重組人對(duì)氧磷酶1K192亞型對(duì)毒死蜱所致SD大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

張帆，韓新飛，張娜，張鵬思，趙敏

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1.急診科；2.社會(huì)服務(wù)部，沈陽(yáng) 110004）

·論著·

重組人對(duì)氧磷酶1K192亞型對(duì)毒死蜱所致SD大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

張帆1，韓新飛1，張娜1，張鵬思2，趙敏1

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1.急診科；2.社會(huì)服務(wù)部，沈陽(yáng) 110004）

目的 探討重組人對(duì)氧磷酶1K192亞型（rHuPON1K192）對(duì)毒死蜱中毒導(dǎo)致的大鼠急性肝臟損傷的保護(hù)作用。方法將健康成年SD大鼠50只隨機(jī)分為正常組（A組）、rHuPON1K192對(duì)照組（B組）、毒死蜱染毒組（C組）、低劑量rHuPON1K192預(yù)處理組（D組）、高劑量rHuPON1K192預(yù)處理組（E組），每組10只。C、D、E組均給予毒死蜱灌胃，D組在灌毒30 min前予以rHuPON1K192 4 500 U/kg尾靜脈注射，E組予以9 000 U/kg rHuPON1K192尾靜脈注射，A組予以與毒死蜱同體積生理鹽水灌胃，B組則單純予以rHuPON1K192尾靜脈注射。8 h后取血，采用速率法檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的活性，采用ELISA法檢測(cè)蘋果酸脫氫酶（MDH）及谷氨酸脫氫酶（GLDH）的活性；取肝臟組織行免疫組化檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）的表達(dá)，采用光鏡、透射電鏡檢查超微結(jié)構(gòu)的改變。比較各組之間相關(guān)指標(biāo)的差異。結(jié)果 比較A組與B組各項(xiàng)指標(biāo)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。C組肝功能指標(biāo)ALT、AST、GLDH及MDH較A組均有明顯升高（P＜0.01），HIF-1α呈重度表達(dá)，電鏡與光鏡下肝細(xì)胞膜、線粒體等出現(xiàn)明顯損傷。D組及E組上述指標(biāo)較A組輕度升高，E組改變程度較D組稍輕，2組各指標(biāo)相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。D組及E組上述指標(biāo)改變較C組輕，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 rHuPON1K192對(duì)毒死蜱中毒肝損傷具有保護(hù)作用。

SD大鼠；毒死蜱；重組人對(duì)氧磷酶1K192；肝損傷

毒死蜱作為有機(jī)磷農(nóng)藥的一種，所致中毒在臨床上較常見，然而傳統(tǒng)的救治手段治療效果不盡理想，急需找到一種更好的治療方法。近年來(lái)，對(duì)氧磷酶1（paraoxonase 1，PON1）水解有機(jī)磷的作用使其成為此領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本研究擬探討重組人對(duì)氧磷酶1K192亞型（recombinant human K192 subtype of paraoxonase 1，rHuPON1K192）對(duì)毒死蜱中毒所致急性肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：取健康成年雄性SD大鼠50只，SPF級(jí)，體質(zhì)量（300±50）g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司［許可證號(hào)SCXK（京）2014-0004］，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與儀器：45%毒死蜱乳油（天津漢邦植物保護(hù)劑有限責(zé)任公司）；rHuPON1K192［自行制備：截取人類PON1基因序列為目標(biāo)片段，修改其192位密碼子為AAA（編碼賴氨酸），經(jīng)DNA內(nèi)切酶及連接酶與質(zhì)粒連接后獲得含有rHuPON1K192的陽(yáng)性表達(dá)載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至菌株細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)誘導(dǎo)，超聲破碎菌體細(xì)胞，離心后層析取上清純化，經(jīng)E.Coli表達(dá)、聚乙二醇修飾提純后，獲得85% rHuPON1K192蛋白樣本，檢測(cè)其活性為350.03 U/L，具有更高溶解性、穩(wěn)定性及長(zhǎng)半衰期，于-80℃冰箱保存待用］；多聚甲醛及戊二醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxalacetic transaminase，AST）檢測(cè)試劑盒（美國(guó)雅培公司）；鼠谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GLDH）、蘋果酸脫氫酶（malic dehydrogenase，MDH）ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；兔抗鼠多克隆缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）抗體（美國(guó)Proteintech公司），羊抗兔二抗試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）；ELx808全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)BioTek公司）；CX-41普通光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；H-7650型透射電子顯微鏡（日本HITACHI公司），E800型生物光學(xué)顯微鏡照相機(jī)（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備：將50只大鼠隨機(jī)分為正常組（A組）、rHuPON1K192對(duì)照組（B組）、毒死蜱染毒組（C組）、低劑量rHuPON1K192預(yù)處理組（D組）、高劑量rHuPON1K192預(yù)處理組（E組），每組10只。C、D、E組均給予毒死蜱灌胃，D組在灌毒30 min前予以rHuPON1K192 4 500 U/kg尾靜脈注射，E組予以9 000 U/kg rHuPON1K192尾靜脈注射，A組給予與毒死蜱同體積生理鹽水灌胃，B組則單純予以rHu-PON1K192尾靜脈注射。

