肺癌伴惡性胸腔積液中EGFR突變檢測及其臨床意義

田野，王園，劉思洋，姜文軍，田大力

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院胸心外科，沈陽 110032）

·論著·

肺癌伴惡性胸腔積液中EGFR突變檢測及其臨床意義

田野，王園，劉思洋，姜文軍，田大力

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院胸心外科，沈陽 110032）

目的 探討和分析EGFR基因突變與肺癌伴惡性胸腔積液的生物學(xué)行為之間的關(guān)系，研究其臨床意義。方法 通過檢測30例Ⅳ期肺癌患者在伴有和不伴有惡性胸腔積液的情況下腫瘤組織內(nèi)EGFR基因的突變情況，分析和探討EGFR基因突變與惡性胸腔積液的生物學(xué)行為之間可能存在的關(guān)系。結(jié)果 肺癌伴惡性胸腔積液組EGFR的突變率高于肺癌不伴惡性胸腔積液組，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 肺癌伴惡性積液患者EGFR基因的突變率高于肺癌不伴惡性胸腔積液患者，EGFR突變與肺癌伴惡性胸腔積液患者的生物學(xué)行為之間存在相關(guān)性，靶向治療可能作為此類患者的一種治療選擇，改善生存率及生活質(zhì)量。

肺癌；惡性胸腔積液；EGFR突變

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是表皮生長因子細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體，屬于酪氨酸激酶型受體。EGFR在惡性腫瘤中常常過表達(dá)，與配體激活后其信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)能產(chǎn)生多種效應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、分化、血管生成、轉(zhuǎn)移以及抗凋亡作用［1］，因此在腫瘤的形成方面起到了非常重要的作用。近年來隨著EGFR的深入研究，以EGFR為靶點(diǎn)的治療為肺腫瘤患者提供了一個(gè)新途徑，如特異性作用于EGFR激酶區(qū)的小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs），包括吉非替尼和厄洛替尼。但臨床發(fā)現(xiàn)肺癌患者對TKIs類藥物的反應(yīng)性存在明顯差異，其敏感性與EGFR基因的突變狀態(tài)密切相關(guān)［2］，最常見的突變?yōu)?9號外顯子缺失突變和21號外顯子點(diǎn)突變，占所有突變的85%～90%［3］。

惡性胸腔積液（malignant pleural effusion，MPE）是腫瘤晚期最常見的并發(fā)癥之一。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，約有75%的MPE來源于肺癌、乳腺癌、卵巢癌及淋巴瘤，轉(zhuǎn)移性肺腺癌為最常見的病理類型。伴發(fā)MPE的肺癌患者臨床上已屬于Ⅳ期，它可以引起進(jìn)行性呼吸困難、咳嗽、胸痛等臨床癥狀，對肺癌患者來說意味著較差的預(yù)后和較高的死亡率［4］。因此，有效控制MPE有著重要的臨床意義。

目前針對MPE的治療手段主要包括穿刺放液和腔內(nèi)置管閉式引流、藥物治療、外科治療，但效果有限。近年來靶向藥物的興起，為中晚期肺癌治療提供了新的手段。研究表明，EGFR基因檢測有突變的患者，在經(jīng)過不間斷服用基因靶向藥物（TKIs類藥物）后，絕大部分患者可以有效地控制MPE，明顯提高生活質(zhì)量，且隨診中發(fā)現(xiàn)可以很好的控制疾病進(jìn)展，很少再次出現(xiàn)胸腔積液［5］。為了探討肺癌并發(fā)MPE與EGFR基因突變之間的關(guān)系，本文首次提出檢測Ⅳ期肺癌并發(fā)MPE患者的胸膜組織內(nèi)EGFR基因突變情況，旨在找出EGFR基因突變情況與MPE的關(guān)系，從而進(jìn)一步分析MPE的形成機(jī)制，同時(shí)也為MPE的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2013年1月至2014年7月于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院住院的Ⅳ期肺癌伴胸腔積液患者12例（MPE組），同時(shí)選擇Ⅳ期肺癌不伴胸腔積液患者18例作為對照（非MPE組）；其中男性14例，女性16例，中位年齡63（42～84）歲，有吸煙史11例，無吸煙史19例，全部患者均病理證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌，均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集：MPE組病例均經(jīng)胸腔鏡取胸膜轉(zhuǎn)移癌組織，病理證實(shí)均為腺癌。非MPE組病例均經(jīng)皮肺穿刺取癌組織，病理證實(shí)16例為腺癌，2例為非小細(xì)胞肺癌。所取標(biāo)本均經(jīng)10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，備用。

