口腔鱗癌腫瘤巨細胞與臨床病理因素的相關性研究*

卓姍姍張文超潘毅岳玖玲劉曉楠張華

·臨床研究與應用·

口腔鱗癌腫瘤巨細胞與臨床病理因素的相關性研究*

卓姍姍①張文超①潘毅②岳玖玲①劉曉楠①張華①

目的：探究腫瘤巨細胞（giant cancer cell，GCC）在口腔鱗癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）組織中的存在情況及其與OSCC臨床病理因素的關系。方法：回顧性分析2005年3月至2014年12月天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院76例OSCC患者的石蠟切片及臨床病理資料。H&E染色及Ki-67免疫組織化學染色下觀察GCC與普通腫瘤細胞的形態(tài)差異，計數(shù)GCC細胞，分析其與OSCC臨床生物學行為及預后的關系。結果：H&E染色下觀察到GCC存在于OSCC中，且Ki-67在GCC中均呈陽性表達。GCC細胞數(shù)與臨床分期（P=0.02）、組織學分級（P＜0.01）、化療（P=0.01）及局部復發(fā)（P=0.02）均顯著相關。GCC細胞數(shù)在不同性別和年齡的患者中差異不大，且與淋巴結轉移、遠處轉移無關（P＞0.05）。GCC數(shù)目＞3個/HP的OSCC患者預后較差（P＜0.05）。結論：GCC可能在OSCC發(fā)展過程及耐藥中起重要作用，可能是影響OSCC預后的重要因素。

腫瘤巨細胞 口腔鱗癌 化療 復發(fā) 預后

Correspondence to:Wenchao ZHANG;E-mail:zwbeyond_999@sina.com

1Department of Maxillofacial ENT,2Department of Pathology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Tianjin 300060,China

This work was supported by the National Key Clinical Specialist Construction Programs of China(No.2013-544)

口腔鱗癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）占口腔惡性腫瘤的90%左右［1］，目前OSCC治療手段仍以手術為主，輔以放療和化療，患者5年生存率在50%～60%之間［2］；影響OSCC預后的因素諸多，但目前尚未找到有效改善OSCC預后的突破點。已有研究表明，腫瘤干細胞的存在是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要影響因素，但其鑒定標準不一，分離難度大［3-4］。近年來有學者在體外分離出一種特殊的腫瘤細胞——腫瘤巨細胞（giant cancer cell，GCC）［5］（有文獻將含有多倍體的這類細胞又稱為多倍體GCC［6］），此類細胞具有不均分裂、多向分化等干細胞特性，與腫瘤異質性相關，存在于多種腫瘤組織，影響腫瘤的預后，認為是腫瘤發(fā)生發(fā)展、耐藥及侵襲轉移的根源［5-9］。其分離純化相對容易，為探究腫瘤的發(fā)生發(fā)展開辟新的途徑。目前鮮有報道GCC在OSCC組織中存在與否及其與OSCC的相關研究。本研究通過收集OSCC臨床及病理資料，分析GCC在OSCC生物學行為及預后方面的判斷價值。

1 材料與方法

1.1病例資料

回顧性分析天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院2005年3月至2014年12月經(jīng)手術切除后病理確診為OSCC的76例病例資料，其中男性51例，女性25例。臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者共39例，Ⅲ～Ⅳ期共37例。23例有淋巴結轉移，53例無淋巴結轉移。根據(jù)角化程度、細胞核異型性、有絲分裂程度和鱗狀分化程度將其分為高分化（G1）、中分化（G2）和低分化（G3）3類，其中44例為G1，23例為G2，9例為G3。23例行術前誘導化療（其中4例為Ⅰ～Ⅱ期患者），53例未行術前誘導化療。

1.2方法

1.2.1GCC計數(shù)根據(jù)文獻報道，細胞核體積是普通腫瘤細胞3倍以上或含有多個細胞核的細胞為GCC，且其細胞核形態(tài)不規(guī)則［10-11］。本研究分別于100倍和400倍顯微鏡下觀察GCC并拍照，400倍鏡下隨機選取5個視野計數(shù)GCC，取其平均數(shù)作為計數(shù)結果。