1.2.2 取材：各組大鼠染毒8 h，麻醉后開腹，分離出新鮮肝組織，多聚甲醛中固定，以備組織學(xué)光鏡以及免疫組化檢測(cè)；另取各組肝組織于戊二醛中固定，備透射電鏡檢查。腹主動(dòng)脈采血離心后，取上清存于-80℃冰箱，以檢測(cè)相關(guān)酶學(xué)指標(biāo)。

1.2.3 速率法檢測(cè)ALT、AST活性：連續(xù)檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程中底物濃度的變化，求酶反應(yīng)的初始速度，再檢測(cè)吸光度曲線中線性期的吸光度值，計(jì)算酶活性。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)GLDH、MDH活性：在96孔板上設(shè)好各孔位置后加樣，孵育、棄液、甩干、洗滌后，依次滴加待測(cè)溶液，再滴加底物溶液避光顯色，終止顯色后，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量光密度。

1.2.5 免疫組化法檢測(cè)HIF-1α的表達(dá)：肝臟組織經(jīng)固定、脫水、透明、包埋、切片及微波熱修復(fù)后，依次加入3%過(guò)氧化氫、山羊血清封閉游離結(jié)合位點(diǎn)，滴加一抗過(guò)夜，次日加入二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液，DAB顯色后，經(jīng)脫水透明封片，進(jìn)行圖像分析。

1.2.6 光鏡觀察：取肝組織經(jīng)固定、脫水、透明及包埋后切片，HE染色，樹脂封片，光鏡下觀察。

1.2.7 透射電鏡觀察：肝組織浸泡于3%的戊二醛中固定，用鋨酸后固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧丙烷浸泡，包埋劑浸透過(guò)夜后，聚合切片，經(jīng)醋酸鈾及檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料采用表示，組間比較采用ANOVA檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

各組大鼠處理8 h后麻醉前一般情況見表1。C組大鼠出現(xiàn)流淚流涎，大小便失禁，肌顫，萎靡，反應(yīng)遲鈍等典型的毒死蜱中毒癥狀。

2.2 ALT、AST、MDH、GLDH活性

如表2所示：A組與B組大鼠ALT、AST均在正常范圍內(nèi)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；C組ALT、AST顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；D組及E組ALT、AST指標(biāo)稍高于A組，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；C組與2個(gè)rHuPON1K192預(yù)處理組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D組和E組ALT、AST無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠一般情況Tab.1 General information of rats in each group

表2 大鼠肝損傷血清學(xué)指標(biāo)及陽(yáng)性面積指數(shù)變化（）Tab.2 Changes of serum markers and positive area index of liver injury in rats（）

表2 大鼠肝損傷血清學(xué)指標(biāo)及陽(yáng)性面積指數(shù)變化（）Tab.2 Changes of serum markers and positive area index of liver injury in rats（）

1）P＜0.01 vs group A；2）P＜0.05 vs group C.

Group n ALT（U/L） AST（U/L） GLDH（U/L） MDH（U/L） Positive area index A 10 59.115±15.718 121.185±22.854 3.025±0.541 4.787±1.839 1 223.883±324.052 B 10 57.296±13.457 126.192±32.048 3.164±0.521 4.916±1.474 1 215.635±273.305 C 10 169.157±32.6511） 225.107±46.1041） 9.172±1.3301） 11.536±1.6201） 3 313.336±477.7871）D 10 77.139±17.8882） 150.969±30.9262） 3.753±0.7502） 6.319±0.7962） 1 606.878±364.4312）E 10 71.487±16.3522） 132.368±18.4622） 3.279±0.7882） 5.443±1.3152） 1 386.480±366.1392）

2.3 GLDH及MDH的異常升高與ALT變化程度的相關(guān)性

以GLDH為y軸，ALT為x軸，得出線性方程為y=0.052 3x-0.064 8（R2=0.937 9，F(xiàn)=716.719 0，P＜0.01），說(shuō)明兩者有很好的直線關(guān)系。同樣以MDH為y軸，ALT為x軸，求得線性方程為y=0.059 6x+ 1.424 0（R2=0.911 6，F(xiàn)=493.623 5，P＜0.01），證明兩者有良好的直線關(guān)系。提示大鼠MDH、GLDH的異常升高與ALT的改變有高度相關(guān)性。見圖1。

