RNA干擾AKT2的表達對膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤替莫唑胺敏感性的影響

崔勇 張風(fēng)林 鮑晶 應(yīng)奇* 胡國漢 駱純 盧亦成

(1解放軍第411醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200081; 2第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院，上海市神經(jīng)外科研究所，上海 200003)

·腦膠質(zhì)細胞瘤研究·

RNA干擾AKT2的表達對膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤替莫唑胺敏感性的影響

崔勇1張風(fēng)林1鮑晶1應(yīng)奇1*胡國漢2駱純2盧亦成2

(1解放軍第411醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200081;2第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院，上海市神經(jīng)外科研究所，上海 200003)

目的研究RNA干擾絲/蘇氨酸蛋白激酶2 (AKT2)對腦膠質(zhì)瘤移植瘤的替莫唑胺療效的改變。方法構(gòu)建膠質(zhì)瘤裸鼠成瘤模型，瘤內(nèi)注射和腹腔內(nèi)給替莫唑胺(TMZ)藥物，以替莫唑胺化療藥物和AKT2短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(AKT2-shRNA)表達載體對成瘤后的裸鼠瘤體進行聯(lián)合干預(yù)治療，進而觀察并測量各組裸鼠腫瘤體積大小。DNA斷裂的原位末端標記法(TUNEL)測定并計算分析各組裸鼠成瘤后腫瘤組織細胞的凋亡的變化。結(jié)果空白對照組、替莫唑胺化療組、TMZ+陰性對照組、TMZ+AKT2干擾組裸鼠瘤體體積分別為：(669.34±98.73)mm3、(399.86±55.26)mm3、(383.81±34.01)mm3、(297.72±41.49)mm3；瘤體質(zhì)量分別為：(1.25±0.26)g、(0.72±0.11)g、(0.69±0.07)g、(0.52±0.07)g。TMZ+AKT2干擾組其腫瘤體積及瘤體質(zhì)量都明顯小于空白對照組、替莫唑胺組和TMZ+陰性對照組，有顯著性差異(Plt;0.05)。TUNEL實驗結(jié)果顯示：空白對照組、替莫唑胺化療組、TMZ+陰性對照組、TMZ+AKT2干擾組裸鼠瘤體凋亡指數(shù)分別為：7.15%±1.04%、25.26%±2.71%、26.63%±3.46%、42.81%±5.97%。TMZ+AKT2干擾組其腫瘤凋亡情況明顯高于空白對照組、替莫唑胺組和TMZ+陰性對照組，結(jié)果有顯著性差異(Plt;0.05)。結(jié)論RNA干擾AKT2能夠顯著提高裸鼠膠質(zhì)母細胞瘤對TMZ化療的敏感性。

絲/ 蘇氨酸蛋白激酶2; 膠質(zhì)瘤; 替莫唑胺

替莫唑胺(temozolomide, TMZ)已成為臨床上腦膠質(zhì)瘤一線化療藥物。聯(lián)用替莫唑胺與生物靶向藥物以提高療效和降低毒性反應(yīng)是近年來最為活躍的研究領(lǐng)域之一。通過不同途徑聯(lián)合作用于膠質(zhì)瘤細胞可能提高化療敏感性。本研究先將前期實驗構(gòu)造的絲/蘇氨酸蛋白激酶2 (serine/ threonine kinase β, AKT2)短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(AKT2-shRNA)通過瘤內(nèi)注射的方式轉(zhuǎn)染U251細胞株，在裸鼠體內(nèi)環(huán)境中以研究轉(zhuǎn)染AKT2-shRNA能否提高膠質(zhì)瘤細胞株對化療藥物替莫唑胺敏感性。為后續(xù)研究AKT2改變TMZ對腦膠質(zhì)瘤化療療效的分子機理打下理論和實驗基礎(chǔ)。