1.2.2主要試劑與方法鼠抗人Ki-67單克隆抗體（克隆號：8D5），及DAB顯色試劑盒（購自武漢博士德生物工程有限公司），S-P試劑盒（購自北京中杉金橋生物技術有限公司）。標本常規(guī)固定，石蠟包埋，切片，高壓修復抗原，免疫組織化學法染色，操作步驟按免疫組織化學試劑盒說明書進行，DAB顯色。腫瘤組織中以棕黃色或黃褐色為Ki-67陽性表達，于400倍顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3分析比較GCC和臨床生物學行為的關系t檢驗及單因素ANOVA比較GCC數(shù)目與性別、年齡、臨床分期、組織學分級、術前誘導化療、淋巴結轉移、局部復發(fā)、遠處轉移及OSCC預后的關系。多因素分析影響OSCC預后的獨立因素。

1.2.4隨訪及預后指標治療結束后，2年內(nèi)每3個月隨訪1次，2年后每6個月隨訪1次，5年后每年隨訪1次或臨床需要時。總生存期（overall survival，OS）及無病生存期（disease-free survival，DFS）自手術日期開始計算，OS截止至死亡或末次隨訪時間，DFS截止至腫瘤復發(fā)、轉移、死亡或末次隨訪時間。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，描述性分析采用病例數(shù)和百分比表示，計量資料采用x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素ANOVA。單因素生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗，多因素生存分析采用Cox回歸模型。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1OSCC中GCC形態(tài)及其與臨床生物學行為的關系

H&E染色下在不同組織學分級的OSCC組織中觀察到GCC，其細胞核體積大或含有多個細胞核，細胞核形態(tài)不規(guī)則，可呈啞鈴型、分葉狀等多種不規(guī)則形態(tài)，可見多個核仁。且組織學分級越高，GCC數(shù)目越多，異型性越來越明顯。Ki-67免疫組織化學染色驗證實驗示：Ki-67在OSCC胞核中部分陽性表達，在GCC細胞核中均呈陽性，其細胞核形態(tài)特征較H&E染色下更為明顯（圖1）。400倍鏡下計數(shù)OSCC組織中GCC數(shù)量為0～17個，平均細胞數(shù)為2.34個（圖2）。

圖1　不同組織學分級的口腔鱗癌組織中的腫瘤巨細胞Figure 1Giant cancers cell in oral squamous cell carcinoma with different histologic grades

圖2　Ki-67在腫瘤巨細胞細胞核呈陽性表達（H&E×400）Figure 2Positive expression of Ki-67 in giant cancer cells(H&E×400)

臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期患者組織中GCC數(shù)目（2.83± 1.85）個，明顯多于Ⅰ～Ⅱ期的患者（1.81±1.76）個，（P= 0.02）；不同組織學分級GCC數(shù)目為G1：（1.65±1.60）個；G2：（2.89±1.53）個；G3：（4.36±2.10）個，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；誘導化療組GCC數(shù)目（2.64±2.00）個，明顯多于未行誘導化療組（1.64±1.30）個，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.01）；復發(fā)組（3.30±2.13）個明顯多于未復發(fā)組（2.00±1.66）個，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.02）。GCC數(shù)目在不同性別和年齡的患者差異不大，且與淋巴結轉移及遠處轉移無關（P＞0.05，表1）。

2.2預后情況

隨訪76例口腔癌患者，20例發(fā)生復發(fā)，10例發(fā)生遠處轉移。隨訪生存期為1月至112個月，平均生存期為55.4個月。3年OS為74.7%，5年OS為69.5%。3年DFS為68.3%，5年DFS為64.8%。Kaplan-Meier單因素生存分析及Log-rank檢驗結果顯示：臨床分期（P＜0.001）、淋巴結轉移（P=0.023）、組織學分級（P=0.049）、局部復發(fā)（P=0.020）及遠處轉移（P＜0.001）和OS相關；臨床分期（P=0.002）、淋巴結轉移（P=0.026）、局部復發(fā)（P＜0.001）及遠處轉移（P＜0.001）和DFS相關。術前誘導化療不能改善OS和DFS（P＞0.05）。因臨床分期為晚期、組織學分化較低、誘導化療及復發(fā)組GCC平均數(shù)均接近3個/HP，故以GCC數(shù)目3/HP作為分組標準，Kaplan-Meier單因素生存分析結果示：GCC數(shù)目＞3個/HP組OS（53.5%）和DFS（46.8%）明顯較GCC數(shù)目≤3個/HP組OS（58.4%）和DFS（51.6%）者差，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.033，P=0.019，表2，圖3）。