圖1 GLDH、MDH與ALT變化趨勢(shì)Fig.1 Variation trend among GLDH，MDH and ALT

2.4 各組大鼠肝組織中HIF-1α抗體的表達(dá)

A、B組大鼠HIF-1α抗體的表達(dá)呈弱陽(yáng)性，視野中鮮有淡黃色（圖2A、2B）；C組呈重度表達(dá)，呈滿視野深棕黃色（圖2C）；D組輕度表達(dá)，呈淡黃色（圖2D）；E組呈極輕度表達(dá)，散在少量淡黃色（圖2E）。應(yīng)用NIS-Elements F3.0圖像采集軟件照相并檢測(cè)陽(yáng)性面積指數(shù)結(jié)果見表2。

2.5 各組大鼠肝組織光鏡及電鏡下病理表現(xiàn)

圖2 各組肝細(xì)胞HIF-1α抗體免疫組化染色 ×400Fig.2 Immunohistochemical staining analysis of HIF-1α of liver cells×400

A、B組肝細(xì)胞膜完整，線粒體豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完整（圖3A、3B、4A、4B）；C組肝細(xì)胞渾濁腫脹明顯，體積增大、氣球樣變，有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，核固縮、碎裂，呈崩裂傾向，線粒體疏松溶解腫脹（圖3C、4C）；D組肝細(xì)胞稍腫脹，體積稍大，炎性細(xì)胞稍有浸潤(rùn)，線粒體少有溶解，數(shù)量減少（圖3D、4D）；E組肝細(xì)胞輕微腫脹，可見輕度水樣變，較少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，線粒體排列稍欠規(guī)則，基質(zhì)疏松欠致密（圖3E、4E）。

3 討論

毒死蜱是常用的有機(jī)磷農(nóng)藥，通過(guò)使膽堿酯酶（cholinesterase，ChE）磷?；种破浠钚?，從而使體內(nèi)乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）無(wú)法分解而蓄積，產(chǎn)生毒蕈堿樣、煙堿樣及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。本研究中，染毒組大鼠出現(xiàn)流淚流涎，大小便失禁，肌顫，萎靡，反應(yīng)遲鈍等典型的毒死蜱中毒癥狀。

圖3 各組肝細(xì)胞HE染色 ×400Fig.3 HE staining of liver cells×400

圖4 各組肝細(xì)胞電鏡表現(xiàn) ×8 000Fig.4 TEM observation of liver cells×8 000

有機(jī)磷中毒患者常有肝損傷。ALT、AST是國(guó)際公認(rèn)監(jiān)測(cè)肝損傷的指標(biāo)，但因ALT的敏感度欠佳，且心肌損傷時(shí)AST也發(fā)生改變，臨床上急需更好的驗(yàn)證指標(biāo)。GLDH主要存在于肝細(xì)胞線粒體中，當(dāng)線粒體膜破壞時(shí)，GLDH能先于ALT釋放入血，故Harrill等［1］提出將GLDH作為肝損傷標(biāo)志物。近年發(fā)現(xiàn)血清MDH與肝損傷有一定聯(lián)系，它是一種門靜脈周圍酶，在三羧酸循環(huán)中參與草酰乙酸與蘋果酸的轉(zhuǎn)化，該循環(huán)遭到破壞時(shí)肝細(xì)胞中的MDH迅速釋放入血清，而此時(shí)ALT并未改變［2］。本研究發(fā)現(xiàn)染毒組細(xì)胞膜及線粒體出現(xiàn)嚴(yán)重病理?yè)p傷，血清ALT、AST、GLDH、MDH均有不同程度增高，且ALT與GLDH、MDH的改變呈正相關(guān)，有力地證明了GLDH、MDH的改變與肝損傷密切相關(guān)。因GLDH、MDH更為準(zhǔn)確和特異，故日漸成為優(yōu)于ALT、AST的新興肝功能損傷指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，HIF-1α在染毒組肝細(xì)胞中表達(dá)水平較高，提示其與毒死蜱肝細(xì)胞損傷有關(guān)。HIF-1α是低氧應(yīng)激時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因編碼合成的蛋白質(zhì)［3］，可維持氧代謝穩(wěn)態(tài)，與肝細(xì)胞線粒體凋亡、炎性介質(zhì)釋放有關(guān)。在氧化應(yīng)激調(diào)動(dòng)時(shí)，HIF-1α作為機(jī)體抗氧化程序的總開關(guān)，蓄積下游輔助因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1β等［4］，啟動(dòng)脯氨酸羥基化過(guò)程，從而引起過(guò)多的HIF-1α與羥基化后的脯氨酸結(jié)合，隨后大量氧自由基破壞肝細(xì)胞膜的完整性、干擾膜的CA2+-ATP酶系，使細(xì)胞內(nèi)外鈣離子的穩(wěn)態(tài)破壞而損傷肝細(xì)胞及線粒體的結(jié)構(gòu)。有機(jī)磷致肝損傷涉及氧化應(yīng)激過(guò)程，HIF-1α作為肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的始動(dòng)因素功能不可小覷，其下游相關(guān)因子可起到破壞肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的作用，影響代謝，促進(jìn)炎性介質(zhì)釋放，加重?fù)p傷，本研究結(jié)果也充分證明了這一論點(diǎn)。

