益氣活血法對破裂型腰椎間盤突出癥大鼠組織MMP－3和MMP－7蛋白表達的影響

尤君怡，姜　宏，梁國強，劉錦濤，周紅海（．蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州　5003；．廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧　53000）

益氣活血法對破裂型腰椎間盤突出癥大鼠組織MMP－3和MMP－7蛋白表達的影響

尤君怡1，姜宏1，梁國強1，劉錦濤1，周紅海2
（1．蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州215003；2．廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530001）

［目的］觀察益氣活血方對破裂型腰椎間盤突出大鼠組織中MMP－7和MMP－3蛋白表達及血清中TXB2和PGF1α的影響，初步探討其治療作用的可能機制。［方法］建立腰椎間盤突出重吸收大鼠模型，隨機分為模型組、益氣活血方組，每組10只，另設(shè)假手術(shù)組（n＝10），假手術(shù)組及模型組灌胃純凈水，益氣活血方組灌胃相應(yīng)的藥物，干預(yù)3周后處死大鼠，測定血清中TXB2、PGF1α的含量，觀察椎間盤組織病理改變及測定MMP－3、MMP－7蛋白表達。［結(jié)果］模型大鼠經(jīng)益氣活血方治療后，其血清TXB2含量和TXB2/PGF1α比值均明顯下降，PGF1α含量升高，均呈良性變化；益氣活血方組與模型組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0．05）。益氣活血方組與模型組比較，MMP－3、MMP－7蛋白表達均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。［結(jié)論］益氣活血方治療腰椎間盤突出癥主要作用機制可能與其提高椎間盤組織MMP－3、MMP－7蛋白表達有關(guān)。

益氣活血方；腰椎間盤破裂；TXB2/PGF1α；MMP－3；MMP－7；實驗研究

目前研究認為破裂型腰椎間盤突出重吸收主要依賴于基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的表達［1－2］?；|(zhì)金屬蛋白酶－3（matrixmetalloproteinases－3，MMP－3）、基質(zhì)金屬蛋白酶－7（matrixmetalloproteinases－7，MMP－7）在椎間盤突出組織中表達明顯增高，與椎間盤突出重吸收關(guān)系密切已被證明［3－5］。本實驗觀察了吳門醫(yī)派臨床驗方“益氣活血方”對破裂型腰椎間盤突出癥大鼠血清血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）、前列腺素F1a（prostaglandin F1α，PGF1α）含量的變化及椎間盤組織MMP－3、MMP－7蛋白表達的影響，探討“益氣活血方”的可能機制。

1　實驗材料

1．1實驗動物清潔級SD雄性大鼠，體質(zhì)量（180～220 g），由昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司提供，許可證號：SCXK（蘇）2013－0003。飼養(yǎng)條件一致，室溫24±2℃，標準飼料（由蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司中心提供）飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。

1．2藥品中藥飲片：生黃芪（批號：160604）、川芎（批號：160522）、地龍（批號：160513）、防己（批號：160409）、木瓜（批號：160514）、當歸（批號：160327）、白芥子（批號：151125）、水蛭（批號：151013）、威靈仙（批號：160621）。以上中藥飲片委托蘇州市吳門醫(yī)派研究院基礎(chǔ)實驗室均購自蘇州市春輝堂飲片廠，按比例煎煮并濃縮成益氣活血方藥液（相當于1 g生藥/m l）。

1．3主要試劑與儀器戊巴比妥鈉（Sigma公司生產(chǎn)，批號：091022）、血漿血栓素B2（TXB2，上海邦奕生物科技有限公司，批號：201606）、PGF1α（上海邦奕生物科技有限公司，批號：201606）、MMP－3（Cell Signaling Technology公司，批號：0004）、MMP－7（Cell Signaling Technology公司，批號：0001）；Beta－actin（multisciences biotech公司，批號：030M4788）；二抗［HRP－山羊抗兔IgG（H+L），Cell Signaling Technology公司，批號：0004］、其他試劑均為市售分析醇。

