• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    熒光標(biāo)記pH敏感膠束的制備及其藥物控釋

    2016-11-22 09:49:26郝偉舉張俊琪尚亞卓徐首紅劉洪來
    物理化學(xué)學(xué)報(bào) 2016年10期
    關(guān)鍵詞:質(zhì)子化粒徑熒光

    郝偉舉 張俊琪 尚亞卓 徐首紅,* 劉洪來

    (1華東理工大學(xué)化學(xué)系,化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200237;2復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,上海200032)

    熒光標(biāo)記pH敏感膠束的制備及其藥物控釋

    郝偉舉1張俊琪2尚亞卓1徐首紅1,*劉洪來1

    (1華東理工大學(xué)化學(xué)系,化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200237;2復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,上海200032)

    利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合方法(ATRP)合成了pH敏感的兩親性嵌段共聚物mPEG-b-PDPAn(聚合度n=100-200)及熒光修飾的嵌段聚合物異硫氰酸熒光素-聚乙二醇-聚N,N-二異丙胺基甲基丙烯酸乙酯(FITCPEG45-PDPA100)。采用溶劑揮發(fā)的方法制備膠束,此膠束呈現(xiàn)均一的球形分布,平均粒徑180-240 nm(0.3 mg·mL-1)。以阿霉素(DOX)為模擬藥物,其膠束載藥量約11%(w,質(zhì)量分?jǐn)?shù))左右,外環(huán)境pH對(duì)載藥膠束的粒徑和體外釋放行為有顯著影響。在弱酸環(huán)境下,膠束核質(zhì)子化發(fā)生膨脹甚至解體,在2-3 h內(nèi)藥物可釋放80%左右。體外毒性試驗(yàn)表明,空白膠束與人類肝癌細(xì)胞(Huh7)有良好的生物相容性。同時(shí),與此細(xì)胞共同孵育5 h的熒光聚合物膠束體現(xiàn)了較好的轉(zhuǎn)染效果。因此,這類熒光標(biāo)記膠束可能會(huì)為實(shí)時(shí)跟蹤化療藥物的輸送或分布打開新的視角。

    pH敏感聚合物;自組裝膠束;靶向運(yùn)輸;可控釋藥

    1引言

    嵌段聚合物膠束是由兩親性聚合物在水溶液中自組裝形成,內(nèi)核為疏水區(qū),通過疏水作用力可包載疏水性藥物,外圍的親水性嵌段可增加藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性,延長藥物的血液循環(huán)時(shí)間1。聚合物膠束由于具有適宜的粒徑,穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì),在高通透性及滯留效應(yīng)(EPR)的作用下可被動(dòng)靶向到腫瘤部位以減少抗腫瘤藥對(duì)正常細(xì)胞的不良反應(yīng)2。由于傳統(tǒng)載藥體系存在著諸多缺點(diǎn),例如被細(xì)胞吞噬攝入后,藥物釋放緩慢難以在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到有效濃度等。因而,近年來具有特殊功能響應(yīng)型聚合物應(yīng)運(yùn)而生,如溫度3、pH4、超聲5及酶敏感6材料。這些特殊功能的嵌段聚合物構(gòu)成的載藥體系,受到相應(yīng)的環(huán)境刺激,實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)定時(shí)的藥物釋放。研究發(fā)現(xiàn)人體正常血液循環(huán)及組織的pH約為7.47,而腫瘤區(qū)域由于其代謝旺盛,處在缺氧環(huán)境中,有過多的乳酸代謝物產(chǎn)生,使腫瘤組織微環(huán)境呈弱酸性(pH 6.5)8,此外,細(xì)胞內(nèi)涵體的基質(zhì)環(huán)境pH值約為5.5-6.09,當(dāng)內(nèi)涵體逐漸變成溶酶體的過程中,其pH值更低,約為4.5-5.010,介于這些組織或生理環(huán)境在pH上的差異,具有pH敏感的釋藥體系以特有的性質(zhì)占據(jù)著優(yōu)勢11。

    本文以此為出發(fā)點(diǎn),合成了具有熒光示蹤12及pH敏感雙重功能的嵌段聚合物FITC-PEG45-PDPAn、mPEG45-PDPAn,聚合物通過自組裝形成膠束,其疏水內(nèi)核可以包載疏水性藥物,并隨著人體微環(huán)境pH的變化完成藥物定向釋放,實(shí)驗(yàn)中用人類肝癌細(xì)胞(Huh7細(xì)胞)作為細(xì)胞株,研究了膠束本身的藥理毒性和膠束熒光跟蹤效果13。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備

    甲基丙烯酸二異丙胺基乙酯(DPA,98%,Sigma-Aldrich公司),聚乙二醇單甲醚2000(mPEG45,95%,Sigma-Aldrich公司),異硫氰酸熒光素的聚乙二醇(FITC-PEG45,90%,西安瑞禧生物科技有限公司),2-溴代異丁酰溴(98%,Sigma-Aldrich公司);N,N,N-N,N″-五甲基二亞乙基三胺(PMDETA,99%,TCI公司);CuBr(AR,經(jīng)冰醋酸、乙醇洗滌三次,90%,干燥后待用,上海蓮花有限公司);芘(99%,Sigma-Aldrich公司),鹽酸型阿霉素(DOX·HCl,98%,J&KCHEMICA公司);四氫呋喃(THF,99.5%,AR,上海泰坦有限公司);甲醇(99.5%,AR,上海泰坦有限公司);二氯甲烷(99.5%,AR,使用前經(jīng)氫化鈣處理,上海泰坦有限公司);中性三氧化二鋁(200-300目,上海蓮花有限公司)。人類肝癌細(xì)胞株(Huh7細(xì)胞,美國菌種保藏ATCC),細(xì)胞毒性試劑盒(CCK-8,上海碧云天有限公司)、無血清培養(yǎng)基、10%牛胎兒血清培養(yǎng)基均購置于上海生物科技有限公司。