材料與方法

一、主要實驗材料和試劑

慢病毒介導(dǎo)的AKT2-shRNA表達載體由中科院上海生命科學(xué)院協(xié)助構(gòu)建。腦膠質(zhì)瘤U251細胞購自中科院上海生化與細胞所細胞庫，以含10%新生胎牛血清的細胞培養(yǎng)液(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)中培養(yǎng)。shRNA試劑盒購于Invitrogen公司。兔抗人AKT2單克隆抗體購自臺灣Abnova公司。替莫唑胺藥物由天士力公司提供。

二、細胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將處于對數(shù)生長期的U251細胞接種于6孔培養(yǎng)板，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細胞融合達70%，將AKT2-shRNA轉(zhuǎn)染U251細胞。同時轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)特異性的shRNA(GFP-shRNA)作陰性對照。

三、裸鼠培養(yǎng)及成瘤

使用無特定病原體(specefic pathogen free, SPF)動物實驗環(huán)境中的繁殖，在室溫下對裸鼠適用的是26～28℃，相對溫度保持在40%～60%。每天保持10 h，14 h，無光暗周期。2 w后觀察40只裸鼠約0.7 cm2腫瘤結(jié)節(jié)直徑為標準。

四、細胞接種、藥物干預(yù)

在SPF環(huán)境超凈工作臺內(nèi)，充分混勻細胞懸液，用無菌注射器吸取0.2 ml細胞懸液(U251細胞1×107/ml)。將裸鼠固定，75%酒精常規(guī)消毒裸鼠腹股溝皮膚，皮下注射。接種第20天左右開始，選取成瘤大小0.7 cm左右成瘤標準裸鼠24只，隨機分組分四組。每3天給藥1次，共6次。具體分組及操作方法如下：①空白對照組：每只裸鼠注射入300 μl生理鹽水。②替莫唑胺藥物組：按40 mg/kg/d/劑量，每只裸鼠注射入300 μl替莫唑胺稀釋液。③替莫唑胺藥物+陰性對照病毒共同作用組：按40 mg/kg/d/劑量，每只裸鼠注射入300 μl替莫唑胺稀釋液和陰性病毒液稀釋液。④替莫唑胺藥物+AKT2-shRNA共同作用組：按40 mg/kg/d/劑量，每只裸鼠注射入300 μl替莫唑胺稀釋液和AKT2-shRNA病毒液。裸鼠腹腔部位局部皮膚碘伏消毒。將稀釋液緩慢注射入腹腔，連續(xù)3次。裸鼠成瘤后重新計算時間，第1天按組給藥，每3天藥物干預(yù)1次并用游標卡尺測量一次腫瘤長徑及短徑，做好記錄。共藥物干預(yù)6次，16 d。停藥1 w后，即藥物干預(yù)后第23天處死所有實驗裸鼠，并取出瘤體，腫瘤測量大小，稱重。同時將瘤體按分組編號放好拍照。腫瘤抑制率=(對照組瘤體體積-處理組瘤體體積)/對照組瘤體體積。瘤體積增長率=(瘤體終體積-瘤體初體積)/瘤體初體積。腫瘤體積立方毫米(= 0.5236×長×短徑×寬)。

五、TUNEL實驗步驟

將組織切片置于染色缸中,用二甲苯洗兩次，每次5 min。用無水乙醇洗兩次，每次3 min。用95%和75%乙醇各洗一次，每次3 min。用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗5 min 加入蛋白酶K溶液(20 μg/ml)，于室溫水解15 min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2 min。在樣本上滴加100 μl DNase I反應(yīng)液，室溫條件下反應(yīng)30 min后，PBS沖洗5 min，沖洗3次。每個樣品再滴加50 μl末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT) 反應(yīng)液，放入濕盒內(nèi)，室溫37℃條件避光反應(yīng)1 h。反應(yīng)后1X PBS漂洗三次，避光操作，每次5 min。每個樣品上滴加50 μl四甲基異硫氰酸羅丹明 (tetramethyl rhodamin isothiocyanate, TRITC)標記的鏈霉素親和素(streptavidin)工作液，放入濕盒內(nèi)，室溫37℃條件反應(yīng)1 h。反應(yīng)后再次1×PBS漂洗5 min，重復(fù)漂洗3次。4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色復(fù)染細胞核，10 min，室溫條件下。洗去DAPI染液后滴加適量體積比封片劑(甘油：PBS=6：4)，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、裸鼠成瘤實驗結(jié)果