蔡司倒置熒光顯微鏡（德國Zeiss公司，型號：Discovery．V20）、電泳儀（美國Bio－Rad公司，型號：Mini Protean 3）、凝膠成像儀（美國Bio－Rad公司，型號：GelDoc 2000）、紫外－可見酶標儀（美國MD公司，型號：SPECTRAMAX 190）、AX－26DR萬分之一分析天平：（瑞士梅特勒－托利多公司）、TG16W微量高速離心機（國產(chǎn)）等。

2　實驗方法

2．1大鼠破裂型腰椎間盤突出模型的建立參考文獻［6－8］，取SD雄性大鼠，采用戊巴比妥鈉按50mg/kg劑量腹腔注射，麻醉成功后，采用脫毛劑清除大鼠背部毛發(fā)后以橡皮筋扎住尾部。常規(guī)消毒，無菌條件下，每只切取尾椎椎間盤2個，包含上下軟骨終板。用針刺破上下終板，使髓核暴露，造成游離或破裂狀態(tài)。用7號手術(shù)線“米”字型包繞椎間盤，放入冰生理鹽水器皿中待用。然后在無菌條件下取后正中線后路切開背部皮膚、肌肉，暴露脊椎，去掉椎板。將取出尾椎椎間盤放入，逐層縫合。假手術(shù)組：成功實施麻醉后，后正中線后路切開皮膚、肌肉，暴露脊椎，去掉椎板，放入線團，逐層縫合。

2．2分組及給藥取復(fù)制成功的大鼠破裂型腰椎間盤突出模型20只，根據(jù)體質(zhì)量隨機分為2組（n＝10），益氣活血方組：造模后第2天以10 m l/kg劑量益氣活血方煎劑（相當于1 g生藥/m l）灌胃，即10 g生藥/kg（按藥理實驗方法學(xué)人與大鼠體表面積等效折算）；模型組：造模后第2天以10m l/kg劑量生理鹽水灌胃；另設(shè)假手術(shù)組（n＝10）：處理方式同模型組。第21天給藥結(jié)束后，將大鼠乙醚麻醉，股動脈取血后頸椎脫臼處死。取血后先于室溫下自然放置20min左右，3000 r/min離心10 min，分離血清，分裝后置－80℃冰箱中冰凍保存待測相關(guān)指標。大鼠處死后取出包埋的目標尾椎椎間盤，－80℃冰箱中冰凍保存待測相關(guān)指標。

2．3檢測指標及方法采用HE染色進行椎間盤神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)觀察；應(yīng)用酶聯(lián)免疫法嚴格按試劑盒說明步驟測定血清TXB2、PGF1α的含量；應(yīng)用Western Blotting法檢測組織MMP－7、MMP－3蛋白表達。

2．4統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)使用SPSS15．0軟件進行統(tǒng)計處理。實驗結(jié)果為正態(tài)分布，滿足方差齊性，以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用方差分析，當P＜0．05為差異有顯著性，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　實驗結(jié)果

3．1椎間盤神經(jīng)組織病理學(xué)觀察假手術(shù)組未見有炎性細胞浸潤和間質(zhì)水腫的現(xiàn)象，血管數(shù)量和管腔無明顯增多和擴張；模型組神經(jīng)纖維存在明顯的萎縮，并且纖維組織中出現(xiàn)不同程度的增生現(xiàn)象，間質(zhì)也出現(xiàn)水腫；益氣活血方組大部分樣本可觀察到有微血管輕度增多，同時伴有輕度纖維組織增生和少量炎性細胞浸潤，個別趨向正常。結(jié)果見圖1。

圖1　各組大鼠椎間盤神經(jīng)組織病理學(xué)觀察

3．2各組大鼠TXB2、PGF1α水平比較相對假手術(shù)組，模型組TXB2含量和TXB2/PGF1α比值均明顯升高，PGF1α含量下降，與假手術(shù)組相比有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05）。治療后，與模型組比較，益氣活血方組TXB2含量和TXB2/PGF1α比值均明顯下降，PGF1α含量升高，益氣活血方組與模型組比較有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05）。結(jié)果見表1。