    動(dòng)態(tài)光散射(DLS,Zem4228,馬爾文,日本島津公司,日本),紫外-可見分光光度計(jì)(UV-2450,日本島津公司,日本);熒光分光光度計(jì)(F-4500,日本島津公司,日本);凝膠滲透色譜儀(GPC,PL-GPC50,費(fèi)爾伯恩精密公司,中國);透射電子顯微鏡(TEM-1400,日本);核磁共振(1H NMR,Bruker-400MH,德國)測定;倒置顯微鏡及熒光顯微鏡(EVOS.AMG,美國);微孔板分光光度計(jì)(ELX800 Biotek,美國)。

    2.2大分子引發(fā)劑mPEG-Br及FITC-PEG-Br的合成

    向干燥的單口燒瓶中加入聚乙二醇單甲醚(mPEG45,2 g,1 mmol),用25 mL干燥的甲苯溶解,加入三乙胺(TEA,200 μL,1.44 mmol),在冰鹽浴的環(huán)境下緩慢滴加2-溴異丁酰溴(185 μL,1.5 mmol),反應(yīng)體系持續(xù)劇烈攪拌,室溫環(huán)境氮?dú)獗Wo(hù)反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后旋蒸,在冷乙醚中沉淀,真空干燥,得到淡黃色固體。產(chǎn)物質(zhì)量1.82 g,有1H NMR確定其轉(zhuǎn)化率為93%。該產(chǎn)物為CH3OPEG45-Br,具有熒光的FITC-PEG45-OH以同樣的方法制備出大分子引發(fā)劑FITC-PEG45-Br。

    2.3聚合物mPEG45-PDPAn及FITC-PEG45-PDPAn的制備

    通過ATRP聚合的方法接枝聚合物14,15,以制備mPEG45-PDPA100為例,其物質(zhì)摩爾量為n,n(DPA):n(mPEG45-Br):n(CuBr):n(PMDETA)= 100:1:1:1.1,取引發(fā)劑mPEG45-Br 0.5 g放入Schlenk裝置,通氮?dú)馀叛?,在氮?dú)獾谋Wo(hù)下,取單體DPA 6 mL;干燥四氫呋喃12 mL,取PMDETA 50 μL注入Schlenk裝置,經(jīng)三次液氮冷凍-抽真空-溶解,在冷凍條件下加入催化劑CuBr 0.0326 g,在40°C的環(huán)境下反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液加入四氫呋喃稀釋,終止反應(yīng),過中性Al2O3的分離柱除去CuBr催化劑。旋蒸THF并在冷凍甲醇(除雜質(zhì)及未反應(yīng)的單體)中沉降。得到粘稠的聚合物,進(jìn)一步干燥,得到白色固體,通過1H NMR (400 Hz,CCl3D)及GPC(THF為流出液)檢測其純度。

    2.4嵌段聚合物的物化性質(zhì)表征

    嵌段聚合物的pH敏感性及熒光性能主要通過DLS、UV-2450及熒光光度計(jì)來進(jìn)行表征。配置嵌段聚合物濃度為0.1 mg·mL-1的酸性溶液(pH 3.0左右),逐滴滴加氫氧化鈉(1 mol·L-1)溶液,通過DLS檢測其溶液體系的粒徑及電位變化,同時(shí)通過UV-2450表征溶液的透過率隨pH的變化。臨界膠束濃度16(CMC)是聚合物形成膠束的重要參數(shù),本實(shí)驗(yàn)通過配置1×10-6mol·L-1的芘溶液作為熒光探針,通過熒光在372與383 nm的強(qiáng)度比值與聚合物溶液的濃度對(duì)數(shù),來測出嵌段聚合物的CMC。

    2.5制備聚合物膠束

    本實(shí)驗(yàn)主要通過溶劑揮發(fā)的方法制備聚合物膠束17。方法如下:(1)空白膠束的制備。配置6 mg·mL-1的聚合物THF溶液5 mL作為母液,取其100 μL,逐滴加入2 mL的pH 7.4的磷酸緩沖液(PBS,1 mmol·L-1),攪拌12 h至THF揮發(fā)完全;(2)對(duì)于載藥的聚合物膠束的制備,使用相同的方法稱取DOX·HCl 10 mg溶于100 μL的THF母液,加入50 μLTEA使親水性DOX·HCl變?yōu)槭杷缘腄OX,逐滴加入2 mL的pH 7.4的PBS(1 mmol· L-1)緩沖液,使用3500 g·mol-1的透析袋除去為被包裹的DOX。聚合物膠束的粒徑及帶電量通過DLS表征,通過檢測0.3 mg·mL-1的上述濃度溶液,其形貌通過TEM表征,銅網(wǎng)作為負(fù)載體,磷鎢酸(1%,質(zhì)量分?jǐn)?shù))作為負(fù)染液。

    2.6膠束的載藥及釋藥研究

    膠束的載藥量(DLC)及包封率(DEE)通過UV-2450在485 nm處的吸收峰進(jìn)行檢測18,其DLC和DEE通過以下公式可以計(jì)算:

    其中m1為包載藥物的質(zhì)量(mg);m2為總膠束質(zhì)量(mg);m3為總藥質(zhì)量(mg);

    膠束的釋藥性能主要考察不同pH環(huán)境下DOX累積釋放速率,分別考察其12 h聚合物膠束在pH 3.0、pH 5.0、pH 7.4、pH 9.2累積釋藥量。其中累積釋放效率(η)為:

    其中A1為累積紫外吸收強(qiáng)度,A2為膠束包載的總DOX的強(qiáng)度。

    2.7聚合物膠束的毒性試驗(yàn)

    采用Cell Counting Kit(CCK-8)法進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)19,接種Huh7細(xì)胞于96孔板中(1×104/孔),于37°C,5%(φ,體積分?jǐn)?shù))CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后分別加入無血清的聚合物膠束,其膠束的濃度為0、10、50、100和200 μg·mL-1。孵育24 h后,用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3次,每孔滴加10 μL的CCK-8檢測液,于37°C孵育30 min后,通過微孔板分光光度計(jì)測量吸光值。

    2.8熒光聚合物膠束的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)

    采用類似培養(yǎng)細(xì)胞的方法20,接種Huh7細(xì)胞于24孔板(2×104/孔),培養(yǎng)24 h后,分別加入具有熒光功能的混合聚合物mPEG45-PDPA100與FITCPEG45-PDPA100(摩爾比為1:1)膠束(0,100和200 μg·mL-1)與Huh7細(xì)胞進(jìn)行孵育,5 h后吸除熒光的聚合物膠束,通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況。

