胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞低氧培養(yǎng)液對腸黏膜上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

杜莉莉，呂潤瀟，楊曉漪，辛娜，馬廷賢

（1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，沈陽 110013；2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院研究生隊(duì)，第二軍醫(yī)大學(xué)研究生隊(duì)，上海200433；3.中國醫(yī)科大學(xué)95期臨床醫(yī)學(xué)7年制，沈陽 110013）

·論著·

胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞低氧培養(yǎng)液對腸黏膜上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

杜莉莉1，呂潤瀟2，楊曉漪3，辛娜1，馬廷賢1

（1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，沈陽 110013；2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院研究生隊(duì)，第二軍醫(yī)大學(xué)研究生隊(duì)，上海200433；3.中國醫(yī)科大學(xué)95期臨床醫(yī)學(xué)7年制，沈陽 110013）

目的 研究胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞（pMSCs）低氧培養(yǎng)液對腸黏膜上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用。方法 組織塊培養(yǎng)法提取pMSCs，流式細(xì)胞術(shù)檢測表面標(biāo)志，ELISA檢測pMSCs常氧（21%O2）或低氧（1%O2）培養(yǎng)5 d后培養(yǎng)液中胰島素樣生長因子1（IGF-1）的含量。人結(jié)腸腺癌細(xì)胞（Caco2）經(jīng)100 μmol/L H2O2處理12 h后分別培養(yǎng)于正常培養(yǎng)液、pMSCs常氧培養(yǎng)液或pMSCs低氧培養(yǎng)液，5 d后臺盼藍(lán)染色測細(xì)胞存活情況，MTT測細(xì)胞增殖，Annexin V-FITC/PI雙染測細(xì)胞凋亡。結(jié)果 pMSCs陽性表達(dá)CD29，CD44。pMSCs低氧培養(yǎng)液中的IGF-1明顯多于pMSCs常氧培養(yǎng)液（P＜0.05）。與pMSCs常氧培養(yǎng)液相比，pMSCs低氧培養(yǎng)液中H2O2處理的Caco2存活細(xì)胞多，增殖快，凋亡少（P＜0.05）。向pMSCs低氧培養(yǎng)液中加入IGF-1抗體后，細(xì)胞增殖減慢，凋亡增多（P＜0.05）。結(jié)論 pMSCs低氧培養(yǎng)液對H2O2處理的Caco2具有保護(hù)作用。機(jī)制與IGF-1促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡相關(guān)。

胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；低氧；氧化應(yīng)激；人結(jié)腸腺癌細(xì)胞

腸缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）是臨床常見的病理生理過程。I/R時(shí)腸黏膜上皮細(xì)胞損傷、腸內(nèi)細(xì)菌入血引發(fā)全身炎性反應(yīng)綜合征及多系統(tǒng)器官衰竭。缺血再灌注時(shí)形成的大量氧自由基是腸黏膜上皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenehymal stem cells，MSCs）具有自我更新及多向分化潛能［1～5］。胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞（plaeenta derived mesenehymal stem cells，pMSCs）是近年來新發(fā)現(xiàn)的間充質(zhì)干細(xì)胞，生物學(xué)特性與骨髓MSCs相似，并可通過分泌細(xì)胞因子對許多疾病起到治療作用。低氧可促進(jìn)pMSCs分泌細(xì)胞因子。本研究擬檢測正常培養(yǎng)液（normal culture medium，NM）、pMSCs常氧培養(yǎng)液（pMSCs normoxia culture medium，pMSCs-NCM）及pMSCs低氧培養(yǎng)液（pMSCs hypoxia culture medium，pMSCs-HCM）中胰島素樣生長因子l（insulin-like growth factor l，IGF-l）的含量，利用過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）處理人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco2建立腸黏膜上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，檢測pMSCs-HCM對該細(xì)胞模型的作用并闡明其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司），醫(yī)用凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠），低溫高速離心機(jī)（德國Sigma公司），胎牛血清（美國Gibco公司），DMDM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），非必需氨基酸（美國Gibco公司），L-谷氨酰胺（美國Gibco公司），青鏈霉素（美國Gibco公司），β-巰基乙醇（美國Gibco公司），0.25%Trypsin-EDTA（美國Gibco公司），鼠抗人直標(biāo)單克隆抗體（美國BD公司），ELISA試劑盒（美國Sigma公司），IGF-1Ab（美國R&D公司），Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司），Caco2細(xì)胞（上海中科院細(xì)胞庫）。

