雌激素受體及多巴胺受體在泌乳素腺瘤的表達

董家軍 彭逸龍 王海清 鐘鳴谷 伍益

(江門市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 江門 529030)

·腦腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究·

雌激素受體及多巴胺受體在泌乳素腺瘤的表達

董家軍*彭逸龍 王海清 鐘鳴谷 伍益

(江門市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 江門 529030)

目的研究雌激素受體(ESR)及其亞型mRNA、多巴胺受體(D2R)及其亞型mRNA在泌乳素腺瘤中的表達。方法應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)測定30例泌乳素腺瘤標本ESR1mRNA、ESR2mRNA、第五外顯子缺失的1型雌激素受體(△5-Del-ESRl mRNA)及D2RmRNA的表達，研究其表達水平與患者性別、腫瘤體積、侵襲性及泌乳素(PRL)水平的關(guān)系。結(jié)果男性和絕經(jīng)后女性患者腫瘤ESR1 mRNA表達高于育齡女性患者；侵襲性泌乳素腺瘤高于非侵襲性腫瘤；PRL≥1 000 ng/ml的患者△5-Del-ESRl mRNA表達水平較PRLlt;1 000 ng/ml的患者明顯增高。D2RmRNA異構(gòu)體的表達水平與泌乳素腺瘤生物學(xué)行為有關(guān)系，D2SmRNA的表達水平在侵襲性與非侵襲性泌乳素腺瘤中存在顯著差異，D2SmRNA在侵襲性泌乳素腺瘤中呈低水平表達。結(jié)論ESR1及其亞型△5-Del-ESRl mRNA、D2R及其亞型mRNA表達與泌乳素腺瘤PRL分泌及腫瘤侵襲有關(guān)。

雌激素受體; 多巴胺受體受體; 第五外顯子缺失的1型雌激素受體; 泌乳素腺瘤

泌乳素腺瘤是最常見的功能性垂體腺瘤，約占所有功能性垂體腺瘤的40%～60%，亦是唯一首選為藥物治療的垂體瘤。但其發(fā)生、發(fā)展的確切機制仍不甚明了，目前大量研究證實雌激素受體及其亞型、多巴胺受體及其亞型在其中起著重要的作用[1,2]。本課題旨在揭示雌激素受體、多巴胺受體在泌乳素瘤發(fā)生、發(fā)展中的地位和作用并探討其可能的機制。

材料與方法

一、臨床資料

30例泌乳素瘤標本取自2010年1月至2015年6月間江門市中心醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除標本。標本切除后30 min內(nèi)分塊置于液氮罐內(nèi)冷凍貯存。所有垂體瘤標本均經(jīng)常規(guī)病理及免疫組化檢查確診為泌乳素腺瘤(江門市中心醫(yī)院病理科協(xié)助完成)。30例泌乳素瘤患者中，男性l0例，絕經(jīng)后女性5例，育齡女性15例；年齡25～65歲，平均(37.6±9.8)歲；泌乳素(prolactin, PRL)水平210～560 ng/ml，平均1 103.25 ng/ml；微腺瘤1例，大腺瘤21例，巨大腺瘤8例；Knosp分級≥2者18例(垂體腫瘤侵襲海綿竇為侵襲性垂體)，lt;2者12例。

二、主要試劑

Trizol Reagent購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄酶、RT-PCR預(yù)混液、1型雌激素受體，(estrogen receptor type1, ESRl)、 2型雌激素受體，(estrogen receptor type 2, ESR2)、內(nèi)參基因β-actin引物和探針均購自ABI公司；△5-Del-ESRl mRNA (第五外顯子缺失的1型雌激素受體，5th Exon deleted estrogen receptor type 1)引物和探針由ABI公司設(shè)計、合成并檢測、優(yōu)化(表1)。采用ABl7500系統(tǒng)進行RT-PCR反應(yīng)。

表1 ABI公司設(shè)計合成的基因引物和探針及其參考序列
Tab 1 Synthetic gene primers and probe and the reference sequence designed by ABI company