    3 結(jié)果與討論

    3.1聚合物的合成及表征

    實(shí)驗(yàn)中嵌段聚合物的制備見示意圖1所示,有mPEG45-OH及FITC-PEG45-OH與二溴異丁酰溴進(jìn)行酯化合成出大分子引發(fā)劑,進(jìn)而與單體DPA進(jìn)行ATRP聚合,合成出不同鏈長的嵌段聚合物mPEG45-PDPAn及具有熒光標(biāo)記的嵌段聚合物FITCPEG45-PDPA100。

    示意圖1 嵌段聚合物的合成流程圖Scheme 1 Synthesis route of polymer

    合成的嵌段聚合物的分子結(jié)構(gòu)用1H NMR進(jìn)行表征,結(jié)果如圖1所示,(a)為聚合物mPEG45-Br,mPEG45-PDPA100及FITC-PEG45-Br,F(xiàn)ITC-PEG45-PDPA100的1H NMR譜圖。圖1(a)(1,2)中1.8位移處(e)為PEG-Br鏈段中丙交酯的甲基(―CH3),3.66位移處是PEG嵌段上的CH2―CH2O―基團(tuán);圖1a(2)中1.12處(k)為聚合物PDPA鏈段中氨基處的4個(gè)(―CH3),常被看作PDPA的特征峰。圖1a(3,4)為標(biāo)記了熒光物質(zhì)的FITC-PEG45-Br及嵌段聚合物FITC-PEG45-PDPAn的1H NMR譜圖,與上面兩個(gè)譜圖相比,在3.66位移處有FITC-PEG45上的―CH2―基團(tuán),同時(shí)在化學(xué)位移5.35處,有熒光物質(zhì)FITC的特征峰,通過核磁圖譜的結(jié)果可以確定所設(shè)計(jì)的嵌段聚合物已經(jīng)得到。

    嵌段聚合物的相對(duì)分子量通過GPC進(jìn)行測量,結(jié)果如圖1(b)所示:相對(duì)分子量越大,則GPC檢測出的流出時(shí)間就越短21,單峰型則證明嵌段聚合物中沒有雜質(zhì)。由圖可知,隨著PDPA嵌段的增加,分子量相應(yīng)地增大,而熒光基團(tuán)的分子量相對(duì)于聚合物的分子量幾乎可以忽略。通過GPC數(shù)據(jù)分析,得到三個(gè)聚合物的分子量依次為21567 g· mol-1(mPEG45-PDPA100),27742 g·mol-1(mPEG45-PDPA150)和37236 g·mol-1(mPEG45-PDPA200),其PDI(多分散指數(shù),Polydispersity Index)值分別為1.19、1.22和1.22,表明分子量有較窄的分布,F(xiàn)ITC-PEG45-PDPA100嵌段聚合物的GPC分子量為23060 g·mol-1,其PDI為1.56。嵌段聚合物的pH敏感點(diǎn)則通過聚合物在不同pH環(huán)境下的粒徑變化來檢測,如圖1(c)所示,在強(qiáng)酸性環(huán)境下即pH 3.0左右,各嵌段聚合物都較好地溶解在水溶液中,隨著pH值上升,在pH 6.0-7.0之間,由于PDPA嵌段逐步脫質(zhì)子化,由親水性轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷裕沟镁酆衔锍尸F(xiàn)兩親性而發(fā)生自組裝形成膠束顆粒,如圖1(c)在pH 6.0-7.0之間,各聚合物粒徑發(fā)生突增,證明嵌段聚合物有較好的pH敏感性,pH敏感點(diǎn)隨著PDPA嵌段的聚合度的增加略有上升,從圖上判斷大約從pH 6.0變?yōu)閜H 6.7。

    圖1 (a)聚合物(1)PEG-Br、(2)PEG-PDPA、(3)FITC-PEG-Br、(4)FITC-PEG-PDPA的核磁共振圖譜;(b)嵌段聚合物的GPC流出圖;(c)嵌段聚合物在不同pH環(huán)境下的尺寸變化Fig.1 (a)1H nuclear magnetic resonance(1H NMR)spectra of the polymers(1)PEG-Br,(2)PEG-PDPA, (3)FITC-PEG-Br,and(4)FITC-PEG-PDPA;(b)the gel permeation chromatography(GPC)data of polymers; (c)size changes of the block polymers at different pH values

    3.2膠束的形成及物性表征

    通過溶劑揮發(fā)的方法制備出粒徑均一、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的膠束,其物性如表1所示。由CMC的測定(圖S1(Supporting Information),表1)可確定聚合物自組裝形成所需最低濃度,PDPA嵌段越長,其CMC越小,符合兩親性嵌段聚合物的理論性質(zhì)22。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),在相同濃度下(pH 7.4),PDPA嵌段越長所形成的膠束粒徑反而越小,這可能是因?yàn)檩^長的PDPA疏水作用更強(qiáng),自組裝形成的膠束由于疏水作用收縮得更小。DLS結(jié)果顯示(表1),顆粒的粒徑在180-240 nm(0.3 mg·mL-1)左右,聚合物的濃度上升,顆粒的尺寸略有增加,其PDI值極小表明通過溶劑揮發(fā)的方法可以獲得尺寸均一的膠束,zeta電位結(jié)果顯示,膠束在pH 7.4時(shí),均帶有少量負(fù)電荷,由于各個(gè)嵌段聚合的pH敏感點(diǎn)不同,各自所帶電量略有不同(表1)。mPEG45-PDPA200的電位接近中性,但是由于伸展在膠束外側(cè)的PEG具有極強(qiáng)的親水性,膠束并沒有沉淀的傾向,在一定濃度膠束的條件下可以穩(wěn)定存在5-7天。

    表1 聚合物自組裝形成的膠束的物化性質(zhì)(pH 7.4)Table1 Properties of micelles composed of copolymers by self-assembly(pH 7.4)

    圖2 (a)嵌段聚合物膠束的TEM圖;(b)膠束的粒徑Fig.2 (a)TEM images of polymer micelles;(b)particle sizes of micelles

    圖3 嵌段聚合物膠束在不同pH值下的釋藥動(dòng)力學(xué)Fig.3 Drug release dynamic of micelles at different pH values