pMSCs：經(jīng)產(chǎn)婦同意并通過倫理委員會認(rèn)證后，無菌條件下取剖宮產(chǎn)的足月健康新生兒胎盤組織（來源于沈陽市和平區(qū)婦幼醫(yī)院）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 pMSCs的提取、傳代及鑒定：無菌條件下剪取胎兒面胎盤小葉中央蛻膜側(cè)組織，10%青鏈霉素PBS反復(fù)沖洗，剪成1 mm3左右組織塊，接種于6 cm培養(yǎng)皿，放入37℃，5%CO2飽和濕度孵箱，組織塊貼壁牢固后緩慢加入10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，放入孵箱，每5 d換液，10 d后組織塊周圍有細(xì)胞爬出。待細(xì)胞鋪滿皿底70%～80%時(shí)去除組織塊，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代。取第3代pMSCs倒置顯微鏡下觀察形態(tài)特征。取第3代pMSCs，每管加入1× 106個(gè)細(xì)胞，小鼠血清5 mL，封閉15 min，分別加入鼠抗人PE標(biāo)記單克隆抗體HLA-DR，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗體CD29，CD31，CD34，CD44，CD45各20 μL，設(shè)FITC，PE空白對照管，4℃避光反應(yīng)30 min，PBS洗3次后1 000 r/min離心10 min。棄上清，加200 μL PBS混勻細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型。

1.2.2 低氧培養(yǎng)對pMSCs分泌IGF-1的影響：取第3代pMSCs，消化后用10%FBS的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，每孔200 μL接種于96孔板，分別放于常氧培養(yǎng)箱（21%O2）及低氧培養(yǎng)箱（1% O2），5 d后ELISA檢測各上清中IGF-1含量。

1.2.3 pMSCs-HCM對H2O2處理的Caco2的作用：用10%FBS的DMEM培養(yǎng)液制成Caco2細(xì)胞懸液，接種于12孔板（1×105/孔），每組5個(gè)復(fù)孔，常氧培養(yǎng)過夜后給予終濃度為100 μmol/L的H2O2作用12 h，此為腸黏膜上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。去除含有H2O2的培養(yǎng)液，分別添加NM，pMSc-NCM及pMSCs-HCM，常氧培養(yǎng)5 d后取出細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞。

1.2.4 pMSCs-HCM中IGF-1對H2O2處理的Caco2增殖的影響：Caco2用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液配制成5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，每孔200 μL接種于96孔板，每組5個(gè)復(fù)孔。過夜培養(yǎng)后，加入終濃度100 μmol/L的H2O2作用12 h，棄掉含H2O2的培養(yǎng)液，分別加入NM，pMSc-NCM，pMSCs-HCM及pMSCs-HCM+IGF-1Ab（0.25 μg/mL）培養(yǎng)5 d，每孔再加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37℃孵育4 h，離心1 000 r/min 5 min，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，充分溶解后于酶標(biāo)儀490 nm處測定各孔調(diào)零后的吸光度值（OD值）。

1.2.5 pMSCs-HCM中IGF-1對H2O2處理的Caco2凋亡的影響：用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液配制成5× 104個(gè)/mL Caco2細(xì)胞懸液，每孔200 μL接種于96孔板，每組5個(gè)復(fù)孔。過夜培養(yǎng)后，加入終濃度為100 μmol/L的H2O2作用12 h，棄掉含有H2O2的培養(yǎng)液，分別加入NM，pMSc-NCM，pMSCs-HCM及pMSCs-HCM+IGF-1Ab（0.25 μg/mL）培養(yǎng)5 d后，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，胰酶消化后細(xì)胞懸液1 000 g離心5 min，PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取1.5×105重懸細(xì)胞，離心1 000 g 5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞。加入5 μL Annexin V-FITC混勻。加入10 μL碘化丙錠染色液混勻。室溫避光孵育15 min，冰浴，鋁箔避光。隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)用表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pMSCs的提取、傳代及鑒定

胎盤組織塊接種第10天，組織塊周圍有少量細(xì)胞爬出，短梭形。隨后爬出細(xì)胞數(shù)量增多，并逐漸伸展（圖1A）。第3代pMSCs形態(tài)較一致，呈梭形，似成纖維細(xì)胞。細(xì)胞排列規(guī)則（圖1B）。利用第3代pMSCs進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，pMSCs陽性表達(dá)CD29、CD44（圖2），而CD31、CD34、CD45、HLA-DR呈陰性。

圖1 pMSCs的提取及傳代 ×100Fig.1 Isolation and passage of pMSCs×100

圖2 流式細(xì)胞檢測pMSCs的CD29及CD44表達(dá)Fig.2 CD29 and CD44 expression of pMSCs detected by flow cytometry

2.2 低氧培養(yǎng)促進(jìn)pMSCs分泌IGF-1

圖3 低氧培養(yǎng)促進(jìn)pMSCs分泌IGF-1Fig.3 Hypoxic culture promoted the secretion of IGF-1 by pMSCs

