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    熒光標(biāo)記pH敏感膠束的制備及其藥物控釋

    2016-11-22 09:49:26郝偉舉張俊琪尚亞卓徐首紅劉洪來
    物理化學(xué)學(xué)報(bào) 2016年10期
    關(guān)鍵詞:質(zhì)子化粒徑熒光

    郝偉舉 張俊琪 尚亞卓 徐首紅,* 劉洪來

    (1華東理工大學(xué)化學(xué)系,化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200237;2復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,上海200032)

    熒光標(biāo)記pH敏感膠束的制備及其藥物控釋

    郝偉舉1張俊琪2尚亞卓1徐首紅1,*劉洪來1

    (1華東理工大學(xué)化學(xué)系,化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200237;2復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,上海200032)

    利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合方法(ATRP)合成了pH敏感的兩親性嵌段共聚物mPEG-b-PDPAn(聚合度n=100-200)及熒光修飾的嵌段聚合物異硫氰酸熒光素-聚乙二醇-聚N,N-二異丙胺基甲基丙烯酸乙酯(FITCPEG45-PDPA100)。采用溶劑揮發(fā)的方法制備膠束,此膠束呈現(xiàn)均一的球形分布,平均粒徑180-240 nm(0.3 mg·mL-1)。以阿霉素(DOX)為模擬藥物,其膠束載藥量約11%(w,質(zhì)量分?jǐn)?shù))左右,外環(huán)境pH對(duì)載藥膠束的粒徑和體外釋放行為有顯著影響。在弱酸環(huán)境下,膠束核質(zhì)子化發(fā)生膨脹甚至解體,在2-3 h內(nèi)藥物可釋放80%左右。體外毒性試驗(yàn)表明,空白膠束與人類肝癌細(xì)胞(Huh7)有良好的生物相容性。同時(shí),與此細(xì)胞共同孵育5 h的熒光聚合物膠束體現(xiàn)了較好的轉(zhuǎn)染效果。因此,這類熒光標(biāo)記膠束可能會(huì)為實(shí)時(shí)跟蹤化療藥物的輸送或分布打開新的視角。

    pH敏感聚合物;自組裝膠束;靶向運(yùn)輸;可控釋藥

    1引言

    嵌段聚合物膠束是由兩親性聚合物在水溶液中自組裝形成,內(nèi)核為疏水區(qū),通過疏水作用力可包載疏水性藥物,外圍的親水性嵌段可增加藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性,延長藥物的血液循環(huán)時(shí)間1。聚合物膠束由于具有適宜的粒徑,穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì),在高通透性及滯留效應(yīng)(EPR)的作用下可被動(dòng)靶向到腫瘤部位以減少抗腫瘤藥對(duì)正常細(xì)胞的不良反應(yīng)2。由于傳統(tǒng)載藥體系存在著諸多缺點(diǎn),例如被細(xì)胞吞噬攝入后,藥物釋放緩慢難以在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到有效濃度等。因而,近年來具有特殊功能響應(yīng)型聚合物應(yīng)運(yùn)而生,如溫度3、pH4、超聲5及酶敏感6材料。這些特殊功能的嵌段聚合物構(gòu)成的載藥體系,受到相應(yīng)的環(huán)境刺激,實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)定時(shí)的藥物釋放。研究發(fā)現(xiàn)人體正常血液循環(huán)及組織的pH約為7.47,而腫瘤區(qū)域由于其代謝旺盛,處在缺氧環(huán)境中,有過多的乳酸代謝物產(chǎn)生,使腫瘤組織微環(huán)境呈弱酸性(pH 6.5)8,此外,細(xì)胞內(nèi)涵體的基質(zhì)環(huán)境pH值約為5.5-6.09,當(dāng)內(nèi)涵體逐漸變成溶酶體的過程中,其pH值更低,約為4.5-5.010,介于這些組織或生理環(huán)境在pH上的差異,具有pH敏感的釋藥體系以特有的性質(zhì)占據(jù)著優(yōu)勢11。