    對(duì)聚合物濃度為0.3 mg·mL-1形成的膠束進(jìn)行了TEM形貌表征,由圖2(a)可見,嵌段聚合物膠束呈現(xiàn)出均一的球形,粒徑分布也比較均勻。mPEG45-PDPA100的膠束的平均粒徑約為200 nm,mPEG45-PDPA150及mPEG45-PDPA200膠束的平均粒徑則分別約為180、150 nm左右,和DLS結(jié)果相比略小一點(diǎn)(圖2(b)),這和樣品干燥處理過程有關(guān)。

    3.3膠束的藥物包裹及釋放

    均一的膠束為藥物運(yùn)載提供一個(gè)優(yōu)良的基礎(chǔ)23,我們進(jìn)一步運(yùn)用聚合物膠束進(jìn)行疏水性藥物DOX的包載和運(yùn)輸24,并研究不同的pH環(huán)境下(pH 3.0,5.0,7.4,9.2)的釋放動(dòng)力學(xué)。通過疏水作用力進(jìn)行藥物包裹,膠束的載藥量可以達(dá)到11%(w,質(zhì)量分?jǐn)?shù)),包封率為70%(w,質(zhì)量分?jǐn)?shù))左右。圖3是各個(gè)聚合物形成的膠束的累計(jì)釋藥量曲線,從圖中可以看出,包載藥物的各個(gè)膠束在相同pH環(huán)境中幾乎有著相同的釋藥趨勢,即在堿性環(huán)境(pH 9.2)下,藥物可以穩(wěn)定地被包載在顆粒中,總釋藥率低于5%,而環(huán)境變?yōu)橹行浴⑺嵝院?,藥物釋放量增加,均?-4 h后基本達(dá)到平衡。圖3(a)中,膠束(mPEG45-PDPA100)的pH敏感點(diǎn)在三者中最低,約為pH 6.0,當(dāng)pH從7.4降為5.0時(shí),比起pH敏感點(diǎn)較高的顆粒(mPEG45-PDPA150和mPEG45-PDPA200)其質(zhì)子化速度較慢,到達(dá)質(zhì)子化平衡需更多時(shí)間,導(dǎo)致其釋藥在4 h后才達(dá)到平衡,而圖3(b)和3(c)的膠束的釋藥僅需2 h就達(dá)到平衡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明膠束在弱酸性環(huán)境下,由于聚合物中PDPA嵌段的質(zhì)子化,膠束核逐漸膨脹,促進(jìn)核中藥物釋放。在強(qiáng)酸性環(huán)境pH 3.0中,各個(gè)膠束核PDPA嵌段均迅速地幾乎完全地被質(zhì)子化,膠束核迅速膨脹變疏松,尤其是PDPA嵌段聚合度最短的mPEG45-PDPA100,膠束接近于解體,使得其包裹的藥物幾乎完全釋放,而較長PDPA嵌段的膠束由于之前的自組裝纏繞更緊密,很難完全釋放。可見PDPA嵌段的尺寸可以調(diào)節(jié)膠束釋藥速率和累計(jì)釋放量。

    為了驗(yàn)證膠束中藥物的釋放機(jī)理25,在pH 7.4的環(huán)境中制備膠束,而后使體系的pH降低至pH 5.0。通過1HNMR進(jìn)行表征,在酸環(huán)境下,聚合物PDPA發(fā)生質(zhì)子化,膠束的核逐步溶脹,由圖4可知,在pH 3.0的條件下的1HNMR圖譜中,1 h后其化學(xué)位移為1.2處,出現(xiàn)PDPA嵌段上被質(zhì)子化了的氫的峰,兩親性的嵌段聚合物由于變?yōu)橛H水性而無法自組裝為膠束而接近解體(DLS測到粒徑只有幾個(gè)納米),而在弱酸環(huán)境下即pH 5.0,其膠束質(zhì)子化水平受到H離子濃度的影響,在3 h后,在化學(xué)位移1.2處才出現(xiàn)PDPA嵌段上氫的微弱峰,表明質(zhì)子化平衡后也只有少量的-PDPA被質(zhì)子化,因而,聚合物膠束逐步膨脹變得疏松,大量的藥物被泄露。

    圖4 mPEG45-PDPA100形成的膠束在弱酸性環(huán)境中隨時(shí)間變化的1H NMR譜圖(0.3 mg·mL-1)Fig.4 1H NMR spectral evolution with time of the micelles composed of mPEG45-PDPA10under acidic condition(0.3 mg·mL-1)

    3.4膠束的生物相容性及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

    嵌段聚合物膠束能否作為優(yōu)良的藥物載體,其最基本的條件則是需要有良好的生物相容性,以Huh7細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞株,在培養(yǎng)狀態(tài)良好的Huh7細(xì)胞中,分別加入不同濃度的膠束,孵育過夜,24 h后洗除,加入新鮮的培養(yǎng)基,以CCK-8作為指示劑26。如圖5所示,膠束與細(xì)胞孵育24 h后,即使在較大濃度下(250 μg·mL-1),細(xì)胞仍具有良好的生物活性,細(xì)胞存活率均在95%以上,因而,該嵌段聚合物膠束具有良好的生物相溶性,可以應(yīng)用于體內(nèi)分子運(yùn)載的材料。同時(shí)進(jìn)一步考察熒光標(biāo)記的嵌段聚合物形成的膠束能否作為的熒光示蹤載體運(yùn)載藥物至細(xì)胞內(nèi)部,由于PEG具有較好的細(xì)胞通透性27,以混合的嵌段聚合物mPEG45-PDPA100及FITC-PEG45-PDPA100(摩爾比為1:1)作為示例,分別考察不同濃度的膠束轉(zhuǎn)染Huh7的效果,由圖6可以看出,在細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)了綠色熒光,表明這種熒光標(biāo)記膠束可以很好地轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。

    圖5 不同濃度(c)膠束的Huh7細(xì)胞毒性試驗(yàn)Fig.5 Cell viability of Huh7 cells cultured with different concentrations(c)of micelles

    圖6 mPEG45-PDPA100與熒光物FITC-PEG45-PDPA100(摩爾比,1:1)混合后的細(xì)胞轉(zhuǎn)染圖Fig.6 Transfection of the micelles composed of polymers mPEG45-PDPA100and FITC-PEG45-PDPA100(mole ratio,1:1)