1.2.2 適時(shí)熒光定量PCR-HRM法檢測基因突變：所得標(biāo)本送至蘇州科諾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR-HRM法對EGFR基因外顯子18、19、20、21檢測。PCR-HRM檢測原理：在一定溫度范圍內(nèi)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性并實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號，熒光值隨溫度變化即溶解曲線；每一段DNA都有其獨(dú)特序列，因而也有其獨(dú)特的溶解曲線形狀，與DNA指紋圖譜一樣，具有很高的特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.2.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：將待測EGFR基因DNA提取物進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性，所得溶解曲線與陰性樣品對照，若二者曲線高度吻合，則判讀為突變陰性（圖1），若二者曲線不吻合，則判讀為突變陽性（圖2）。

圖1 EGFR21外顯子突變陰性熔解曲線圖Fig.1 The negative melting curve of EGFR mutation in exon 21

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包對所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析EGFR突變及與臨床病理特征之間的關(guān)系。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 EGFR在MPE組和非MPE組的突變情況

運(yùn)用PCR-HRM法對MPE組及非MPE組活檢組織進(jìn)行EGFR基因檢測。MPE組12例，共檢測到8例（66.67%）發(fā)生EGFR基因突變，其中5例（41.67%）為19外顯子突變，3例（25.00%）為21外顯子突變，1例（8.33%）為19和21同時(shí)突變。非MPE組18例，共檢測到4例（22.22%）發(fā)生EGFR基因突變，其中2例（11.11%）為19外顯子突變，2例（11.11%）為21外顯子突變。MPE組EGFR基因突變率高于非MPE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 EGFR21外顯子突變陽性熔解曲線圖Fig.2 The positive melting curve of EGFR mutation in exon 21

2.2 EGFR突變情況與臨床特征之間的關(guān)系

比較EGFR突變情況與臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)男性患者中有4例檢測到EGFR突變，女性患者中有8例，女性患者突變率高于男性患者；吸煙患者中有3例檢測到突變，非吸煙患者中有9例。EGFR突變與性別、年齡及是否吸煙無明顯相關(guān)，見表1。

表1 EGFR基因的突變與臨床特征之間的關(guān)系Tab.1 Relationship between EGFR gene mutations and clinical characteristics

3 討論

EGFR是一個(gè)位于染色體7q12、分子量為170 000的跨膜蛋白，含有1個(gè)細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。當(dāng)它和特異性配體結(jié)合后，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中特定的酪氨酸殘基便發(fā)生自動(dòng)磷酸化，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生一系列效應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、分化、血管生成、轉(zhuǎn)移及抗凋亡作用。小分子TKIs能夠與ATP競爭性結(jié)合細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中的結(jié)合位點(diǎn)，抑制EGFR的磷酸化和下游信號的傳導(dǎo)。作用于EGFR激酶區(qū)的小分子TKIs，包括吉非替尼和厄洛替尼，是目前非小細(xì)胞肺癌患者最有效的靶向藥，已被推薦為中晚期患者的一線藥物，但并非對所有患者有效。對EGFR外顯子發(fā)生突變的患者，作用于EGFR激酶區(qū)的小分子TKIs有效率可高達(dá)80%，而對野生型患者基本無效，因此EGFR突變是藥物有效的前提。

MPE亦稱腫瘤性胸腔積液，在引起胸腔積液的惡性腫瘤中，最常見的為肺癌、乳腺癌、淋巴癌，其中以肺癌居多。MPE產(chǎn)生的機(jī)制復(fù)雜多樣，歸納起來有以下幾個(gè)方面：惡性腫瘤侵襲臟層和壁層胸膜或伴隨的炎癥使毛細(xì)血管通透性增加，液體滲入胸膜腔；轉(zhuǎn)移至壁層或臟層的腫瘤細(xì)胞阻塞壁層、臟層胸膜血管及淋巴管，使正常的胸液循環(huán)被打破；腫瘤轉(zhuǎn)移至縱膈淋巴結(jié)引起胸腔積液的吸收減少等［6］。文獻(xiàn)報(bào)道血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在MPE中高表達(dá)，推測VEGF參與了肺癌MPE的形成［7］，VEGF可通過增加血管通透性促進(jìn)胸液形成［8］。而EGFR作為VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體，主要作用是介導(dǎo)VEGF的血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、趨化內(nèi)皮細(xì)胞和增加血管通透性等功能。正因?yàn)镋GFR的上述作用，也就使得以EGFR為靶點(diǎn)的治療為肺腫瘤患者提供了一個(gè)新途徑，同時(shí)也為肺癌伴MPE患者的治療提供了新的選擇。然而，作用于EGFR激酶區(qū)的小分子TKIs類藥物對MPE治療效果卻與EGFR基因的突變密切相關(guān)。因此，肺癌伴MPE患者EGFR基因的突變情況成為筆者關(guān)心的重點(diǎn)。