GenePrimerandprobeReferencesequenceName ESR1Hs01046815＿mlNM＿000125．2Estrogenreceptortype1 ESR2Hs00230957＿mlNM＿001040275．1Estrogenreceptortype2 D2RLHs01024460＿mlNM＿00795．2DopaminergicD2receptorlongisoform D2RSHs01014210＿mlNM＿016574．2DopaminergicD2receptorshortisoform

Δ5-Del- ESR1 Forward:5'ACATGATCAACTGGCGAAGA3'; 5th Exon Deleted Estrogen ReceptorType1; Reverse: 5'ACCATGCCCTCTACACA TTTTCC3'; Probe: FAM5CTGGTTCCTGGCACC 3NRQ

三、方法

Trizol法提取總RNA，其步驟按照Invitrogen公司提供的商品說明書進行。用分光光度計測定其濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系為50 μl，其中RNA樣本25 μl，緩沖液5 μl，隨機引物5 μl，dNTP 2 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶2.5 μl，RNA酶抑制劑2.5 μl，焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate, DEPC)水8 μl。反應(yīng)條件：25℃ l0 min，37℃ 120 min，85℃ 5 min，上機反應(yīng)后冰上冷卻，得到cDNA溶液。然后進行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μl，其中預(yù)混液12.5 μl，探針、引物1.25 μl，cDNA模板1 μl，DEPC水10.25 μl。反應(yīng)條件：95℃，15 S；60℃，1 min (40個循環(huán))。引物中G-C含量均滿足通常要求，其相應(yīng)PCR產(chǎn)物均為相應(yīng)基因的外顯子片段，從而保證其檢測到的PCR產(chǎn)物是來自RNA模板，排除基因組DNA污染造成的假陽性。所有基因均設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)三次實驗，用來估計批內(nèi)差異。不同樣品間基因表達的差異采用ABI公司推薦的相對定量方法進行計算，通過ABI7500系統(tǒng)中相對定量分析軟件，分析所得到的結(jié)果。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

所有計量數(shù)據(jù)均以(均數(shù)±標準差)表示。采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，采用獨立樣本t檢驗和方差分析比較各組的均數(shù)，逐步回歸法分析各基因表達的相關(guān)性。Plt;0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、ESR mRNA 的表達

ESR1 mRNA在所有泌乳素腺瘤患者中均有表達。 ESR2 mRNA亦在泌乳素腺瘤中檢測到表達，表達水平為ESR1mRNA的1.5%左右。ESR2 mRNA表達水平與PRL水平、腫瘤體積及腫瘤侵襲性均無相關(guān)。

二、ESR1mRNA表達與性別的關(guān)系

本組男性和絕經(jīng)后女性21例，育齡女性9例， 前者ESR1mRNA表達高于育齡女性患者組(P=0.008)。

三、ESR1 mRNA表達與PRL水平的關(guān)系

ESR1mRNA表達水平與PRL的對數(shù)值(Log PRL)呈正相關(guān)，線性方程為LogPRL=0.426 ESRl mRNA+1.853，R2=0.528。

四、ESRl mRNA表達與腫瘤體積及侵襲的關(guān)系

ESR1mRNA表達水平與腫瘤體積相關(guān)(Plt;0.05)，但巨大腺瘤組患者ESR1 mRNA表達水平與大腺瘤組無明顯差異，(Pgt;0.05)。侵襲性垂體瘤(Knosp分級≥2)ESRlmRNA表達高于非侵襲性垂體瘤( Knosp分級lt;2)，(Plt;0.05)。

五、△5-Del-ESRl mRNA表達

所有泌乳素腺瘤中均檢測到△5-Del-ESRl mRNA的表達，表達水平為ESRl的3.5%±0.6%。男性患者與女性患者表達水平無明顯差異。△5-Del-ESRl mRNA在PRL≥1 000 ng/ml的患者較PRLlt;1 000 ng/ml的患者中表達水平明顯增高(Plt;0.05)。△5-Del-ESRl mRNA與腫瘤體積無相關(guān)(Pgt;0.05)。△5-Del-ESRl mRNA的比值男女性患者無差異(Pgt;0.05)。