    本文以此為出發(fā)點(diǎn),合成了具有熒光示蹤12及pH敏感雙重功能的嵌段聚合物FITC-PEG45-PDPAn、mPEG45-PDPAn,聚合物通過自組裝形成膠束,其疏水內(nèi)核可以包載疏水性藥物,并隨著人體微環(huán)境pH的變化完成藥物定向釋放,實(shí)驗(yàn)中用人類肝癌細(xì)胞(Huh7細(xì)胞)作為細(xì)胞株,研究了膠束本身的藥理毒性和膠束熒光跟蹤效果13。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備

    甲基丙烯酸二異丙胺基乙酯(DPA,98%,Sigma-Aldrich公司),聚乙二醇單甲醚2000(mPEG45,95%,Sigma-Aldrich公司),異硫氰酸熒光素的聚乙二醇(FITC-PEG45,90%,西安瑞禧生物科技有限公司),2-溴代異丁酰溴(98%,Sigma-Aldrich公司);N,N,N-N,N″-五甲基二亞乙基三胺(PMDETA,99%,TCI公司);CuBr(AR,經(jīng)冰醋酸、乙醇洗滌三次,90%,干燥后待用,上海蓮花有限公司);芘(99%,Sigma-Aldrich公司),鹽酸型阿霉素(DOX·HCl,98%,J&KCHEMICA公司);四氫呋喃(THF,99.5%,AR,上海泰坦有限公司);甲醇(99.5%,AR,上海泰坦有限公司);二氯甲烷(99.5%,AR,使用前經(jīng)氫化鈣處理,上海泰坦有限公司);中性三氧化二鋁(200-300目,上海蓮花有限公司)。人類肝癌細(xì)胞株(Huh7細(xì)胞,美國菌種保藏ATCC),細(xì)胞毒性試劑盒(CCK-8,上海碧云天有限公司)、無血清培養(yǎng)基、10%牛胎兒血清培養(yǎng)基均購置于上海生物科技有限公司。

    動(dòng)態(tài)光散射(DLS,Zem4228,馬爾文,日本島津公司,日本),紫外-可見分光光度計(jì)(UV-2450,日本島津公司,日本);熒光分光光度計(jì)(F-4500,日本島津公司,日本);凝膠滲透色譜儀(GPC,PL-GPC50,費(fèi)爾伯恩精密公司,中國);透射電子顯微鏡(TEM-1400,日本);核磁共振(1H NMR,Bruker-400MH,德國)測定;倒置顯微鏡及熒光顯微鏡(EVOS.AMG,美國);微孔板分光光度計(jì)(ELX800 Biotek,美國)。

    2.2大分子引發(fā)劑mPEG-Br及FITC-PEG-Br的合成

    向干燥的單口燒瓶中加入聚乙二醇單甲醚(mPEG45,2 g,1 mmol),用25 mL干燥的甲苯溶解,加入三乙胺(TEA,200 μL,1.44 mmol),在冰鹽浴的環(huán)境下緩慢滴加2-溴異丁酰溴(185 μL,1.5 mmol),反應(yīng)體系持續(xù)劇烈攪拌,室溫環(huán)境氮?dú)獗Wo(hù)反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后旋蒸,在冷乙醚中沉淀,真空干燥,得到淡黃色固體。產(chǎn)物質(zhì)量1.82 g,有1H NMR確定其轉(zhuǎn)化率為93%。該產(chǎn)物為CH3OPEG45-Br,具有熒光的FITC-PEG45-OH以同樣的方法制備出大分子引發(fā)劑FITC-PEG45-Br。