    4 結(jié)論

    制備了一種熒光標(biāo)記的pH敏感的二嵌段聚合物mPEG45-PDPAn及FITC-PEG45-PDPA100,通過自組裝可以形成粒徑均一的膠束,作為藥物載體,在弱酸環(huán)境下,嵌段聚合物疏水鏈-PDPA質(zhì)子化,膠束核發(fā)生膨脹,包載的藥物釋放;進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明,這種嵌段聚合物膠束有著良好的生物相容性,同時(shí)可以作為熒光標(biāo)記藥物載體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,具有較好的轉(zhuǎn)染效果。因而,利用這種具有pH敏感及熒光效果的嵌段聚合物所制備的膠束,可以作為藥物送達(dá)、示蹤及實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)藥物釋放的載體。

    Supporting Information:available free of charge via the internet at http://www.whxb.pku.edu.cn.

    References

    (1) Lee,S.M.;Nguyen,S.T.Macromolecules 2013,46(23),9169. doi:10.1021/ma401529w

    (2) Maeda,H.;Nakamura,H.;Fang,J.Adv.Drug Deliv.Rev.2013, 65(1),71.doi:10.1016/j.addr.2012.10.002

    (3) Tan,R.;She,Z.;Wang,M.;Fang,Z.;Liu,Y.;Feng,Q. Carbohydr.Polym.2012,87(2),1515.doi:10.1016/j. carbpol.2011.09.048

    (4)Wu,X.;Wang,Z.;Zhu,D.;Zong,S.;Yang,L.;Zhong,Y.;Cui, Y.ACS Appl.Mater.Interfaces 2013,5(21),10895. doi:10.1021/am403092m

    (5) Paris,J.L.;Caba?as,M.V.;Manzano,M.;Vallet-Regí,M.ACS Nano 2015,9(11),11023.doi:10.1021/acsnano.5b04378

    (6) Hill,E.H.;Zhang,Y.;Evans,D.G.;Whitten,D.G.ACS Appl. Mater.Interfaces 2015,7(9),5550.doi:10.1021/ acsami.5b00185

    (7) Lay,C.L.;Tan,H.R.;Lu,X.;Liu,Y.Chemistry(Easton)2011, 17(8),2504.doi:10.1002/chem.201001403

    (8)Kim,K.;Kim,J.H.;Park,H.;Kim,Y.S.;Park,K.;Nam,H.; Lee,S.;Park,J.H.;Park,R.W.;Kim,I.S.;Choi,K.;Kim,S. Y.;Kwon,I.C.J.Control.Release 2010,146(2),219. doi:10.1016/j.jconrel.2010.04.004

    (9)Choe,U.J.;Rodriguez,A.R.;Lee,B.S.;Knowles,S.M.;Wu, A.M.;Deming,T.J.;Kamei,D.T.Biomacromolecules 2013,14 (5),1458.doi:10.1021/bm400124z

    (10) Dai,Y.;Ma,P.A.;Cheng,Z.;Kang,X.;Zhang,X.;Hou,Z.;Li,C.;Yang,D.;Zhai,X.;Lin,J.ACS Nano 2012,6(4),3327. doi:10.1021/nn300303q

    (11) Qian,J.;Sullivan,B.P.;Berkland,C.Biomacromolecules 2015, 16(8),2340.doi:10.1021/acs.biomac.5b00560

    (12) Evans,C.M.;Henderson,K.J.;Saathoff,J.D.;Shull,K.R.; Torkelson,J.M.Macromolecules 2013,46(10),4131. doi:10.1021/ma400686j

    (13) Jia,X.;Zhao,X.;Tian,K.;Zhou,T.;Li,J.;Zhang,R.;Liu,P. Biomacromolecules 2015.doi:10.1021/acs.biomac.5b01070

    (14) Pearson,R.T.;Warren,N.J.;Lewis,A.L.;Armes,S.P.; Battaglia,G.Macromolecules 2013,46(4),1400.doi:10.1021/ ma302228m

    (15) Ciftci,M.A.T.;Tasdelen,M.A.;Li,W.W.;Matyjaszewski,K.; Yagci,Y.Macromolecules 2013,46,9537.doi:10.1021/ ma402058a

    (16) Keyes-Baig,C.;Duhamel,J.;Wettig,S.Langmuir 2011,27(7), 3361.doi:10.1021/la104820w

    (17) Petros,R.A.;DeSimone,J.M.Nat.Rev.Drug Discov.2010,9 (8),615.doi:10.1038/nrd2591

    (18) Guo,X.;Li,D.;Yang,G.;Shi,C.;Tang,Z.;Wang,J.;Zhou,S. ACS Appl.Mater.Interfaces 2014,6(11),8549.doi:10.1021/ am501422r

    (19) Sankaranarayanan,J.;Mahmoud,E.A.;Kim,G.;Morachis,J. M.;Almutairi,A.ACS Nano 2010,4,5930.doi:10.1021/ nn100968e

    (20)Yu,H.J.;Zou,Y.L.;Wang,Y.G.;Huang,X.N.;Huang, G.;Sumer,B.D.;Boothman,D.A.;Gao,J.M.ACS Nano 2011, 5,9246.doi:10.1021/nn203503h

    (21) Han,X.;Zhang,X.;Zhu,H.;Yin,Q.;Liu,H.;Hu,Y.Langmuir 2013,29(4),1024.doi:10.1021/la3036874

    (22) Orelma,H.;Teerinen,T.;Johansson,L.S.;Holappa,S.;Laine, J.Biomacromolecules 2012,13(4),1051.doi:10.1021/ bm201771m

    (23)Wang,J.;Tian,S.;Petros,R.A.;Napier,M.E.;DeSimone,J.M. J.Am.Chem.Soc.2010,132(32),11306.doi:10.1021/ ja1043177

    (24) Li,H.;Cui,Y.;Sui,J.;Bian,S.;Sun,Y.;Liang,J.;Fan,Y.; Zhang,X.ACS Appl.Mater.Interfaces 2015,7(29),15855. doi:10.1021/acsami.5b03150