六、D2RS mRNA和D2RL mRNA表達

在所有泌乳素腺瘤患者中均有表達。D2RmRNA異構(gòu)體的表達水平與垂體PRL腺瘤生物學(xué)行為有關(guān)，D2SmRNA的表達水平在侵襲性與非侵襲性泌乳素腺瘤中存在顯著差異(Plt;0.05)，D2SmRNA在侵襲性PRL腺瘤中呈低水平表達。

討 論

ESR包括兩種亞型ESRl和ESR2，本次研究發(fā)現(xiàn)泌乳素腺瘤中ESR2 mRNA的表達水平僅為ESRl的1.5%，與性別、PRL水平、腫瘤體積無相關(guān)性，提示ESR2在泌乳素腺瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中作用不大。ESRl在垂體腺瘤中高表達，提示ESR1對泌乳素腺瘤的發(fā)生、發(fā)展起主導(dǎo)作用。

本次研究中發(fā)現(xiàn)侵襲性泌乳素腺瘤ESR1 mRNA表達水平高于非侵襲性腺瘤，提示ESRl參與腫瘤侵襲。其部分機制依賴于ESRl可以促進垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因(pituitary tumor transforming gene, PTTG)和 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表達[3]。PTTG可抑制染色單體的分離，影響腫瘤基因組的整倍性，并促堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, b-FGF)的分泌，調(diào)節(jié)腫瘤血管形成、腫瘤轉(zhuǎn)化和發(fā)展，促進PRL的合成和分泌。VEGF的高表達則可以誘導(dǎo)異常血管的形成，提高腫瘤侵襲性。

關(guān)于“在雌激素水平低下的男性和絕經(jīng)后女性會發(fā)生泌乳素腺瘤，且多為大腺瘤”的現(xiàn)象，一直頗有爭議[4,5]。本實驗中觀察到男性和絕經(jīng)后女性患者組ESR1 mRNA表達高于育齡女性患者組，這較好的解釋了上述問題。

有研究證實△5-Del-ESRl mRNA在泌乳素瘤中的表達，△5-Del-ESRl mRNA蛋白缺乏配體結(jié)合域，保留了AF-1激活域和DNA綁定結(jié)合域，能夠不依賴于雌激素持續(xù)激活靶基因轉(zhuǎn)錄[6]。一些研究表明在子宮內(nèi)膜癌中△5-Del-ESRl mRNA的表達也較正常內(nèi)皮細胞升高[7]。本次實驗中觀察到△5-Del-ESRl mRNA在所有泌乳素腺瘤中表達，PRL≥1 000 ng/ml的患者較PRLlt;1 000 ng/ml的患者表達水平明顯增高，表明該型變異體參與泌乳素瘤PBL分泌的調(diào)控，其調(diào)控泌乳素瘤作用還需進一步的研究。

多巴胺能受體D2基因(dopaminergic receptor-D2gene)染色體上位點位于11q23。D2R有2種亞型即長受體D2RL(long)和短受體D2RS(short)，該受體由87bp外顯子的選擇性剪接所形成，其區(qū)別在于第三個胞質(zhì)環(huán)是否多出了29個氨基酸殘基[8,9]。

本實驗證實：D2R在所有泌乳素腺瘤患者中均有表達。D2RmRNA異構(gòu)體的表達水平與垂體PRL腺瘤生物學(xué)行為有關(guān)，D2SmRNA的表達水平在侵襲性與非侵襲性PRL腺瘤中存在顯著差異，D2SmRNA在侵襲性PRL腺瘤中呈低水平表達。雌激素還通過抑制下丘腦分泌多巴胺并下調(diào)D2R受體的表達，促進PRL的分泌，有研究證明溴隱亭治療無效的泌乳素瘤患者腫瘤中常有較高的ESR mRNA表達。D2R基因低表達及mRNA交替剪接修飾致多巴胺D2受體水平下降，D2S受體亞性表達下降尤為明顯，致D2受體兩個異構(gòu)體D2S/D2L比值下降，進而導(dǎo)致垂體PRL腺瘤對溴隱亭的耐藥性。此外。Kelly等證實D2R基因缺失的大鼠的PRL細胞增殖明顯且具有較強的侵襲性。也有文獻證實發(fā)現(xiàn)D2SmRNA在侵襲性PRL腺瘤中呈低水平表達，并認為這一差異致使侵襲性PRL腺瘤較非侵襲性PRL腺瘤更易對多巴胺受體激動劑耐藥。

本次研究發(fā)現(xiàn)ESR1及其亞型△5-Del-ESRl mRNA、D2R及其亞型mRNA表達與泌乳素腺瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但其具體機制還需進一步的研究。

1Ezzat S, Asa SL, Couldwell WT, et a1. The prevalence of pituitary adenomas: a systematic review [J]. Cancer, 2004, 101(3): 613-619.

