-GAGCGTGGACTCATTCA-3’；IL-13的上游引物序列為5’-CTCGCTTGCCTTGGTG-3’，下游引物序列為5’-TGATGTTGCTCAGCTCCTC-3’；β-actin的上游引物序列為5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，下游引物序列為5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。擴(kuò)增條件為94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果在熒光定量操作系統(tǒng)中進(jìn)行分析對比，采用2-ΔΔCt對IL-4和IL-13 mRNA表達(dá)進(jìn)行相對定量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數(shù)間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠尿紅細(xì)胞、尿蛋白與尿NAG含量水平的變化

模型組大鼠尿液中的紅細(xì)胞、蛋白與NAG含量均顯著高于正常對照組(P<0．05)，給予依維莫司后，大鼠尿液中紅細(xì)胞、蛋白與NAG含量顯著低于模型組(P<0．05)，但未到達(dá)正常水平，見表1。

表1 尿紅細(xì)胞、尿蛋白與尿NAG含量的變化

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsIgA.

2 免疫熒光檢測腎組織的IgA沉積

正常對照組中不出現(xiàn)綠色熒光的IgA沉積，強(qiáng)度為-；模型組可見團(tuán)塊狀或彌漫性顆粒狀沉淀，呈強(qiáng)綠色熒光，強(qiáng)度為+++，提示造模成功；給予依維莫司后，IgA沉淀綠色熒光顯著減弱，強(qiáng)度為+，見圖1。

Figure 1.The level of IgA precipitation in each group. Mean±SD.n=6.*P<0．05vscontrol;#P<0．05vsIgA.

圖1 各組大鼠腎組織IgA沉淀的免疫熒光結(jié)果

3 大鼠腎組織細(xì)胞中MyD88與TLR4蛋白表達(dá)的變化

模型組大鼠的腎組織細(xì)胞中MyD88和TLR4蛋白表達(dá)顯著高于正常對照組(P<0.05)；與模型組相比，給藥組的MyD88和TLR4蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)，但仍顯著高于正常對照組(P<0.05)，見圖2。

4 大鼠腎組織細(xì)胞中NK-κB蛋白表達(dá)的變化

模型組大鼠的腎組織細(xì)胞中NK-κB蛋白表達(dá)顯著高于正常對照組(P<0.05)；與模型組相比，給藥組的NK-κB蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)，但仍顯著高于正常對照組(P<0.05)，見圖3。

5 大鼠腎組織細(xì)胞中IL-4與IL-13 蛋白表達(dá)的變化

模型組大鼠的腎組織細(xì)胞中IL-4與IL-13 蛋白表達(dá)顯著高于正常對照組(P<0.05)；與模型組相比，給藥組的IL-4與IL-13蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)，但仍顯著高于正常對照組(P<0.05)，見圖4。

6 大鼠腎組織細(xì)胞中IL-4與IL-13 mRNA表達(dá)的變化

模型組大鼠的腎組織細(xì)胞中IL-4與IL-13的mRNA表達(dá)顯著高于正常對照組(P<0.05)；與模型組相比，給藥組IL-4與IL-13的mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.05)，但仍顯著高于正常對照組(P<0.05)，見圖5。

Figure 2.The protein expression of MyD88 and TLR4. Mean±SD.n=6.*P<0．05vscontrol;#P<0．05vsIgA.

圖2 MyD88與TLR4蛋白表達(dá)的變化

Figure 3.The protein expression of NK-κB. Mean±SD.n=6.*P<0．05vscontrol;#P<0．05vsIgA.

圖3 NK-κB蛋白表達(dá)的變化

討 論

本實(shí)驗(yàn)通過建立IgA腎病大鼠模型，免疫熒光結(jié)果顯示造模組大鼠腎小球系膜區(qū)出現(xiàn)團(tuán)塊狀或彌漫性顆粒狀沉淀，呈強(qiáng)綠色熒光，符合IgA腎病的病理變化，提示IgA腎病大鼠模造模成功。血尿是IgA

Figure 4. The protein expression of IL-4 and IL-13. Mean±SD.n=6.*P<0．05vscontrol;#P<0．05vsIgA.

圖4 IL-4與IL-13 蛋白表達(dá)的變化

Figure 5.The mRNA expression of IL-4 and IL-13. Mean±SD.n=6.*P<0．05vscontrol;#P<0．05vsIgA.