    2.3聚合物mPEG45-PDPAn及FITC-PEG45-PDPAn的制備

    通過ATRP聚合的方法接枝聚合物14,15,以制備mPEG45-PDPA100為例,其物質(zhì)摩爾量為n,n(DPA):n(mPEG45-Br):n(CuBr):n(PMDETA)= 100:1:1:1.1,取引發(fā)劑mPEG45-Br 0.5 g放入Schlenk裝置,通氮?dú)馀叛?,在氮?dú)獾谋Wo(hù)下,取單體DPA 6 mL;干燥四氫呋喃12 mL,取PMDETA 50 μL注入Schlenk裝置,經(jīng)三次液氮冷凍-抽真空-溶解,在冷凍條件下加入催化劑CuBr 0.0326 g,在40°C的環(huán)境下反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液加入四氫呋喃稀釋,終止反應(yīng),過中性Al2O3的分離柱除去CuBr催化劑。旋蒸THF并在冷凍甲醇(除雜質(zhì)及未反應(yīng)的單體)中沉降。得到粘稠的聚合物,進(jìn)一步干燥,得到白色固體,通過1H NMR (400 Hz,CCl3D)及GPC(THF為流出液)檢測其純度。

    2.4嵌段聚合物的物化性質(zhì)表征

    嵌段聚合物的pH敏感性及熒光性能主要通過DLS、UV-2450及熒光光度計(jì)來進(jìn)行表征。配置嵌段聚合物濃度為0.1 mg·mL-1的酸性溶液(pH 3.0左右),逐滴滴加氫氧化鈉(1 mol·L-1)溶液,通過DLS檢測其溶液體系的粒徑及電位變化,同時(shí)通過UV-2450表征溶液的透過率隨pH的變化。臨界膠束濃度16(CMC)是聚合物形成膠束的重要參數(shù),本實(shí)驗(yàn)通過配置1×10-6mol·L-1的芘溶液作為熒光探針,通過熒光在372與383 nm的強(qiáng)度比值與聚合物溶液的濃度對(duì)數(shù),來測出嵌段聚合物的CMC。

    2.5制備聚合物膠束

    本實(shí)驗(yàn)主要通過溶劑揮發(fā)的方法制備聚合物膠束17。方法如下:(1)空白膠束的制備。配置6 mg·mL-1的聚合物THF溶液5 mL作為母液,取其100 μL,逐滴加入2 mL的pH 7.4的磷酸緩沖液(PBS,1 mmol·L-1),攪拌12 h至THF揮發(fā)完全;(2)對(duì)于載藥的聚合物膠束的制備,使用相同的方法稱取DOX·HCl 10 mg溶于100 μL的THF母液,加入50 μLTEA使親水性DOX·HCl變?yōu)槭杷缘腄OX,逐滴加入2 mL的pH 7.4的PBS(1 mmol· L-1)緩沖液,使用3500 g·mol-1的透析袋除去為被包裹的DOX。聚合物膠束的粒徑及帶電量通過DLS表征,通過檢測0.3 mg·mL-1的上述濃度溶液,其形貌通過TEM表征,銅網(wǎng)作為負(fù)載體,磷鎢酸(1%,質(zhì)量分?jǐn)?shù))作為負(fù)染液。

    2.6膠束的載藥及釋藥研究

    膠束的載藥量(DLC)及包封率(DEE)通過UV-2450在485 nm處的吸收峰進(jìn)行檢測18,其DLC和DEE通過以下公式可以計(jì)算:

    其中m1為包載藥物的質(zhì)量(mg);m2為總膠束質(zhì)量(mg);m3為總藥質(zhì)量(mg);

    膠束的釋藥性能主要考察不同pH環(huán)境下DOX累積釋放速率,分別考察其12 h聚合物膠束在pH 3.0、pH 5.0、pH 7.4、pH 9.2累積釋藥量。其中累積釋放效率(η)為:

    其中A1為累積紫外吸收強(qiáng)度,A2為膠束包載的總DOX的強(qiáng)度。

    2.7聚合物膠束的毒性試驗(yàn)

    采用Cell Counting Kit(CCK-8)法進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)19,接種Huh7細(xì)胞于96孔板中(1×104/孔),于37°C,5%(φ,體積分?jǐn)?shù))CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后分別加入無血清的聚合物膠束,其膠束的濃度為0、10、50、100和200 μg·mL-1。孵育24 h后,用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3次,每孔滴加10 μL的CCK-8檢測液,于37°C孵育30 min后,通過微孔板分光光度計(jì)測量吸光值。

    2.8熒光聚合物膠束的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)

