重癥監(jiān)護病房醫(yī)院感染耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌耐藥基因的研究與分析

陳　璐，李凌竹，冷應蓉，查筑紅，程永素，黃　冰，羅光英，王　敏，江銀輝（貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院感染管理科，貴州貴陽 550004）

重癥監(jiān)護病房醫(yī)院感染耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌耐藥基因的研究與分析

陳璐，李凌竹，冷應蓉，查筑紅，程永素，黃冰，羅光英，王敏，江銀輝（貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院感染管理科，貴州貴陽 550004）

目的：通過分析菌株耐藥性和耐藥基因檢出情況，了解我院醫(yī)院感染耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）的流行病學特點，并探討耐藥機制，為臨床合理選藥提供參考。方法：篩選重癥監(jiān)護病房醫(yī)院感染患者送檢標本分離的CRAB，采用PCR擴增技術檢測菌株是否攜帶OXA-23、TEM、SHV、VEB、CARB、DHA、VIM、IMP、PER、aac(3)-I、aac(6')-Ib、aph(3')-I、armA、sul1和sul2基因。結果：53株醫(yī)院感染CRAB對復方新諾明、妥布霉素較敏感，對其余13種抗菌藥物耐藥率均達50%以上，基因檢出率依次為：TEM 100%，OXA-23 96.23%，armA 90.57%，aac(6')-Ib 22.64%，aac(3)-I 26.42%，aph(3')-I 73.58%，sul1 30.19%，sul2 56.60%，SHV 3.77%，VEB、CARB、DHA、IMP、VIM、PER未檢出。共14組耐藥基因檢出與耐藥情況完全相同的菌株。結論：我院醫(yī)院感染CRAB的患者仍可考慮選用復方新諾明和妥布霉素進行治療。我院定居并繁殖的CRAB耐β-內酰胺類抗菌藥物的機制可能與TEM酶密切相關，攜帶OXA-23基因可能是耐碳青霉烯類抗菌藥物的重要因素，檢出率低的耐藥基因可能在耐β-內酰胺類抗菌藥物機制中的作用不大。我院不僅存在科室內部的交叉感染，而且存在科室之間的交叉感染，應加大力度做好感染控制工作。

耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌；耐藥；耐藥基因；醫(yī)院感染

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）已成為我國院內感染的主要致病菌之一，2014年中國CHINET細菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，我國17所教學醫(yī)院鮑曼不動桿菌占臨床分離革蘭陰性菌的14.23%，僅次于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌[1]。廣譜抗菌藥物的大量運用使鮑曼不動桿菌耐藥形勢嚴峻，耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）的比例逐年增高，細菌對碳青霉烯類耐藥即意味著對其他抗菌藥物基本耐藥[2]。重癥監(jiān)護病房收治的患者免疫力低下、侵入性操作多，并長期使用各類廣譜抗菌藥物，感染CRAB的患者較多見。本研究重點考察重癥監(jiān)護病房醫(yī)院感染患者所分離CRAB的耐藥性，初步了解我院醫(yī)院感染CRAB的流行病學特點，并探討耐藥性與耐藥基因的關聯(lián)性，以期為分子生物學研究及臨床合理用藥提供理論參考。

1　材料和方法

1.1菌株來源

53株CRAB分離源自2014年1月– 2015年5月貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院重癥監(jiān)護病房（ICU）醫(yī)院感染患者不同來源的標本（剔除同一患者同部位的重復標本）。醫(yī)院感染判斷標準遵循《醫(yī)院感染診斷標準》并結合臨床實際情況。

1.2細菌分離鑒定及藥敏試驗

采用美國德靈Microscan WalkAway 4.0系統(tǒng)對病原菌進行鑒定及藥敏試驗。質控菌株標準菌株PAE ATCC 27853購自貴州省臨床檢驗中心。藥敏紙片購自英國Oxoid公司。檢測菌株對阿米卡星、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢吡肟、慶大霉素、左氧氟沙星、美羅培南、哌拉西林、頭孢哌酮/舒巴坦、復方新諾明、替卡西林/克拉維酸、四環(huán)素、妥布霉素的敏感性。結果判定依據(jù)臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）制定的標準。