Cox回歸模型分析結果顯示：臨床分期（P＜0.001）、局部復發(fā)（P=0.029）和遠處轉移（P=0.004）是影響OSCC患者OS的獨立預后因素；臨床分期（P= 0.002）、局部復發(fā)（P=0.014）和轉移（P＜0.001）是影響OSCC患者DFS的獨立預后因素（表3，4）。

表1　76例口腔鱗癌患者的基線資料以及腫瘤巨細胞與OSCC臨床生物學行為的關系Table 1Baseline characteristics of 76 patients with oral squamous cell carcinoma and correlation between giant cancer cells and clinical biological behavior

表1　76例口腔鱗癌患者的基線資料以及腫瘤巨細胞與OSCC臨床生物學行為的關系（續(xù)表1）Table 1Baseline characteristics of 76 patients with oral squamous cell carcinoma and correlation between giant cancer cells and clinical biological behavior

表2　OSCC患者總生存率和無病生存率的Kaplan-Meier單因素分析Table 2Overall survival and disease-free survival results of Kaplan-Meier analysis

圖3　腫瘤巨細胞數(shù)與OSCC患者預后的Kaplan-Meier單因素分析Figure 3Correlation between number of giant cancer cells and prognosis of patients with OSCC

表3　OSCC患者總生存率的Cox回歸分析Table 3Overall survival results of Cox-regression analysis

表4　OSCC患者無病生存率的Cox回歸分析Table 4Disease-free survival results of Cox-regression analysis

3 討論

腫瘤干細胞被認為是影響腫瘤發(fā)生發(fā)展、耐藥侵襲及轉移的根源，然而其分離純化難度大，嚴重阻礙其在腫瘤發(fā)生發(fā)展等方面的研究進程。GCC作為腫瘤干細胞樣細胞，可能成為研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的重要突破點。文獻報道乳腺癌細胞、卵巢癌細胞、鼻咽癌細胞及結腸癌細胞來源的GCC參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及耐藥，并且在卵巢癌和惡性膠質瘤組織中發(fā)現(xiàn)GCC［5，12-15］，本研究通過觀察OSCC組織切片結合文獻定義發(fā)現(xiàn)GCC存在于OSCC組織中。

Ki-67是表達于增殖細胞核的一種非組蛋白性核蛋白，與細胞增殖密切相關，其在惡性膠質瘤GCC中表達均呈陽性［16］。為進一步驗證GCC細胞核形態(tài)特征，本研究對OSCC組織切片行Ki-67免疫組織化學染色，結果提示在OSCC中，Ki-67在普通OSCC細胞核部分表達，而在GCC細胞核均呈陽性表達；且可見GCC細胞核巨大或含有多個核，形態(tài)不規(guī)則，可呈分葉狀和啞鈴狀等多種形態(tài)，提示與普通腫瘤細胞相比，GCC增殖潛能更大，可能是導致OSCC復發(fā)的重要因素。Qu等［15］報道GCC數(shù)量多少與惡性膠質瘤的分期、血管擬態(tài)的形成相關；也有學者發(fā)現(xiàn)在漿液性卵巢腫瘤組織中存在GCC，并指出GCC的多少與其組織學分級相關［17］。本研究顯示OSCC組織中Ⅲ～Ⅳ期GCC數(shù)目多于Ⅰ～Ⅱ期，分化好者明顯多于分化差者，差異均具有統(tǒng)計學意義，GCC數(shù)目與OSCC臨床分期和組織學分級均相關；而臨床分期和組織學分級均與OSCC預后相關；Cox回歸模型結果中，臨床分期是影響OSCC預后的獨立因素，提示GCC可能與OSCC預后相關。

Ki-67免疫組織化學結果提示GCC可能是導致腫瘤復發(fā)的重要因素，本研究發(fā)現(xiàn)復發(fā)組的GCC數(shù)目明顯多于未復發(fā)組，這為GCC可能是促進OSCC復發(fā)的重要因素提供臨床依據(jù)。GCC相比普通的腫瘤細胞增殖潛能大，腫瘤切除術后殘存的少數(shù)GCC可能通過增殖促進腫瘤的復發(fā)。本研究Cox回歸模型結果示復發(fā)是影響OSCC預后的獨立因素。近年來，部分文獻也已將局部復發(fā)作為判斷OSCC預后的標準［18-19］，暗示GCC可能和預后相關。