    采用類似培養(yǎng)細(xì)胞的方法20,接種Huh7細(xì)胞于24孔板(2×104/孔),培養(yǎng)24 h后,分別加入具有熒光功能的混合聚合物mPEG45-PDPA100與FITCPEG45-PDPA100(摩爾比為1:1)膠束(0,100和200 μg·mL-1)與Huh7細(xì)胞進(jìn)行孵育,5 h后吸除熒光的聚合物膠束,通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況。

    3 結(jié)果與討論

    3.1聚合物的合成及表征

    實(shí)驗(yàn)中嵌段聚合物的制備見示意圖1所示,有mPEG45-OH及FITC-PEG45-OH與二溴異丁酰溴進(jìn)行酯化合成出大分子引發(fā)劑,進(jìn)而與單體DPA進(jìn)行ATRP聚合,合成出不同鏈長的嵌段聚合物mPEG45-PDPAn及具有熒光標(biāo)記的嵌段聚合物FITCPEG45-PDPA100。

    示意圖1 嵌段聚合物的合成流程圖Scheme 1 Synthesis route of polymer

    合成的嵌段聚合物的分子結(jié)構(gòu)用1H NMR進(jìn)行表征,結(jié)果如圖1所示,(a)為聚合物mPEG45-Br,mPEG45-PDPA100及FITC-PEG45-Br,F(xiàn)ITC-PEG45-PDPA100的1H NMR譜圖。圖1(a)(1,2)中1.8位移處(e)為PEG-Br鏈段中丙交酯的甲基(―CH3),3.66位移處是PEG嵌段上的CH2―CH2O―基團(tuán);圖1a(2)中1.12處(k)為聚合物PDPA鏈段中氨基處的4個(gè)(―CH3),常被看作PDPA的特征峰。圖1a(3,4)為標(biāo)記了熒光物質(zhì)的FITC-PEG45-Br及嵌段聚合物FITC-PEG45-PDPAn的1H NMR譜圖,與上面兩個(gè)譜圖相比,在3.66位移處有FITC-PEG45上的―CH2―基團(tuán),同時(shí)在化學(xué)位移5.35處,有熒光物質(zhì)FITC的特征峰,通過核磁圖譜的結(jié)果可以確定所設(shè)計(jì)的嵌段聚合物已經(jīng)得到。

    嵌段聚合物的相對(duì)分子量通過GPC進(jìn)行測量,結(jié)果如圖1(b)所示:相對(duì)分子量越大,則GPC檢測出的流出時(shí)間就越短21,單峰型則證明嵌段聚合物中沒有雜質(zhì)。由圖可知,隨著PDPA嵌段的增加,分子量相應(yīng)地增大,而熒光基團(tuán)的分子量相對(duì)于聚合物的分子量幾乎可以忽略。通過GPC數(shù)據(jù)分析,得到三個(gè)聚合物的分子量依次為21567 g· mol-1(mPEG45-PDPA100),27742 g·mol-1(mPEG45-PDPA150)和37236 g·mol-1(mPEG45-PDPA200),其PDI(多分散指數(shù),Polydispersity Index)值分別為1.19、1.22和1.22,表明分子量有較窄的分布,F(xiàn)ITC-PEG45-PDPA100嵌段聚合物的GPC分子量為23060 g·mol-1,其PDI為1.56。嵌段聚合物的pH敏感點(diǎn)則通過聚合物在不同pH環(huán)境下的粒徑變化來檢測,如圖1(c)所示,在強(qiáng)酸性環(huán)境下即pH 3.0左右,各嵌段聚合物都較好地溶解在水溶液中,隨著pH值上升,在pH 6.0-7.0之間,由于PDPA嵌段逐步脫質(zhì)子化,由親水性轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷裕沟镁酆衔锍尸F(xiàn)兩親性而發(fā)生自組裝形成膠束顆粒,如圖1(c)在pH 6.0-7.0之間,各聚合物粒徑發(fā)生突增,證明嵌段聚合物有較好的pH敏感性,pH敏感點(diǎn)隨著PDPA嵌段的聚合度的增加略有上升,從圖上判斷大約從pH 6.0變?yōu)閜H 6.7。