實驗中處死裸鼠時，測量體積稱重，數(shù)據(jù)顯示：空白對照組、替莫唑胺化療組、TMZ+陰性對照組、TMZ+AKT2干擾組裸鼠瘤體體積分別為：(669.34±98.73)mm3、(399.86±55.26)mm3、(383.81±34.01)mm3、(297.72±41.49)mm3；質(zhì)量分別為：(1.25±0.26)g、(0.72±0.11)g、(0.69±0.07)g、(0.52±0.07)g。TMZ+AKT2干擾組其腫瘤體積、質(zhì)量都小于其他三組，有顯著性差異(Plt;0.05)(圖1, 2)。

二、TUNEL檢測結(jié)果

TUNEL實驗結(jié)果顯示：空白對照組、替莫唑胺藥物組、TMZ+陰性對照組、TMZ+AKT2干擾組裸鼠瘤體凋亡指數(shù)分別為：7.15%±1.04%、25.26%±2.71%、26.63%±3.46%、42.81%±5.97%。TMZ+AKT2干擾組其腫瘤凋亡情況明顯高于空白對照組、替莫唑胺化療組和TMZ+陰性對照組，有顯著性差異(Plt;0.05)。

圖1 藥物干預(yù)后裸鼠瘤體的變化

Fig 1 Growth of implanted tumor cells was monitored by tumor volume

A: Blank control groups; B: TMZ groups; C: TMZ+Negative control groups; D: TMZ+AKT2-shRNA groups.

圖2 瘤體體積增長曲線變化圖

Fig 2 The changes of tumor volume

aPlt;0.05,vscontrol groups.

圖3 TUNEL檢測各組細胞凋亡情況

Fig 3 The apoptosis of each groups detected by TUNEL

A: Blank control groups; B: TMZ groups; C: TMZ+Negative control groups; D: TMZ +AKT2-shRNA groups.

GroupsTumormass(g)Tumorvolume(mm3)Inhibitionrate(%)Apoptosisindex(%) Blankcontrolgroups1．25±0．26669．34±98．737．15±1．04 TMZgroups0．72±0．11399．86±55．2641．72±0．7125．26±2．71 TMZ+Negativecontrol0．69±0．07383．81±34．0144．67±2．8226．63±3．46 TMZ+AKT2?shRNA0．52±0．07a297．72±41．49a58．14±3．13a42．81±5．97a

aPlt;0.05,vsControl groups.

討 論

人腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤，發(fā)病率在所有腦瘤中達到70%以上[1]。膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma, GBM)，是一種高度惡性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，是人類最具有侵襲性的腫瘤之一，在WHO腫瘤臨床分級中定為IV級，其惡性級別最高。新一代烷化劑替莫唑胺是目前對腦瘤GBM的標準化療藥物，在GBM的化療治療中發(fā)揮著重要作用[2～4]。并已被證明有著良好的臨床治療效果。但由于傳統(tǒng)的手術(shù)治療，及術(shù)后的化療和放療仍存在很大的局限性，所以GBM患者的中位生存時間只有14.6個月左右[5]。當(dāng)下研究并尋求針對膠質(zhì)瘤更好的治療策略改善提高患者生活質(zhì)量并延長患者生存時間顯得尤為重要。

有研究表明AKT2基因在腦膠質(zhì)瘤細胞生長、增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等多個方面起著很重要的作用[6,7]。同時，還有研究研究報告AKT2基因的表達程度和膠質(zhì)瘤惡性程度正相關(guān)，并且與患者的生存時間呈負相關(guān)性[8]。近年來有研究者實驗發(fā)現(xiàn)，AKT活化可能參與腫瘤放射治療的抵抗，研究結(jié)果表明AKT似乎是一個有效的克服膠質(zhì)瘤治療抵抗重要靶標[9]。在過去的幾十年里，不斷研究PI3K/AKT信號通路和參與在膠質(zhì)瘤和其他癌癥過程中的各種生物制劑，許多PI3K抑制劑已被開發(fā)。他們中的一部分已經(jīng)被用來探索克服癌細胞的抗放療和化療能力。