1.3細菌處理

挑純培養(yǎng)菌，取1 mL細菌LB培養(yǎng)液于1.5 mL離心管內，離心（12 000 r·min-1）1 min去上清，用1 mL無菌蒸餾水重新懸浮細菌沉淀，離心（12 000 r·min-1）1 min去上清，加蛋白酶K（200 ng·mL-1）溶液500 μL，56 ℃水浴2 h，然后于沸水中水浴10 min，離心（12 000 r·min-1）1 min，取上清液即為基因檢測的模板液，于– 20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4基因檢測

采用PCR法檢測15個耐藥基因，PCR儀為ABI2700型。引物序列根據(jù)數(shù)據(jù)庫NCBI（www.ncbi. nlm.nih.gov/nucleotide）各基因序列完成設計，靶基因序列登錄號、引物序列及目的產物長度見表1。各反應體系為20 μL：上下游引物各l μL（10 μmol·L-1），dNTP 2 μL （2 mmol·L-1），10倍PCR緩沖液（含Mg2+）2 μL，TaqDNA 聚合酶1 U（不計體積），超純水12 μL，模板液2 μL。PCR擴增熱循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預變性3 min，然后95 ℃ 30 s →55 ℃ ～ 62 ℃（根據(jù)引物的退火溫度）30 s → 72 ℃ 60 s，循環(huán)33個周期，最后72 ℃延長5 min。產物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)為英國Syngene公司的 G-BOX。

2　結果

2.1一般情況

53株CRAB中，急診ICU 11株，綜合ICU 26株，內科ICU 9株，神經(jīng)ICU 6株，兒科ICU 1株；男性35株（66.04%），女性18株（33.96%）。詳見表2。

表1　耐藥基因PCR引物序列[3]Tab 1　PCR primer sequence of drug-resistant genes[3]

表2　CRAB的分類檢出情況Tab 2　The classification about the detection of CRAB

2.2耐藥情況分布

本研究檢測了53株醫(yī)院感染CRAB對15種抗菌藥物的耐藥情況，詳見表3。

表3　53株醫(yī)院感染CRAB的藥敏特點分布情況Tab 3　Distribution of the drug-sensitive characteristics of 53 strains of nosocomial acquired CRAB

2.3耐藥基因檢測情況分布

對妥布霉素敏感的16株CRAB，氨基糖苷類修飾酶基因檢出：armA（81.25%，13/16），aph(3')-I（75.00%，12/16），aac(3)-I（6.25%，1/16），aac(6')-Ib（0/16）。對復方新諾明敏感的33株CRAB，磺胺耐藥基因檢出：sul1（9.09%，3/33），sul2（48.48%，16/33）。詳見表4。

表4　53株醫(yī)院感染CRAB的耐藥基因檢測分布情況Tab 4　Distribution of the detection results of drug-resistant genes of 53 strains nosocomial acquired CRAB

2.4耐藥基因檢出與耐藥情況對比研究

共14組（每組2株細菌）耐藥基因檢出與耐藥情況完全相同的菌株，其中綜合ICU 9組、神經(jīng)ICU 2組、急診ICU 2組和內科ICU 1組。14組CRAB中，住院日期無交叉的有內科ICU組（16號2014-03-28入院，2014-05-14出院；37號2014-06-01入院，2014-07-07出院）；綜合ICU組（17號2014-04-23入院，2014-07-31出院；81號2015-01-02入院，2015-01-31出院；88號2015-01-16入院，2015-04-13出院；92號2014-10-22入院，2014-11-03出院）。不同ICU耐藥基因檢出與耐藥情況完全相同的菌株排列詳見表5。

3　討論

綜上，本研究結果提示，男性感染CRAB多于女性。鮑曼不動桿菌院內感染最常見的部位是肺部，是醫(yī)院獲得性肺炎尤其是呼吸機相關性肺炎重要的致病菌[4]，CRAB多分離自痰標本，考慮與重癥監(jiān)護病房患者多使用呼吸機相關。60歲以上老年人送檢痰標本分離率最高，分析原因是由于老年患者呼吸器官退化，呼吸功能及咳嗽反射減弱，肺組織彈性減弱等導致排痰功能降低，更易在醫(yī)院內感染CRAB引起肺炎。