    圖1 (a)聚合物(1)PEG-Br、(2)PEG-PDPA、(3)FITC-PEG-Br、(4)FITC-PEG-PDPA的核磁共振圖譜;(b)嵌段聚合物的GPC流出圖;(c)嵌段聚合物在不同pH環(huán)境下的尺寸變化Fig.1 (a)1H nuclear magnetic resonance(1H NMR)spectra of the polymers(1)PEG-Br,(2)PEG-PDPA, (3)FITC-PEG-Br,and(4)FITC-PEG-PDPA;(b)the gel permeation chromatography(GPC)data of polymers; (c)size changes of the block polymers at different pH values

    3.2膠束的形成及物性表征

    通過溶劑揮發(fā)的方法制備出粒徑均一、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的膠束,其物性如表1所示。由CMC的測定(圖S1(Supporting Information),表1)可確定聚合物自組裝形成所需最低濃度,PDPA嵌段越長,其CMC越小,符合兩親性嵌段聚合物的理論性質(zhì)22。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),在相同濃度下(pH 7.4),PDPA嵌段越長所形成的膠束粒徑反而越小,這可能是因?yàn)檩^長的PDPA疏水作用更強(qiáng),自組裝形成的膠束由于疏水作用收縮得更小。DLS結(jié)果顯示(表1),顆粒的粒徑在180-240 nm(0.3 mg·mL-1)左右,聚合物的濃度上升,顆粒的尺寸略有增加,其PDI值極小表明通過溶劑揮發(fā)的方法可以獲得尺寸均一的膠束,zeta電位結(jié)果顯示,膠束在pH 7.4時(shí),均帶有少量負(fù)電荷,由于各個(gè)嵌段聚合的pH敏感點(diǎn)不同,各自所帶電量略有不同(表1)。mPEG45-PDPA200的電位接近中性,但是由于伸展在膠束外側(cè)的PEG具有極強(qiáng)的親水性,膠束并沒有沉淀的傾向,在一定濃度膠束的條件下可以穩(wěn)定存在5-7天。

    表1 聚合物自組裝形成的膠束的物化性質(zhì)(pH 7.4)Table1 Properties of micelles composed of copolymers by self-assembly(pH 7.4)

    圖2 (a)嵌段聚合物膠束的TEM圖;(b)膠束的粒徑Fig.2 (a)TEM images of polymer micelles;(b)particle sizes of micelles

    圖3 嵌段聚合物膠束在不同pH值下的釋藥動(dòng)力學(xué)Fig.3 Drug release dynamic of micelles at different pH values

    對(duì)聚合物濃度為0.3 mg·mL-1形成的膠束進(jìn)行了TEM形貌表征,由圖2(a)可見,嵌段聚合物膠束呈現(xiàn)出均一的球形,粒徑分布也比較均勻。mPEG45-PDPA100的膠束的平均粒徑約為200 nm,mPEG45-PDPA150及mPEG45-PDPA200膠束的平均粒徑則分別約為180、150 nm左右,和DLS結(jié)果相比略小一點(diǎn)(圖2(b)),這和樣品干燥處理過程有關(guān)。