    (25) Hao,W.;Han,X.;Shang,Y.;Xu,S.;Liu,H.Colloids Surf.BBiointerfaces 2015,136,809.doi:10.1016/j. colsurfb.2015.10.033

    (26) Liu,Q.;Chen,S.;Chen,J.;Du,J.Macromolecules 2015,48(3), 739.doi:10.1021/ma502255s

    (27) Logie,J.;Owen,S.C.;McLaughlin,C.K.;Shoichet,M.S. Chem.Mater.2014,26(9),2847.doi:10.1021/cm500448x

    Preparation of Fluorescently Labeled pH-Sensitive Micelles for Controlled Drug Release

    HAO Wei-Ju1ZHANG Jun-Qi2SHANG Ya-Zhuo1XU Shou-Hong1,*LIU Hong-Lai1
    (1State Key Laboratory of Chemical Engineering,Department of Chemistry,East China University of Science and Technology, Shanghai 200237,P.R.China;2Department of Medical Microbiology and Parasitology,School of Basic Medical Sciences, Fudan University,Shanghai 200032,P.R.China)

    In this paper,novel pH-sensitive amphiphilic diblock copolymers[mPEG-b-PDPAn(n=100-200, polymerization degree;PEG is polyethylene glycol and PDPA is polydiphenylamine)]with and without a fluorescent group(fluorescein isothiocyanate,FITC)were synthesized by atom transfer radical polymerization (ATRP).The copolymers were used to prepare micelles by solvent evaporation to act as drug carriers.The micelles were spherical with a uniform diameter of 180-240 nm(0.3 mg·mL-1).The model drug doxorubicin (DOX)could be encapsulated into the micelles with a high loading efficiencyof about 11%(w,mass fraction). The micelles were stable at pH 7.4 and became looser upon the protonation of the PDPAblock in a weakly acidic environment.The release of DOX accelerated when the micelles were exposed to weakly acidic conditions,and the amount released reached 80%after 2-3 h.Cell toxicity assays of the micelles were carried out using human cancer cells(Huh7),and the micelles showed good cytocompatibility.The micelles labeled with FITC displayed high cell transfection efficiency.As a result,micelles labeled with fluorescent groups may open up new perspectives for real-time tracking of drug delivery and/or distribution during chemotherapy.

    pH-sensitive copolymer;Self-assembly micelle;Targeting delivery;Controlled release

    April 25,2016;Revised:June 27,2016;Published online:June 29,2016.

    .Email:xushouhong@ecust.edu.cn;Tel:+86-21-64251942.

    O648

    10.3866/PKU.WHXB201606296

    The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21276074)and Fundamental Research Funds for the Centre Universities of China.

    國家自然科學(xué)基金(21276074)和基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目?Editorial office ofActa Physico-Chimica Sinica