表1　各組大鼠TXB2和PGF1α水平比較

表1　各組大鼠TXB2和PGF1α水平比較　

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0．05；與模型組比較，②P＜0．05

組　別　n　TXB2（ng/ml）　PGF1α（ng/m l）　TXB2/PGF1α假手術(shù)組　10　3．48±0．26　2．94±0．64　1．18±0．12模型組　10　6．10±1．08①　1．86±0．62①　3．28±0．51①益氣活血方組　10　4．18±0．62②　2．29±0．48②　1．83±0．32②

3．3各組椎間盤組織MMP－3、MMP－7蛋白含量比較各組隨機取3個椎間盤組織采用Western Blotting法檢測組織MMP－7、MMP－3蛋白表達：模型組MMP－3、MMP－7蛋白表達明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。益氣活血方組MMP－3、MMP－7蛋白表達明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。結(jié)果見表2及圖2。

表2　各組大鼠椎間盤組織MMP－3、MMP－7蛋白表達的相對定量值比較　（%x±s）

圖2　三組椎間盤組織MMP－3、MMP－7蛋白表達比較

4　討論

破裂型腰椎間盤突出癥是腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）的一種特殊形式，其病情重、手術(shù)難度大，而且發(fā)病率較高。吳門醫(yī)派是我國中醫(yī)流派中重要的流派之一。它以蘇州地區(qū)為主，涉及江南一帶的廣泛區(qū)域。其學(xué)術(shù)思想有其鮮明的特色，創(chuàng)立了溫病學(xué)說，后世吳醫(yī)更多有發(fā)揮。其中，“益氣活血”理論為臨床慢性難治性疾病的診治提供了重要的指導(dǎo)思想，遵吳門醫(yī)派醫(yī)學(xué)大家葉天士“宿疾宜緩攻”之旨，我院吳門醫(yī)派資深中醫(yī)大家姜宏教授針對破裂型腰椎間盤突出癥患者的致病特點，結(jié)合傳統(tǒng)理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)提出“益氣活血”的治療法則，以“益氣活血”法為指導(dǎo)，在經(jīng)方“防己黃芪湯”及“補陽還五湯”基礎(chǔ)上化裁而成的“益氣活血方”。在多年的臨床實踐和研究中，已經(jīng)證明其能顯著改善患者癥狀并能促進突出組織的重吸收［9－10］。

LDH重吸收和疼痛機制的血供障礙學(xué)說近年來亦被大家所認同，其相關(guān)指標TXB2、PGF1α及兩者比值與腰椎間盤突出癥之間的聯(lián)系漸成研究的熱點［11］。MMPs屬蛋白水解酶類，是降解細胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶，它幾乎能夠降解多糖以外的所有細胞外基質(zhì)成分，并能激活其他MMPs產(chǎn)生連鎖放大效應(yīng)，并且在腰椎間盤突出癥組織重吸收過程中起著重要的作用［12］。本實驗結(jié)果顯示破裂型腰椎間盤突出大鼠經(jīng)益氣活血方治療后病變程度有所改善，其作用機制可能與降低血清TXB2含量和TXB2/PGF1α比值、提高PGF1α含量以及提高目標椎間盤組織MMP－3、MMP－7蛋白表達有關(guān)。當前研究p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在破裂型腰椎間盤突出重吸收中可能處于樞紐地位，發(fā)現(xiàn)p38MAPK信號通路參與了MMPs的表達［13－15］。筆者所在的團隊針對此機制已經(jīng)開始了大量的工作，將為益氣活血法治療破裂型腰椎間盤突出提供理論依據(jù)。

［1］Genevay S，F(xiàn)inckh A，Mezin F，et al．Influence of cytokine inhibitors on concentration and activity of MMP－1 and MMP－3 in disc herniation［J］．Arthritis Res Ther，2009，11（6）：169．

［2］柳立新，張毅，顏瑞?。悄z囊對兔椎間盤退變模型基質(zhì)金屬蛋白酶的影響［J］．中國臨床藥理學(xué)雜志，2016，32（5）：440－442．

［3］周紅海，姜宏，俞振翰．益氣活血方對非破裂型腰椎間盤突出退變髓核細胞ColⅡ、Aggrecan及TIMP－1mRNA的影響［J］．南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，31（4）：368－371．