圖5 IL-4與IL-13的mRNA表達(dá)的變化

腎病最常見的臨床癥狀，常為首發(fā)癥狀，為系膜區(qū)出現(xiàn)基質(zhì)和細(xì)胞增生。蛋白尿是引起腎小管間質(zhì)損害的因素之一，使腎小管細(xì)胞缺氧導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞萎縮[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示依維莫司具有抑制IgA腎病大鼠的尿紅細(xì)胞、尿蛋白和尿NAG水平異常升高的作用，提示依維莫司可能具有減少IgA腎病對腎小管間質(zhì)損害的作用。

TLR4是TLR家族的重要成員之一，在天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮不可或缺的作用，研究發(fā)現(xiàn)TLR4的表達(dá)在纖維化過程和炎癥反應(yīng)中具有重要作用。Asea等[6]研究發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞通過TLR4信號途徑完成熱休克蛋白識別結(jié)合配體。近來研究表明TLR4在IgA腎病患者中外周單核細(xì)胞的表達(dá)增加，并推測TLR的激活可能影響IgM轉(zhuǎn)化為IgA，從而參與IgA腎病的發(fā)展[7]。MyD88是Toll樣受體信號通路中的一個關(guān)鍵因子，在傳遞上游信息和疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)中依維莫司干預(yù)后能夠抑制IgA腎病大鼠腎組織中TLR4蛋白表達(dá)的升高，提示MyD88與TLR4可能是依維莫司作用于IgA腎病的一個靶點(diǎn)。

NF-κB幾乎存在于所有細(xì)胞，主要參與免疫反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)并參與調(diào)控多種基因的表達(dá)，如IL-2、IL-8、MCP-1等具有調(diào)控腎臟多種疾病發(fā)生發(fā)展的作用[8-9]。NF-κB的亞基p65在蛋白C末端含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，研究指出此區(qū)域在IgA腎病慢性炎癥中起重要作用[10]。NF-κB通過調(diào)控細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，使得單核巨噬細(xì)胞浸潤以及腎小管上皮細(xì)胞分化，從而參與腎小管間質(zhì)損害的過程。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IgA腎病大鼠腎組織細(xì)胞中NF-κB的蛋白表達(dá)顯著高于正常大鼠，依維莫司干預(yù)后NF-κB的蛋白表達(dá)顯著下降，提示依維莫司能夠很好地抑制IgA腎病腎組織中NF-κB的活化，減少其在腎組織細(xì)胞中的表達(dá)，同時說明NF-κB的活化可作為評價治療IgA腎病的靶點(diǎn)之一。

IL-4與IL-13由活化Th2細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)抗體的生成，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。研究表明IL-4與IL-13對腎小管上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能具有調(diào)節(jié)作用，并對腎小管上皮細(xì)胞造成損傷[11]。報道指出IL-13對足細(xì)胞有直接損傷作用，造成功能異常，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障損傷[12]。依維莫司通過抑制IgA腎病大鼠腎組織中IL-4與IL-13的表達(dá)，從而對腎臟產(chǎn)生保護(hù)作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)依維莫司對大鼠IgA腎病具有一定的療效，并為以后用于臨床治療IgA腎病提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Everolimus prevents experimental IgA nephropathy in rats

ZHOU Min, TANG Hui-ling

(PharmaceuticalCollege,JiangsuFood&PharmaceuticalScienceCollege,Huai’an223003,China.E-mail:tanghuiling1985@126.com)

AIM: To investigate the effects of everolimus on the experimental IgA nephropathy in rats and its possible mechanisms. METHODS: The rat model of experimental IgA nephropathy was established. The rats were randomly divided into control group, IgA group and everolimus treatment group. After the corresponding treatments were gi-ven, urinary red blood cells, protein andN-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAG) were examined. Immunofluorescence staining was used to analyze the level of IgA precipitation in the renal tissues. Additionally, the protein expression of myeloid differentiation factor 88 (MyD88), TLR4, NF-κB, IL-4 and IL-13 was determined by Western blot. The mRNA levels of IL-4 and IL-13 were detected by qPCR. RESULTS: Everolimus significantly inhibited the increases in the urinary levels of red blood cells, protein and NAG in experimental IgA nephropathy rats. Furthermore, IgA nephropathy-induced increases in the protein expression of MyD88, TLR4, NF-κB, IL-4 and IL-13 were attenuated after everolimus treatment. Similar results were obtained in the mRNA levels of IL-4 and IL-13 by qPCR detection.CONCLUSION: Everolimus improves the impairments of renal function in experimental IgA nephropathy rats as evidenced by decreasing urinary red blood cells, protein and NAG, which may be related to the inhibition of MyD88, TLR4, NF-κB, IL-4 and IL-13 expression.

Everolimus; IgA nephropathy; Myeloid differentiation factor 88; NF-κB; TLR4; IL-4; IL-13

1000- 4718(2016)10- 1887- 05

2016- 04- 19

2016- 06- 01

△通訊作者 Tel： 0517-87088188； E-mail： tanghuiling1985@126.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.024

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