以往的文獻(xiàn)報(bào)道大多是針對胸水細(xì)胞或者肺癌原發(fā)灶進(jìn)行EGFR基因檢測，而臨床上肺癌MPE大多見于發(fā)生胸膜轉(zhuǎn)移的患者。因此，本研究首次提出檢測胸膜轉(zhuǎn)移癌組織的基因突變，同時(shí)與未發(fā)生胸膜轉(zhuǎn)移的癌組織來進(jìn)行對比，很恰當(dāng)?shù)哪M了肺癌并發(fā)MPE的臨床過程。本研究證明，肺癌伴MPE患者的胸膜組織EGFR突變率高于同期肺癌不伴MPE的患者，并發(fā)現(xiàn)發(fā)生突變的EGFR主要為19外顯子和21外顯子，12例突變病例中，7例為19外顯子突變（23.33%），5例為21外顯子突變（16.67%）。檢測樣本中女性、非吸煙的患者突變率較高［8］，與報(bào)道的總體結(jié)果吻合，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果同樣也證實(shí)了EGFR的突變與性別、年齡、臨床分期無關(guān)。

MPE是晚期肺癌最主要的并發(fā)癥之一，尤其是轉(zhuǎn)移性腺癌。據(jù)報(bào)道約15%的肺癌患者在被確診時(shí)已有胸腔積液，50%的肺癌患者在病程中會(huì)出現(xiàn)胸腔積液，而MPE往往預(yù)示著較差的預(yù)后和較短的生存期。作用于EGFR激酶區(qū)的小分子TKIs類藥物為MPE的治療提供了一種新的途徑，因此對肺癌伴MPE患者，可行EGFR基因檢測，突變陽性者可服用TKIs類藥物，抑制胸腔積液，延長生存期，而對于未行基因檢測的患者也可實(shí)驗(yàn)性服用TKIs類藥物［5］。

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，腫瘤的治療越來越強(qiáng)調(diào)個(gè)體化。對于肺癌的治療除了手術(shù)、化療、放療等治療手段外，以作用于EGFR激酶區(qū)的小分子TKIs為代表的靶向藥物也已經(jīng)成為肺癌治療的一種新選擇。靶向藥物治療因其具有高度選擇性殺死腫瘤細(xì)胞而不殺傷或僅很少損傷正常細(xì)胞的特點(diǎn)，毒副作用相對較小，使腫瘤的治療出現(xiàn)了新的曙光。同時(shí)，隨著中國肺腺癌患者所占比例增長，這一人群正是作用于EGFR激酶區(qū)的小分子TKIs治療的優(yōu)勢人群。因此，推廣以基因測序?yàn)榛A(chǔ)的EGFR突變狀態(tài)檢測，對指導(dǎo)臨床合理用藥、預(yù)測臨床療效和節(jié)約治療成本都有很大的幫助。

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（編輯 陳 姜）

Detection and ClinicalSignificance of EGFR Mutationsin Lung Cancer Patientswith MalignantPleuralEffusion

TIANYe，WANGYuan，LIUSi-yang，JIANGWen-jun，TIANDa-li

（DepartmentofThoracic Surgery，The Fourth Affiliated Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110032，China）

Objective To study the mutations of epidermal growth factor receptor（EGFR）gene in lung cancer patients with malignant pleural effusion，and explore its correlation with biological behavior.Methods By investigating mutations of EGFR gene in 30Ⅳstage lung cancer patients with or without malignant pleural effusion，the possible relationship between EGFR gene mutation and biological behavior of malignant pleural effusion was analyzed and discussed.Results EGFR mutation rate of lung cancer patients with malignant pleural effusion is higher than those without malignant pleural effusion（P＜0.05）.Conclusion Mutation rate of EGFR in lung cancer patients with malignant pleural effusion is significantly higherthan those patients withoutmalignantpleuraleffusion.Therefore，there isan association between mutations of EGFR and the biologicalbehavior of lung cancer.Targeted therapy could be used as a treatment option in patients with malignant pleural effusion，so as to improve the survival rate and quality oflife.

lung cancer；malignant pleural effusion；EGFR mutations

R743.2

A

0258-4646（2016）02-0150-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.02.012

沈陽市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（F13-316-1-07）

田野（1981-），男，講師，博士.

姜文軍，E-mail：Cmu4hjwj@126.com

2015-06-28

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：