如圖3所示，與NM相比，pMSCs-NCM及pMSCs-HCM中IGF-1含量明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。pMSCs-HCM中的IGF-1含量明顯多于pMSCs-NCM，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 低氧培養(yǎng)增強(qiáng)pMSCs培養(yǎng)液對H2O2處理Caco2的保護(hù)作用

臺盼藍(lán)染色表明，與NM相比，NM+H2O2組中存活的Caco2數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)H2O2處理后，pMSCs-NCM及pMSCs-HCM組中存活的Caco2數(shù)量明顯多于NM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而pMSCs-NCM和pMSCs-HCM 2組相比，pMSCs-HCM中有較多的細(xì)胞存活，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

2.4 pMSCs-HCM中的IGF-1促進(jìn)H2O2處理的Caco2增殖

MTT結(jié)果表明，與NM相比，NM+H2O2組中Caco2增殖能力減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)H2O2處理后，pMSCs-NCM及pMSCs-HCM組中Caco2增殖能力明顯強(qiáng)于NM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而pMSCs-NCM及pMSCs-HCM 2組相比，pMSCs-HCM中的Caco2增殖較快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），pMSCs-HCM中加入IGF-1中和抗體后，Caco2的增殖能力較pMSCs-HCM+H2O2組明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

圖4 低氧增強(qiáng)pMSCs培養(yǎng)液對H2O2處理Caco2的保護(hù)作用Fig.4 The protection effects of pMSCs on H2O2-treated Caco2 was enhanced by hypoxia

圖5 pMSCs-HCM中的IGF-1促進(jìn)H2O2處理的Caco2增殖Fig.5 The IGF-1 in pMSCs-HCM promoted the proliferation of H2O2-treated Caco2

2.5 pMSCs-HCM中的IGF-1抑制H2O2處理的Caco2凋亡

Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)果（圖6）表明，與NM相比，NM+H2O2組Caco2凋亡增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)H2O2處理后，pMSCs-NCM及pMSCs-HCM組Caco2凋亡明顯少于NM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而pMSCs-NCM及pMSCs-HCM 2組相比，pMSCs-HCM組Caco2凋亡較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），pMSCs-HCM中加入IGF-1中和抗體后，Caco2凋亡較pMSCs-HCM+H2O2組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖6 pMSCs-HCM中的IGF-1抑制H2O2處理的Caco2凋亡Fig.6 The IGF-1 in pMSCs-HCM inhibited the apoptosis of H2O2-treated Caco2

3 討論

腸黏膜上皮細(xì)胞是腸黏膜屏障的第一道防線，可阻止腸腔內(nèi)有害物質(zhì)進(jìn)入血液。缺血再灌注可破壞腸道屏障功能，此時(shí)的腸道成為全身炎性反應(yīng)綜合征的始動(dòng)器官及多系統(tǒng)器官衰竭的發(fā)源地。如何減少I/R時(shí)腸黏膜上皮細(xì)胞的損傷是目前研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。目前認(rèn)為，I/R引起的氧化應(yīng)激是腸黏膜上皮細(xì)胞損傷的主要因素之一。Caco2細(xì)胞來源于人結(jié)腸腺癌細(xì)胞，含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系，也可形成與小腸相似的緊密連接［6，7］，正常培養(yǎng)條件下的Caco2結(jié)構(gòu)和功能類似于腸黏膜上皮細(xì)胞，是體外腸黏膜上皮細(xì)胞研究的最佳模型［8］。以往的研究［9，10］表明，H2O2能夠引起腸黏膜上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激并導(dǎo)致屏障功能破壞。因此，本研究應(yīng)用H2O2處理Caco2，在體外建立腸黏膜上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。

MSCs是一種成體干細(xì)胞，其分泌的細(xì)胞因子可作用于受損器官，促進(jìn)組織修復(fù)，因此MSCs對許多疾病有一定的治療作用。研究［11］證實(shí)，低氧培養(yǎng)可影響MSCs的生物學(xué)特性。低氧時(shí)MSCs分泌VEGF、HGF、bFGF、SCF、SDF-1、G-CSF增多，對許多疾病的治療作用也增強(qiáng)。pMSCs具有干細(xì)胞的生物學(xué)特性，且提取不涉及倫理道德問題，因此，pMSCs已經(jīng)引起研究者的普遍關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)低氧對pMSCs分泌細(xì)胞因子也有促進(jìn)作用，低氧培養(yǎng)后，pMSCs分泌的IGF-1明顯增多。

IGF-1又名生長介素，是胰島素樣生長因子系統(tǒng)的重要成員。其空間結(jié)構(gòu)與胰島素相似，與受體結(jié)合后可產(chǎn)生胰島素樣作用。IGF-1與機(jī)體組織增殖、分化和成熟密切相關(guān)。IGF-1可與小腸隱窩上皮細(xì)胞的IGF-1受體結(jié)合，通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化及DNA合成而促進(jìn)小腸生長［12，13］。IGF-1還可抑制腸黏膜細(xì)胞凋亡［14］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，IGF-1能降低損傷時(shí)小鼠腸黏膜的通透性，增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞的屏障功能［15］。