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3McCabe CJ, Boelaert K, Tannahill LA, et al. Vascular endothelial growth factor, its receptor KDR/FLK-1,and pituitary tumor transforming gene in pituitary tumors [J]. J Clin Endocrinol Metab, 2002, 87(9): 4238-4244.

4Zafar M, Ezzat S, Ramyar L, et al. Cell-specific expression of estrogen receptor in the human pituitary and its adenomas [J]. J Clin Endocrinal Metab, 1995, 80(12): 3621-3627.

5Donangelo I, Melmed S. Implication of pituitary tropic status on tumor development [J]. Front Horm Res, 2006, 35(1): 1-8.

6Fuqua SA, Fitzgerald SD, Chamness GC, et al. Variant human breast tumor estrogen receptor with constitutive transcriptional activity [J]. Cancer Res, 1991, 51(1): 105-109.

7Horvath G, Leser G, Hahlin M, et al. Exon deletions and variants of human estrogen receptor mRNA in endometrial hyperplasia and adenocarcinoma [J]. Int J Cynecol Cancer, 2000, 10(2): 128-136.

8Vangveravong S, McElveen E, Taylor M, et al. Synthesis and characterization of selective dopamine D2 receptor antagonists [J]. Bioorg Med Chem, 2006, 14(3): 815-825.

9Lan H, Durand CJ, Teeter MM, et al. Structural determinants of pharmacological specificity between D1 and D2 dopamine receptors [J]. Mol Pharmacol, 2006, 69(1): 185-194.

mRNAexpressionofestrogenreceptoranddopaminereceptorwiththeirsubtypesinprolactionoms

DONGJiajun,PENGYilong,WANGHaiqing,ZHONGMinggu,WUYi

DepartmentofNeurosurgery,CentralHospitalofJiangmenCity,Jiangmen529030, China

ObjectiveThe mRNA expressions of estrogen receptor (ESR) and dopamine receptor (D2R) with their subtypes in prolactionoms are discussed.MethodsThe mRNA expressions of ESR and D2R with their subtypes in 30 prolactionoms samples was detected with reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) to study the relationship between sex, tumor volume, invasion and PRL level and the its expression.ResultsESRl mRNA had a higher expression in male and postmenopausal female patients than those in fertile female and its level of invasive prolactionoms were higher than that of noninvasive tumors．The ESRl mRNA level and the log PRL level had a linear regression. However, the correlation between the mRNA expression of ESR2 and sex, PRL level, tumor volume and tumor invasion in prolactionoms had no statistical significance. △5-Del-ESRl mRNAl levels in patients with PRL≥1 000 ng/ml were higher than those with PRLlt;1 000 ng/ml. The expression of D2RmRNA isomers was associated with biological behavior of pituitary adenomas. The expression of D2SmRNA be of significant differences in invasive and non-invasive PRL adenomas. D2SmRNA was expressed at low levels in invasive PRL adenomas.ConclusionThe expressions of ESRl, △5-Del-ESRl and D2R correlated with PRL secretion and tumor invasion in prolactionoms. However, the mechanism need for more researches.

Estrogen receptor; Dopamine receptor; 5th Exon deleted estrogen receptor type 1; Prolactionoms

1671-2897(2016)15-009-03

R 736.4

A

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項目(A2012725)

董家軍，主任醫(yī)師，博士后，E-mail: dongjiajun408@126.com

*通訊作者：董家軍，主任醫(yī)師，博士后，E-mail: dongjiajun408@126.com

2015-08-12；

2015-10-30)