本研究結果表明，CRAB除對復方新諾明、妥布霉素較敏感外，對其余13種抗菌藥物耐藥率均達50%以上（見表3），耐藥形勢嚴峻。本院獲得的CRAB仍可考慮選用復方新諾明和妥布霉素進行治療,與湖北黃石、蘇州、廣東省中山市的報道結果并不一致[5-7]。產生抗菌藥物滅活酶是鮑曼不動桿菌耐藥的重要機制[2]，產酶與攜帶耐藥基因相關。53株CRAB對β-內酰胺類抗菌藥物均耐藥，同時所有菌株均攜帶TEM基因，故我院定居并繁殖的CRAB耐β-內酰胺類抗菌藥物的機制可能與TEM酶密切相關。有研究[8]曾證明OXA-23型碳青霉烯酶在鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥中起著重要作用。攜帶OXA-23基因可能是本院鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯類抗菌藥物的重要因素。SHV檢出低，VEB、CARB、DHA、IMP、VIM、PER均未檢出，檢出率低的耐藥基因可能在本院分離CRAB耐β-內酰胺類抗菌藥物機制中的作用不大。研究氨基糖苷類修飾酶基因和磺胺耐藥基因發(fā)現(xiàn)，對妥布霉素敏感的CRAB高檢出armA、aph(3')-I，低檢出aac(3)-I、aac(6')-Ib，對復方新諾明敏感的CRAB高檢出sul2，低檢出sul1，其關聯(lián)性有待進一步探討。

表5　各ICU耐藥基因和藥敏特點相同的菌株分布情況Tab 5　Distribution of the same drug resistance gene and drug sensitive characteristics of strains in each ICU department

考慮耐藥情況和耐藥基因檢出完全一致的菌株可能具有同源性，提示我院不僅存在科室內部的交叉感染，且存在科室間的交叉感染，尤其是內科ICU和綜合ICU存在長期定植菌，說明臨床的清潔消毒工作不徹底，科室之間傳播的流行病學特點值得深入研究。

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The study and analysis of drug resistance genes of nosocomial infection CRAB in ICU

CHEN Lu,LI Ling-zhu,LENG Ying-rong,ZHA Zhu-hong,CHENG Yong-su,HUANG Bing,LUO Guang-ying,WANG Min,JIANG Yin-hui(The Infection Control Section of Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China)

Objective: To analyze the situation of antimicrobial resistance,related resistance genes and possible mechanism,and provide references for rational antimicrobial application and discover the epidemiological characteristics of CRAB in our hospital. Methods: PCR techniques were used to test OXA-23,TEM,SHV,VEB,CARB,DHA,VIM,IMP,PER,aac(3)-I,aac(6')-Ib,aph(3')-I,armA,sul1 and sul2 genes. Results: In addition to SMZ-TMP and tobramycin,resistant rate to 13 antibiotics were all over 50%. The detection rate of gene were TEM 100%,OXA-23 96.23%,armA 90.57%,aac(6')-Ib 22.64%,aac(3)-I 26.42%,aph(3')-I 73.58%,sul1 30.19%,sul2 56.60% and SHV 3.77%. VEB,CARB,DHA,IMP,VIM and PER were not detected. There were 14 bacterial groups which had the same drug resistance and drug resistance gene. Conclusion: SMZ-TMP and tobramycin can be used to cure the CRAB infected patients. The TEM gene may be closely related to β-lactams resistance. The OXA-23 may be a crucial factor for carbapenems resistance. Those genes with low detection rate may not play a big role in drug resistant mechanism. There are cross infection in the same department and among departments in our hospital,infection control should be strengthened.

Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii; Drug resistance; Drug resistance gene; Nosocomial infection

R978.1

A

1672 - 8157(2016)01 - 0052 - 04

貴州省科技計劃項目（黔科合SY字2013-3176號）

冷應蓉，女，主任技師，主要從事醫(yī)院感染管理。E-mail：49728467@qq.com

陳璐，女，主治醫(yī)師，主要從事病原菌耐藥機制研究。E-mail：49728467@qq.com

（2015-10-11

2015-12-16）