    猜你喜歡
    質(zhì)子化粒徑熒光
    木屑粒徑對(duì)黑木耳栽培的影響試驗(yàn)*
    干式熒光發(fā)光法在HBV感染診療中應(yīng)用價(jià)值
    高熒光量子產(chǎn)率BODIPY衍生物的熒光性能研究
    基于近場散射的顆粒粒徑分布測量
    5-羥甲基胞嘧啶pKa值的理論研究
    New Situation in the Economic and Trade Cooperation and Competition between China and the US
    Oslo結(jié)晶器晶體粒徑分布特征的CFD模擬
    質(zhì)子化胞嘧啶碰撞誘導(dǎo)解離的實(shí)驗(yàn)和理論研究
    SAPO-56分子篩的形貌和粒徑控制
    質(zhì)子化與氮雜環(huán)類離子液體的研究及應(yīng)用
    科技資訊(2013年7期)2013-04-29 00:44:03
    在线观看一区二区三区| 精品无人区乱码1区二区| 久久午夜亚洲精品久久| 淫妇啪啪啪对白视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 最好的美女福利视频网| 亚洲精品色激情综合| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产探花在线观看一区二区| 插逼视频在线观看| 99热只有精品国产| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲丝袜综合中文字幕| 精品人妻偷拍中文字幕| 成人特级av手机在线观看| 亚洲最大成人手机在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲成人中文字幕在线播放| av视频在线观看入口| 99热全是精品| 91在线观看av| 日韩av不卡免费在线播放| 变态另类丝袜制服| 日韩亚洲欧美综合| 成人精品一区二区免费| 22中文网久久字幕| 日韩强制内射视频| 在线看三级毛片| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 三级国产精品欧美在线观看| 久久精品影院6| 午夜福利视频1000在线观看| 国产综合懂色| 精品一区二区三区人妻视频| 麻豆国产97在线/欧美| 老司机影院成人| 日本一本二区三区精品| 免费在线观看影片大全网站| 97超视频在线观看视频| 亚洲国产精品成人久久小说 | 高清毛片免费看| 亚洲最大成人中文| 色噜噜av男人的天堂激情| 综合色丁香网| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 男女那种视频在线观看| 少妇熟女欧美另类| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲精品日韩av片在线观看| 在线a可以看的网站| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲综合色惰| 天美传媒精品一区二区| 国产av不卡久久| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 欧美性猛交黑人性爽| 我要搜黄色片| 久久久久九九精品影院| 久久久国产成人免费| 亚洲七黄色美女视频| 午夜激情福利司机影院| 精品久久久久久久久久久久久| 国产探花在线观看一区二区| 成人亚洲欧美一区二区av| 黄色一级大片看看| 三级毛片av免费| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲精品日韩av片在线观看| 日日啪夜夜撸| 亚洲性夜色夜夜综合| 99热6这里只有精品| 波多野结衣巨乳人妻| 国产高潮美女av| 亚洲内射少妇av| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美人与善性xxx| 亚洲自拍偷在线| 一级毛片久久久久久久久女| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 亚洲av.av天堂| 亚洲精品久久国产高清桃花| 联通29元200g的流量卡| 国产男靠女视频免费网站| a级毛片免费高清观看在线播放| 乱系列少妇在线播放| 久久久久久久亚洲中文字幕| 男女啪啪激烈高潮av片| 69人妻影院| 亚洲不卡免费看| av天堂中文字幕网| 久久人人爽人人爽人人片va| 热99re8久久精品国产| 中文字幕av在线有码专区| 嫩草影视91久久| 亚洲最大成人av| 干丝袜人妻中文字幕| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 99热网站在线观看| 久久精品夜色国产| 国产成人freesex在线 | 中文字幕av在线有码专区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 男女视频在线观看网站免费| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲中文字幕日韩| 一级毛片电影观看 | 亚洲av一区综合| 99久国产av精品| 色综合色国产| 国产一区亚洲一区在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 丰满乱子伦码专区| 国产单亲对白刺激| 欧美三级亚洲精品| 久久精品综合一区二区三区| 成熟少妇高潮喷水视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 长腿黑丝高跟| 欧美3d第一页| 女同久久另类99精品国产91| АⅤ资源中文在线天堂| 国产麻豆成人av免费视频| 在线播放无遮挡| 国产真实伦视频高清在线观看| 丝袜美腿在线中文| 中文字幕久久专区| 日韩欧美精品v在线| av视频在线观看入口| 天堂影院成人在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 日本免费a在线| 极品教师在线视频| 永久网站在线| 天美传媒精品一区二区| 欧美一级a爱片免费观看看| 午夜福利高清视频| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 精品一区二区三区人妻视频| av在线播放精品| 亚洲国产精品国产精品| 午夜福利在线在线| 日韩欧美精品免费久久| 可以在线观看毛片的网站| 国产av在哪里看| 免费搜索国产男女视频| av专区在线播放| 午夜影院日韩av| 99久久无色码亚洲精品果冻| 久久久欧美国产精品| 亚洲精品成人久久久久久| 久久韩国三级中文字幕| 国产av麻豆久久久久久久| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久6这里有精品| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 久久久久国内视频| 国产精品不卡视频一区二区| 香蕉av资源在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 最新中文字幕久久久久| 国产麻豆成人av免费视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 一进一出好大好爽视频| 女人被狂操c到高潮| 在线播放无遮挡| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲四区av| 久久久欧美国产精品| 热99在线观看视频| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲欧美日韩东京热| av免费在线看不卡| 久久久久性生活片| 成年女人看的毛片在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 久久久久久久午夜电影| 亚洲不卡免费看| 欧美一区二区精品小视频在线| 日本a在线网址| 观看免费一级毛片| 美女免费视频网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 精品福利观看| 91久久精品国产一区二区三区| 日本黄色片子视频| 久久久欧美国产精品| 身体一侧抽搐| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 久久久久久九九精品二区国产| 最新中文字幕久久久久| 免费大片18禁| 在线免费十八禁| 国产av一区在线观看免费| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲第一电影网av| 日韩国内少妇激情av| 亚洲国产精品sss在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 免费av毛片视频| 最近的中文字幕免费完整| 婷婷亚洲欧美| 中文字幕熟女人妻在线| 国产精品一二三区在线看| 精品国内亚洲2022精品成人| 欧美区成人在线视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 在线免费观看的www视频| 夜夜爽天天搞| 国产单亲对白刺激| 日韩欧美在线乱码| 亚洲一区二区三区色噜噜| 日日撸夜夜添| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 一级av片app| 日韩欧美在线乱码| 日韩人妻高清精品专区| 最近视频中文字幕2019在线8| 在线看三级毛片| 在线播放无遮挡| 男人舔女人下体高潮全视频| 欧美日韩乱码在线| 在线免费十八禁| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 亚洲在线自拍视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产片特级美女逼逼视频| 久久久欧美国产精品| 国产男靠女视频免费网站| 成人漫画全彩无遮挡| 99久国产av精品| 欧美人与善性xxx| 日本免费一区二区三区高清不卡| 综合色av麻豆| 在线免费观看不下载黄p国产| 婷婷精品国产亚洲av| 嫩草影院精品99| 午夜久久久久精精品| 日本与韩国留学比较| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| av天堂中文字幕网| 少妇的逼好多水| 久久午夜亚洲精品久久| 久久99热6这里只有精品| 国产 一区 欧美 日韩| 国产午夜精品论理片| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 激情 狠狠 欧美| 国产美女午夜福利| 18+在线观看网站| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 亚洲经典国产精华液单| a级毛片a级免费在线| av黄色大香蕉| av国产免费在线观看| 久久精品夜色国产| 国产爱豆传媒在线观看| 久久久久国内视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产av一区在线观看免费| 国产精品无大码| 成人av在线播放网站| 黄色日韩在线| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 国产一区二区三区av在线 | 午夜日韩欧美国产| 精品久久国产蜜桃| 99热精品在线国产| 国产男人的电影天堂91| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲精品成人久久久久久| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 全区人妻精品视频| 午夜老司机福利剧场| 黄色一级大片看看| 岛国在线免费视频观看| 日本熟妇午夜| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美潮喷喷水| 五月玫瑰六月丁香| 老女人水多毛片| 看非洲黑人一级黄片| 在线看三级毛片| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲成人av在线免费| 天美传媒精品一区二区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 人人妻人人看人人澡| 长腿黑丝高跟| 精品国内亚洲2022精品成人| АⅤ资源中文在线天堂| 啦啦啦韩国在线观看视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 