本部分實驗中，我們通過TUNEL實驗觀察到TMZ化療+AKT2-shRNA干擾組較其他組相比，裸鼠膠質(zhì)瘤瘤體體積、瘤體質(zhì)量指標、腫瘤抑制率和凋亡指數(shù)都發(fā)生了相應(yīng)的變化。實驗結(jié)果可以看出替莫唑胺藥物化療聯(lián)合轉(zhuǎn)染AKT2-shRNA與單純替莫唑胺化療相比可進一步減緩腫瘤的生長增殖速度并能促進腫瘤凋亡，因而在一定程度上提高了替莫唑胺化療的敏感性，部分的克服了U251細胞對替莫唑胺的化療耐藥。

本研究只是為將來臨床上膠質(zhì)瘤患者替莫唑胺化療提供了一個新的思路，實驗研究中AKT2表達下調(diào)的程度仍遠未達到神經(jīng)外科臨床的標準，這可能與轉(zhuǎn)染慢病毒載體半衰期短、轉(zhuǎn)染進入裸鼠移植瘤和腫瘤細胞的不均一性等原因有關(guān)。還有慢病毒轉(zhuǎn)染到患者身上的毒副作用等因素。這些實驗研究要真正投入到神經(jīng)外科臨床應(yīng)用可能還有很多事情要去做。

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AKT2-shRNAaffectsthesensitivityofhumangliomacelllineU251xenograftinnudemicetoTMZ

CUIYong1,ZHANGFenglin1,BAOJing1,YINGQi1,HUGuohan2,LUOChun2,LUYicheng2

1DepartmentofNeurosurgery, 411HospitalofPLA,Shanghai200081;2DepartmentofNeurosurgery,ChangzhengHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200003, China

ObjectiveThe effects of the expression of AKT2 on sensitivity of glioma cell line U251 to Temozolomide (TMZ) are discussed.MethodsU251 cell implanted tumor model in nude mice was established. By the intratumoral injection and intraperitoneal administration, the nude mice tumor was treated with TMZ chemotherapy drugs and AKT2-shRNA expression vector. The nude mice tumor accumulation conditions were observed. DNA in situ end labeling method (TUNEL) was used to analyze the apoptosis of tumor cells in each group.ResultsIn the blank control group, TMZ chemotherapy group, TMZ+ negative control group, and TMZ+AKT2 interference group, nude mice tumor volume were (669.34±98.73)mm3, (399.86±55.26)mm3, (383.81±34.01)mm3, (297.72±41.49)mm3, respectively; tumor weight were (1.25±0.26)g, (0.72±0.11)g, (0.69±0.07)g, (0.52±0.07)g, respectively. In TMZ+AKT2 interference group, the tumor volume and tumor weight were significantly less than those of the blank control group and negative control group, and there was significant difference (Plt;0.05). TUNEL experimental results showed that in blank control group, TMZ chemotherapy group, the TMZ+negative control group, TMZ+AKT2 interference body apoptosis index group of tumor were (7.15±1.04)%, (25.26±2.71)%, (26.63±3.46)%, (42.81±5.97)%, respectively. In TMZ+AKT2 interference group the apoptosis was significantly higher than that of the blank control group and negative control group, and there was significant difference (Plt;0.05).ConclusionRNA interference of AKT2 can significantly improve the sensitivity of glioma chemotherapy to TMZ.

AKT2; Glioblastoma; TMZ

1671-2897(2016)15-393-04

R 739

A

國家自然科學(xué)基金資助項目(30930094)

崔勇，主治醫(yī)師，博士，E-mail: ben_cuiyong@126.com

*通訊作者： 應(yīng)奇，副主任醫(yī)師， E-mail: yingqi411@126.com

2016-01-30；

2016-04-05)