    3.3膠束的藥物包裹及釋放

    均一的膠束為藥物運(yùn)載提供一個(gè)優(yōu)良的基礎(chǔ)23,我們進(jìn)一步運(yùn)用聚合物膠束進(jìn)行疏水性藥物DOX的包載和運(yùn)輸24,并研究不同的pH環(huán)境下(pH 3.0,5.0,7.4,9.2)的釋放動(dòng)力學(xué)。通過疏水作用力進(jìn)行藥物包裹,膠束的載藥量可以達(dá)到11%(w,質(zhì)量分?jǐn)?shù)),包封率為70%(w,質(zhì)量分?jǐn)?shù))左右。圖3是各個(gè)聚合物形成的膠束的累計(jì)釋藥量曲線,從圖中可以看出,包載藥物的各個(gè)膠束在相同pH環(huán)境中幾乎有著相同的釋藥趨勢,即在堿性環(huán)境(pH 9.2)下,藥物可以穩(wěn)定地被包載在顆粒中,總釋藥率低于5%,而環(huán)境變?yōu)橹行浴⑺嵝院?,藥物釋放量增加,均?-4 h后基本達(dá)到平衡。圖3(a)中,膠束(mPEG45-PDPA100)的pH敏感點(diǎn)在三者中最低,約為pH 6.0,當(dāng)pH從7.4降為5.0時(shí),比起pH敏感點(diǎn)較高的顆粒(mPEG45-PDPA150和mPEG45-PDPA200)其質(zhì)子化速度較慢,到達(dá)質(zhì)子化平衡需更多時(shí)間,導(dǎo)致其釋藥在4 h后才達(dá)到平衡,而圖3(b)和3(c)的膠束的釋藥僅需2 h就達(dá)到平衡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明膠束在弱酸性環(huán)境下,由于聚合物中PDPA嵌段的質(zhì)子化,膠束核逐漸膨脹,促進(jìn)核中藥物釋放。在強(qiáng)酸性環(huán)境pH 3.0中,各個(gè)膠束核PDPA嵌段均迅速地幾乎完全地被質(zhì)子化,膠束核迅速膨脹變疏松,尤其是PDPA嵌段聚合度最短的mPEG45-PDPA100,膠束接近于解體,使得其包裹的藥物幾乎完全釋放,而較長PDPA嵌段的膠束由于之前的自組裝纏繞更緊密,很難完全釋放。可見PDPA嵌段的尺寸可以調(diào)節(jié)膠束釋藥速率和累計(jì)釋放量。

    為了驗(yàn)證膠束中藥物的釋放機(jī)理25,在pH 7.4的環(huán)境中制備膠束,而后使體系的pH降低至pH 5.0。通過1HNMR進(jìn)行表征,在酸環(huán)境下,聚合物PDPA發(fā)生質(zhì)子化,膠束的核逐步溶脹,由圖4可知,在pH 3.0的條件下的1HNMR圖譜中,1 h后其化學(xué)位移為1.2處,出現(xiàn)PDPA嵌段上被質(zhì)子化了的氫的峰,兩親性的嵌段聚合物由于變?yōu)橛H水性而無法自組裝為膠束而接近解體(DLS測到粒徑只有幾個(gè)納米),而在弱酸環(huán)境下即pH 5.0,其膠束質(zhì)子化水平受到H離子濃度的影響,在3 h后,在化學(xué)位移1.2處才出現(xiàn)PDPA嵌段上氫的微弱峰,表明質(zhì)子化平衡后也只有少量的-PDPA被質(zhì)子化,因而,聚合物膠束逐步膨脹變得疏松,大量的藥物被泄露。

    圖4 mPEG45-PDPA100形成的膠束在弱酸性環(huán)境中隨時(shí)間變化的1H NMR譜圖(0.3 mg·mL-1)Fig.4 1H NMR spectral evolution with time of the micelles composed of mPEG45-PDPA10under acidic condition(0.3 mg·mL-1)

    3.4膠束的生物相容性及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

    嵌段聚合物膠束能否作為優(yōu)良的藥物載體,其最基本的條件則是需要有良好的生物相容性,以Huh7細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞株,在培養(yǎng)狀態(tài)良好的Huh7細(xì)胞中,分別加入不同濃度的膠束,孵育過夜,24 h后洗除,加入新鮮的培養(yǎng)基,以CCK-8作為指示劑26。如圖5所示,膠束與細(xì)胞孵育24 h后,即使在較大濃度下(250 μg·mL-1),細(xì)胞仍具有良好的生物活性,細(xì)胞存活率均在95%以上,因而,該嵌段聚合物膠束具有良好的生物相溶性,可以應(yīng)用于體內(nèi)分子運(yùn)載的材料。同時(shí)進(jìn)一步考察熒光標(biāo)記的嵌段聚合物形成的膠束能否作為的熒光示蹤載體運(yùn)載藥物至細(xì)胞內(nèi)部,由于PEG具有較好的細(xì)胞通透性27,以混合的嵌段聚合物mPEG45-PDPA100及FITC-PEG45-PDPA100(摩爾比為1:1)作為示例,分別考察不同濃度的膠束轉(zhuǎn)染Huh7的效果,由圖6可以看出,在細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)了綠色熒光,表明這種熒光標(biāo)記膠束可以很好地轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。