MSCs對腸道保護(hù)作用的相關(guān)研究［16，17］已取得了一定的進(jìn)展：MSCs促進(jìn)放射性腸損傷小鼠腸上皮的修復(fù)、降低I/R后大鼠小腸的通透性、減輕小腸絨毛的損傷。前期實(shí)驗(yàn)表明，小鼠腸道I/R后，尾靜脈輸入低氧培養(yǎng)的pMSCs可減輕腸道損傷。pMSCs輸入12 h即可檢測出損傷減輕，而12 h內(nèi)pMSCs很難完成向腸黏膜上皮細(xì)胞的分化。因此推測此時(shí)pMSCs的保護(hù)作用并不是通過分化為腸黏膜上皮細(xì)胞完成的，更多的與其旁分泌作用相關(guān)。本研究的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與pMSCs-NCM相比，pMSCs-HCM對H2O2處理的Caco2有更強(qiáng)的保護(hù)作用。低氧時(shí)pMSCs分泌增多的IGF-1是其保護(hù)作用增強(qiáng)的因素之一，IGF-1可促進(jìn)H2O2處理的Caco2增殖，抑制其凋亡。本研究只在體外實(shí)驗(yàn)中初步探索了pMSCs-HCM對氧化應(yīng)激損傷腸黏膜上皮細(xì)胞的保護(hù)作用，以后將利用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步完善本研究。

找到有效的方法減輕氧化應(yīng)激導(dǎo)致的腸黏膜上皮細(xì)胞損傷，對防治腸缺血再灌注損傷一系列疾病具有十分重要的意義。本研究結(jié)果證實(shí)缺氧促進(jìn)pMSCs分泌IGF-1，IGF-1可促進(jìn)H2O2處理的Caco2增殖，抑制凋亡。因此，pMSCs-HCM對氧化應(yīng)激損傷的腸黏膜上皮細(xì)胞具有更強(qiáng)的保護(hù)作用。本研究為臨床應(yīng)用pMSCs防治腸缺血再灌注損傷提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（編輯 于 溪）

Protection EffectofPlacenta MesenchymalStem Cells Hypoxia Culture Medium on Oxidative Stress-induced Injury of IntestinalMucosalEpithelialCells

DULi-li1，LüRun-xiao2，YANGXiao-yi3，XINNa1，MA Ting-xian1

（1.Department of Pathophysiology，College of Basic Medical Science，China Medical University，Shenyang 110013，China；2.Unit of Graduate Students，Affiliated Changhai Hospital of Second Military Medical University，Unit of Graduate Students，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China；3.The 95th SevenyearSystem，ClinicalMedicine，China MedicalUniversity，Shenyang 110013，China）

Objective To study the effect of placenta mesenchymal stem cells（pMSCs）hypoxia culture medium on the oxidative stress-induced injury of intestinal mucosal epithelial cells.Methods pMSCs were extracted by tissue culture method and identified by flow cytometry.The IGF-1 content in the culture medium of pMSCs cultured under both normal oxygen（21%O2）and hypoxia（1%O2）were detected by ELISA.Caco2 were treated with H2O2（100 μmol/L）for 12 h and then cultured in normal culture medium（NM），pMSCs normoxia culture medium（pMSCs-NCM）or pMSCs hypoxia culture medium（pMSCs-HCM）for5 d respectively.Cellsurvivalwas detected by trypan blue staining，cellproliferation was detected with MTT and cell apoptosis was detected with Annexin V-FITC/PI.Results pMSCs positively expressed CD29 and CD44.IGF-1 in pMSCs-HCM was significantly more than that in pMSCs-NCM（P＜0.05）.Compared with pMSCs-NCM，H2O2-treated Caco2 in pMSCs-HCM contained more living cells.Theirproliferation was fasterand apoptosis was slower（P＜0.05）.Afterthe addition ofIGF-1 antibody to pMSCs-HCM，the proliferation of H2O2-treated Caco2 decreased and the apoptosis increased（P＜0.05）.Conclusion pMSCs-HCM had a protective effect on H2O2-treated Caco2，and the mechanism may be related to the IGF-1 mediated cellproliferation and cellapoptosisinhibition.

placenta mesenchymal stem cells；hypoxia；oxidative stress；human colon adenocarcinoma cells

R574.5

A

0258-4646（2016）02-0131-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.02.008

遼寧省科學(xué)技術(shù)廳2015年博士科研啟動(dòng)基金計(jì)劃（201501003）

杜莉莉（1979-），女，講師，博士.

E-mail：lilidu123456@126.com

2015-05-28

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