本研究結果與文獻報道均表明，術前誘導化療并不能改善OSCC整體生存率［4］，其具體原因不詳，但有實驗將腫瘤細胞用化療藥物（如紫杉醇、順鉑等）作用后可誘導GCC形成，GCC通過出芽、裂殖等方式產(chǎn)生子代腫瘤細胞，其子代細胞對化療藥物的抵抗能力增強［12，20］。本研究推測GCC可能是導致術前誘導化療不能改善OSCC預后的重要原因，通過比較行術前誘導化療組（多西他賽+順鉑+5-FU）和未行誘導化療組的GCC數(shù)目，發(fā)現(xiàn)化療組GCC數(shù)目明顯多于未化療組。腫瘤細胞經(jīng)過誘導化療后可能會形成GCC，GCC增殖產(chǎn)生耐藥的子代腫瘤細胞，從而導致誘導化療難以改善OSCC患者的預后。但值得注意的是，一方面行誘導化療的多為局部晚期（Ⅲ～Ⅳ期）患者，而本研究結果已顯示局部晚期OSCC患者GCC數(shù)目相對較多，這可能會使評價誘導化療與GCC數(shù)目關系產(chǎn)生偏差，有待進一步的細胞學實驗證實二者關系；另一方面相對早期及分級較好的患者，腫瘤異質性小，加之術前未行誘導化療，可能導致部分患者組織切片中無GCC形成，即：觀察結果為GCC數(shù)目為0。GCC與OSCC臨床分期、組織學分級、化療和復發(fā)相關，以上幾項均為OSCC重要的預后因素，本研究推測GCC可能與OSCC預后相關，然而目前尚無文獻對GCC與臨床生存相關關系的直接分析。本研究發(fā)現(xiàn)GCC數(shù)目＞3個/HP組的患者OS及DFS明顯較GCC數(shù)目≤3個/HP組差，提示GCC不僅影響OSCC的生物學行為，更是影響OSCC預后的重要因素。然而，在Cox回歸模型中，GCC數(shù)目＞3個/ HP并不足以成為影響OSCC預后的獨立因素，這可能由于樣本量的原因或分組因素的影響，有待進一步大樣本統(tǒng)計分析。

綜上所述，GCC存在于OSCC組織中，且與臨床分期、組織學分級、誘導化療和局部復發(fā)相關，可能是影響OSCC預后的重要因素。GCC在OSCC的發(fā)展及耐藥中可能發(fā)揮重要作用。

[1]Warnakulasuriya S.Global epidemiology of oral and oropharyngeal cancer[J].Oral Oncol,2009,45(4/5):309-316.

[2]Zhong LP,SUN J,GUO W,et al.Survival analysis of 256 patients with oral cancer[J].Chin J Clin Oncol,2015,42(4):217-222.[鐘來平,孫堅,郭偉,等.256例局部晚期口腔癌的生存分析[J].中國腫瘤臨床,2015,42(4):217-221.]

[3]Fillmore CM,Gupta PB,Rudnick JA,et al.Estrogen expands breast cancer stem-like cells through paracrine FGF/Tbx3 signaling[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(50):21737-21742.

[4]Fornari C,Balbo G,Halawani SM,et al.A versatile mathematical work-flow to explore how Cancer Stem Cell fate influences tumor progression[J].BMC Syst Biol,2015,9(Suppl 3):S1.

[5]Jiang Q,Zhang Q,Wang S,et al.A fraction of CD133+CNE2 cells is made of giant cancer cells with morphological evidence of asymmetric mitosis[J].J Cancer,2015,6(12):1236-1244.

[6]Heppner GH.Tumor heterogeneity[J].Cancer Res,1984,44(6): 2259-2265.

[7]Malpica A,Deavers MT,Lu K,et al.Grading ovarian serous carcinoma using a two-tier system[J].Am J Surg Pathol,2004,28(4):496-504.

[8]Polyak K.Heterogeneity in breast cancer[J].J Clin Invest,2011,121 (10):3786-3788.

[9]Wolberg WH,Street WN,Mangasarian OL.Importance of nuclear morphology in breast cancer prognosis[J].Clin Cancer Res,1999,5 (11):3542-3548.

[10]Zhang D,Wang Y,Zhang S.Asymmetric cell division in polyploid giant cancer cells and low eukaryotic cells[J].Biomed Res Int,2014, 2014(11):432652.