    圖5 不同濃度(c)膠束的Huh7細(xì)胞毒性試驗(yàn)Fig.5 Cell viability of Huh7 cells cultured with different concentrations(c)of micelles

    圖6 mPEG45-PDPA100與熒光物FITC-PEG45-PDPA100(摩爾比,1:1)混合后的細(xì)胞轉(zhuǎn)染圖Fig.6 Transfection of the micelles composed of polymers mPEG45-PDPA100and FITC-PEG45-PDPA100(mole ratio,1:1)

    4 結(jié)論

    制備了一種熒光標(biāo)記的pH敏感的二嵌段聚合物mPEG45-PDPAn及FITC-PEG45-PDPA100,通過自組裝可以形成粒徑均一的膠束,作為藥物載體,在弱酸環(huán)境下,嵌段聚合物疏水鏈-PDPA質(zhì)子化,膠束核發(fā)生膨脹,包載的藥物釋放;進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明,這種嵌段聚合物膠束有著良好的生物相容性,同時(shí)可以作為熒光標(biāo)記藥物載體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,具有較好的轉(zhuǎn)染效果。因而,利用這種具有pH敏感及熒光效果的嵌段聚合物所制備的膠束,可以作為藥物送達(dá)、示蹤及實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)藥物釋放的載體。

    Supporting Information:available free of charge via the internet at http://www.whxb.pku.edu.cn.

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    Preparation of Fluorescently Labeled pH-Sensitive Micelles for Controlled Drug Release

    HAO Wei-Ju1ZHANG Jun-Qi2SHANG Ya-Zhuo1XU Shou-Hong1,*LIU Hong-Lai1
    (1State Key Laboratory of Chemical Engineering,Department of Chemistry,East China University of Science and Technology, Shanghai 200237,P.R.China;2Department of Medical Microbiology and Parasitology,School of Basic Medical Sciences, Fudan University,Shanghai 200032,P.R.China)

    In this paper,novel pH-sensitive amphiphilic diblock copolymers[mPEG-b-PDPAn(n=100-200, polymerization degree;PEG is polyethylene glycol and PDPA is polydiphenylamine)]with and without a fluorescent group(fluorescein isothiocyanate,FITC)were synthesized by atom transfer radical polymerization (ATRP).The copolymers were used to prepare micelles by solvent evaporation to act as drug carriers.The micelles were spherical with a uniform diameter of 180-240 nm(0.3 mg·mL-1).The model drug doxorubicin (DOX)could be encapsulated into the micelles with a high loading efficiencyof about 11%(w,mass fraction). The micelles were stable at pH 7.4 and became looser upon the protonation of the PDPAblock in a weakly acidic environment.The release of DOX accelerated when the micelles were exposed to weakly acidic conditions,and the amount released reached 80%after 2-3 h.Cell toxicity assays of the micelles were carried out using human cancer cells(Huh7),and the micelles showed good cytocompatibility.The micelles labeled with FITC displayed high cell transfection efficiency.As a result,micelles labeled with fluorescent groups may open up new perspectives for real-time tracking of drug delivery and/or distribution during chemotherapy.

    pH-sensitive copolymer;Self-assembly micelle;Targeting delivery;Controlled release

    April 25,2016;Revised:June 27,2016;Published online:June 29,2016.

    .Email:xushouhong@ecust.edu.cn;Tel:+86-21-64251942.

    O648

    10.3866/PKU.WHXB201606296

    The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21276074)and Fundamental Research Funds for the Centre Universities of China.

    國家自然科學(xué)基金(21276074)和基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目?Editorial office ofActa Physico-Chimica Sinica

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