［4］劉錦濤，姜宏，王擁軍，等．大鼠破裂型椎間盤突出模型的建立及突出物重吸收機制的研究［J］．中國骨傷，2010，23（5）：370－372．

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［9］高春鵬，俞鵬飛，劉錦濤，等．姜宏教授益氣活血法治療椎間盤突出癥經(jīng)驗介紹［J］．新中醫(yī)，2016，45（5）：224－227．

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［11］鄧特偉，鄧麗麗，彭娟．申時循經(jīng)取穴針刺治療腎虛腰痛的臨床療效研究［J］．廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2016，33（4）：505－508．

［12］王顥，王永剛，周海宇．基質(zhì)金屬蛋白酶－2，3在退變頸椎間盤髓核組織中的表達及意義［J］．蘭州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2016，42（2）：68－75．

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［14］Mengshol JA，VincentiM P，Coon C I，et al．Interleukin－1 induction of collagenase 3（matrix metalloproteinase 13） gene expression in chondrocytes requires p38，c－Jun N－terminal kinase，andnuclear factor kappaB：differential regulation of collagenase 1 and collagenase 3，c－junn－terminalkinase，and nuclear factorκB［J］．Arthritis Rheum，2000，43（4）：801－811．

［15］Lacinia，Sylvester J．Inhibition of interleukin－1（AP－1）and nuclear factor kappa B（NF－KB）transcription factors downregu－lates matrix metalloproteinase gene expression in articularchondrocytes［J］．Matrix Biology，2002，21（3）：251－262．

（編輯劉強）

Effect of Yiqihuoxue Decoction on MMP－3 and MMP－7 Protein Expression in Rat Model of Ruptured Lumbar Disc

YOU Jun－yi1，JIANG Hong1，LIANGGuoqiang1，LIU Jintao1，ZHOU Honghai2
（1．Departmentof Orthopedics＆Traumatology，Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Suzhou，Jiangsu 215003；2．Guangxi Uiversity of Chinese Medicine，Naning，Guangxi530001）

Objective：［Objective］To observe the effectof yiqihuoxue decoction on MMP－3 and MMP－7 protein expressions and the content of TXB2and PGF1αin serum in ratmodel of ruptured lumbar disc，and to explore possible mechanism of therapeutic effect of the decoction preliminarily．［Methods］Reabsorption rats model of lumbar intervertebral disc were random ly divided into model group，yiqihuoxue decoction group，sham－operation group（n＝10）．The ratswere sacrificed after 3－week－intervention．The sham operation group and model group were intragastrically given purified water．Yiqihuoxue decoction group2and PGF1αin serum and the histopathological changes in intervertebral disc，aswell as the expressions of MMP－3and MMP－7 were detected．［Results］1．In plasma，the TXB2levels and TXB2/PGF1αratios were significantly decreased and the PGF1levelofmodel group was elevated after being treated with yiqihuoxue decoction．All of them showed positive variation．The P values of yiqihuoxue decoction groupwere＜0．05．There was significant differences in p values between yiqihuoxue decoction group andmodel group．2．The MMP－3 and MMP－7 protein expressions of yiqihuoxue decoction group were increased as compared with that ofmodel group．There was significant differences（P＜0．05）．［Conclusion］Themechanism of therapeutic effect of yiqihuoxue decoction group could be mainly associated with the increase of MMP－3 and MMP－7 protein expressions in intervertebral disc tissue．

corresponding drugs with intragastric adm inistration．The contents of TXB

Yiqihuoxue decoction，ruptured lumbar disc，TXB2/PGF1α，MMP－3，MMP－7，experimental study

R681．5+3

A

2095-4441（2016）03－0001－04

2016－07－28

江蘇省蘇州市科技局科研立項項目（編號：SYS201420）；蘇州市中醫(yī)醫(yī)院計劃項目（編號：KY0150）

尤君怡（1981－），男，漢族，主管中醫(yī)師，碩士，研究方向：脊柱及四肢骨折的中醫(yī)治療和現(xiàn)代手術(shù)治療、骨關(guān)節(jié)疾病及

頸肩腰腿痛等疾病的中醫(yī)針灸治療；E－mail：yousifei＠sina．com

周紅海，主任醫(yī)師，E－mail：727958064＠qq．com