色av中文字幕| avwww免费| 成年女人毛片免费观看观看9| 日韩人妻高清精品专区| 国产麻豆成人av免费视频| 身体一侧抽搐| 老司机影院成人| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 校园人妻丝袜中文字幕| 尾随美女入室| 我要看日韩黄色一级片| 久久亚洲国产成人精品v| 九色成人免费人妻av| 国产色爽女视频免费观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 晚上一个人看的免费电影| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 亚洲第一区二区三区不卡| 97碰自拍视频| 亚洲国产欧美人成| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 午夜亚洲福利在线播放| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日本-黄色视频高清免费观看| 日本免费a在线| 久久久久久久久中文| 国产精品三级大全| 一级毛片aaaaaa免费看小| 五月玫瑰六月丁香| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚州av有码| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 成人国产麻豆网| 亚洲精品456在线播放app| 国产三级中文精品| 最近手机中文字幕大全| 国内精品一区二区在线观看| 久久6这里有精品| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久国产乱子免费精品| 欧美丝袜亚洲另类| 搡老熟女国产l中国老女人| av免费在线看不卡| 久久久久性生活片| 又黄又爽又免费观看的视频| www.色视频.com| 国内精品宾馆在线| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲经典国产精华液单| 久久午夜福利片| 婷婷精品国产亚洲av| 国产精品久久久久久av不卡| 精品不卡国产一区二区三区| 成人无遮挡网站| h日本视频在线播放| 毛片一级片免费看久久久久| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 亚洲欧美日韩东京热| 精品免费久久久久久久清纯| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美性感艳星| 欧美激情国产日韩精品一区| 久久6这里有精品| 日韩精品中文字幕看吧| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美区成人在线视频| 国产成人影院久久av| 在线天堂最新版资源| 俺也久久电影网| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 最后的刺客免费高清国语| 九九在线视频观看精品| 毛片女人毛片| 日韩欧美 国产精品| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 欧美丝袜亚洲另类| 一级a爱片免费观看的视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲不卡免费看| 丰满的人妻完整版| 久久久久精品国产欧美久久久| av免费在线看不卡| 欧美最黄视频在线播放免费| 色综合站精品国产| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产成人a∨麻豆精品| av天堂中文字幕网| 日本欧美国产在线视频| 日韩一本色道免费dvd| 禁无遮挡网站| 天天一区二区日本电影三级| 97在线视频观看| 久久精品国产亚洲av天美| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲最大成人手机在线| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲精品国产成人久久av| 99热这里只有是精品50| 日韩精品有码人妻一区| 久久人人爽人人片av| av.在线天堂| 狠狠狠狠99中文字幕| 成人精品一区二区免费| 香蕉av资源在线| 免费看日本二区| 日韩人妻高清精品专区| 久久久久九九精品影院| 黄色一级大片看看| 淫秽高清视频在线观看| 国内精品久久久久精免费| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 99热全是精品| av在线亚洲专区| 国产黄a三级三级三级人| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 精华霜和精华液先用哪个| 最近的中文字幕免费完整| 久久精品91蜜桃| 国产精品久久久久久av不卡| 国产伦一二天堂av在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 联通29元200g的流量卡| 在线免费观看的www视频| 亚洲图色成人| 美女大奶头视频| 在线免费十八禁| 永久网站在线| 一区二区三区免费毛片| 97超碰精品成人国产| 成人国产麻豆网| 99热6这里只有精品| 精品熟女少妇av免费看| 国产成人a∨麻豆精品| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲av一区综合| 免费无遮挡裸体视频| 国模一区二区三区四区视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久久国产成人精品二区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲人成网站在线播| 在线免费观看的www视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 免费看美女性在线毛片视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 在现免费观看毛片| 亚洲精品一区av在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 色吧在线观看| 久久久欧美国产精品| av在线播放精品| 国产熟女欧美一区二区| 午夜爱爱视频在线播放| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产乱人偷精品视频| 天堂动漫精品| 亚洲性久久影院| 日韩av在线大香蕉| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 韩国av在线不卡| 一a级毛片在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 免费av不卡在线播放| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 能在线免费观看的黄片| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产美女午夜福利| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 中国国产av一级| 大香蕉久久网| 精品一区二区三区视频在线| 国产 一区精品| 色尼玛亚洲综合影院| 国产亚洲91精品色在线| 91狼人影院| videossex国产| 免费在线观看影片大全网站| 干丝袜人妻中文字幕| 99热网站在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 精品久久国产蜜桃| 真人做人爱边吃奶动态| 两个人视频免费观看高清| 亚洲国产高清在线一区二区三| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产老妇女一区| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 一级毛片电影观看 | 久99久视频精品免费| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产精华一区二区三区| 国产高清不卡午夜福利| 校园人妻丝袜中文字幕| 97超碰精品成人国产| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲丝袜综合中文字幕| 五月玫瑰六月丁香| 又黄又爽又刺激的免费视频.| avwww免费| 别揉我奶头 嗯啊视频| 一区福利在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 欧美+日韩+精品| 欧美一区二区亚洲| 搡老熟女国产l中国老女人| 我要看日韩黄色一级片| 黄色一级大片看看| 色播亚洲综合网| 三级经典国产精品| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美区成人在线视频| 一本一本综合久久| 我的老师免费观看完整版| 给我免费播放毛片高清在线观看| 黄色一级大片看看| 欧美zozozo另类| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产成人福利小说| 国产激情偷乱视频一区二区| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美人与善性xxx| 毛片女人毛片| 日本色播在线视频| 成人综合一区亚洲| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产高潮美女av| 中文字幕免费在线视频6| 九色成人免费人妻av| 少妇高潮的动态图| 人妻少妇偷人精品九色| 国产高清激情床上av| 少妇的逼水好多| 国产精品久久久久久av不卡| 波多野结衣高清无吗| 日本三级黄在线观看| 成年女人永久免费观看视频| av福利片在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲精品国产av成人精品 | 午夜精品国产一区二区电影 | 日韩av在线大香蕉| 日本黄色视频三级网站网址| 日韩 亚洲 欧美在线| 无遮挡黄片免费观看| a级毛色黄片| 欧美bdsm另类| 午夜久久久久精精品| www.色视频.com| 亚洲美女搞黄在线观看 | 午夜精品国产一区二区电影 | 国产午夜福利久久久久久| 欧美3d第一页| 哪里可以看免费的av片| 国产精品国产高清国产av| 亚洲人与动物交配视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 午夜久久久久精精品| 九色成人免费人妻av| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 深爱激情五月婷婷| 久久久久国产网址| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美日韩综合久久久久久| 日本欧美国产在线视频| 国内精品美女久久久久久| 成人性生交大片免费视频hd| 午夜福利在线在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产黄a三级三级三级人| 国产成人一区二区在线| 国产成人a∨麻豆精品| 国产精品久久久久久久电影| 在线免费十八禁| 日韩中字成人| 人人妻人人看人人澡| 免费观看的影片在线观看| 精品人妻视频免费看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 夜夜爽天天搞| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产探花在线观看一区二区| 久久午夜福利片| 国产真实伦视频高清在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 综合色丁香网| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 久久亚洲精品不卡| 亚洲三级黄色毛片| 18禁在线播放成人免费| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 久久草成人影院| 免费av毛片视频| 中文字幕av在线有码专区| 国产精华一区二区三区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 91狼人影院|