[11]Zhang S,Mercado-Uribe I,Xing Z,et al.Generation of cancer stemlike cells through the formation of polyploid giant cancer cells[J]. Oncogene,2014,33(1):116-128.

[12]Zhang S,Mercado-Uribe I,Liu J.Tumor stroma and differentiated cancer cells can be originated directly from polyploid giant cancer cells induced by paclitaxel[J].Int J Cancer,2014,134(3):508-518.

[13]Zhang S,Mercado-Uribe I,Liu J.Generation of erythroid cells from fibroblasts and cancer cells in vitro and in vivo[J].Cancer Lett, 2013,333(2):205-212.

[14]Lopez-Sanchez LM,Jimenez C,Valverde AA,et al.CoCl2,a mimic of hypoxia,induces formation of polyploid giant cells with stem characteristics in colon cancer[J].PLoS One,2014,9(6):e99143-99153.

[15]Qu Y,Zhang L,Rong Z,et al.Number of glioma polyploid giant cancer cells(PGCCs)associated with vasculogenic mimicry formation and tumor grade in human glioma[J].J Exp Clin Cancer Res,2013, 32(1):75.

[16]Lv H,Shi Y,Zhang L,et al.Polyploid giant cancer cells with budding and the expression of cyclin E,S-phase kinase-associated protein 2, stathmin associated with the grading and metastasis in serous ovarian tumor[J].BMC Cancer,2014,14(1):1-9.

[17]Zhang L,Ding P,Lv H,et al.Number of polyploid giant cancer cells and expression of EZH2 are associated with VM formation and tumor grade in human ovarian tumor[J].Biomed Res Int,2014,2014 (6):751-759.

[18]Anderson CR,Sisson K,Moncrieff M.A meta-analysis of margin size and local recurrence in oral squamous cell carcinoma[J].Oral Oncol,2015,51(5):464-469.

[19]Ermer MA,Kirsch K,Bittermann G,et al.Recurrence rate and shift in histopathological differentiation of oral squamous cell carcinoma-A long-term retrospective study over a period of 13.5 years[J]. J Craniomaxillofac Surg,2015,43(7):1309-1313.

[20]Jia L,Zhang S,Ye Y,et al.Paclitaxel inhibits ovarian tumor growth by inducing epithelial cancer cells to benign fibroblast-like cells[J]. Cancer Lett,2012,326(2):176-182.

（2016-06-08收稿）

（2016-09-08修回）

（編輯：孫喜佳校對：鄭莉）

卓姍姍專業(yè)方向為腫瘤學。

E-mail：zhuoshanshanxx@126.com

Correlation of giant cancer cells in human oral squamous cell carcinoma with clinicopathological characteristics

Shanshan ZHUO1,Wenchao ZHANG1,Yi PAN2,Jiuling YUE1,Xiaonan LIU1,Hua ZHANG1

Objective:To detect giant cancer cells in human oral squamous cell carcinoma(OSCC)and elucidate their correlation with OSCC clinicopathological characteristics.Methods:Tumor paraffin sections and clinicopathological information of 76 OSCC cases were collected from Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital.Morphological differences between giant cancer cells and normal-sized cancer cells were observed under H&E staining and Ki-67 immunohistochemistry staining,respectively.The number of giant cancer cells was counted under a microscope(×400).The association between the number of giant cancer cells and the biological behavior of OSCC was analyzed.Results:Giant cancer cells were observed in OSCC tissues,and these cells were positive for Ki-67 staining.The number of giant cancer cells was closely associated with clinical stage(P=0.02),histological grade(P＜0.01),chemotherapy(P= 0.01),and local recurrence(P=0.02).By contrast,the number of giant cancer cells was not associated with sex,age,and lymphatic and distant metastases in OSCC(P＞0.05).Patients with more than 3/HP giant cancer cells retained poor prognosis(P＜0.05).Conclusion:Giant cancer cells may play an important role in the progression,chemotherapeutic resistance,and prognosis of OSCC.

giant cancer cells,OSCC,chemotherapy,recurrence,prognosis

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.20.684

①天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院頜面耳鼻喉腫瘤科，國家腫瘤臨床研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心（天津市300060）；②病理科

*本文課題受國家臨床重點?？平ㄔO項目（編號：2013-544）資助

張文超zwbeyond_999@sina.com