rHuPON1K192是PON1的一種人工合成亞型，具有更高的溶解性、穩(wěn)定性及長(zhǎng)半衰期。PON1是由肝臟合成分泌的酯酶，可保護(hù)脂蛋白不被氧化，且能夠催化水解磷酸酯鍵。192位點(diǎn)的氨基酸基團(tuán)是影響此酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn)［6］，該位點(diǎn)為賴氨酸時(shí)，PON1表達(dá)型活性最高。當(dāng)毒死蜱侵入肝細(xì)胞后可造成氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，而rHuPON1K192可催化磷酸酯鍵、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激平衡、清除氧自由基、增強(qiáng)抗氧化，抑制HIF-1α表達(dá)，增加肝細(xì)胞膜及細(xì)胞器穩(wěn)定性，減少肝酶釋放［7］。研究證實(shí)，外源增加PON1可減少有機(jī)磷中毒程度，且PON1針對(duì)于毒死蜱的水解率明顯大于其他有機(jī)磷化合物，可有效降低毒死蜱入血量和峰濃度，減輕AchE的抑制［8］，緩解癥狀，肝保護(hù)作用優(yōu)于現(xiàn)有的其他解毒劑［9］。本研究中，單純r(jià)HuPON1K192處理組大鼠與正常組無(wú)顯著差別，說(shuō)明rHuPON1K192對(duì)肝臟無(wú)明顯毒性。經(jīng)rHuPON1K192預(yù)處理后的大鼠各項(xiàng)指標(biāo)及病理變化均輕于染毒組，說(shuō)明外源增加rHuPON1K192可減輕毒死蜱的中毒程度；高劑量rHuPON1K192預(yù)處理組大鼠與低劑量組相比，上述指標(biāo)改變更為輕微，證明足量的rHuPON1K192對(duì)肝功能保護(hù)作用更佳，確切證明了它的優(yōu)越性和安全無(wú)害性。

綜上所述，外源的rHuPON1K192對(duì)機(jī)體肝功能安全無(wú)損害，且具有催化磷酸酯鍵、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激平衡的解毒作用。本研究結(jié)果為治療毒死蜱中毒所致急性肝損傷提供了一條新途徑。

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（編輯 王又冬）

Protective Effectofthe Recombinant Human K192 Subtype ofParaoxonase1 on Chlorpyrifos-induced Acute Liver Injury in SD Rats

ZHANG Fan1，HANXin-fei1，ZHANGNa1，ZHANGPeng-si2，ZHAOMin1
（1.Emergency Department，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China；2.SocialService Department，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To investigate the protective effect of recombinant human K192 subtype of paraoxonase 1（rHuPON1K192）on acute chlorpyrifos poisoning induced liver injury in rats.Methods Totally 50 healthy adult SD rats were randomly assigned into five equal groups，including normal group（group A），rHuPON1K192 control group（group B），chlorpyrifos group（group C），low dose rHuPON1K192 pretreated group（group D），and high dose rHuPON1K192 pretreated group（group E）.Group C，D and E were given intragastric administration ofchlorpyrifos.Group D was given rHuPON1K192 by caudal intravenous injection according to 4 500 U/kg 30 min before intragastric administration of chlorpyrifos.Group E was given rHuPON1K192 according to 9 000 U/kg.Group A received same volume of saline by intragastric administration.Group B was only given rHu-PON1K192 by caudalintravenous injection.After8 hours，the ratswere anesthetized and the blood was harvested.The activity ofalanine aminotransferase（ALT）and glutamic-oxalacetic transaminase（AST）was detected by rate method，and the activity of malic dehydrogenase（MDH）and glutamate dehydrogenase（GLDH）wasdetermined by ELISA method.The expression ofhypoxia inducible factor-1α（HIF-1α）in livertissue was detected by immunohistochemical method.The liver tissue was examined by light microscope and transmission electron microscope（TEM）.Finally the differences among the groups were compared.Results There was no significant difference between group A and group B（P＞0.05）.Compared with group A，the liverfunction indexes ofALT，AST，GLDH and MDHexhibited significantincrease in group C，a higherexpression ofHIF-1αwas also observed，and the pathological observation showed severe damage of cell membrane and mitochondrion（P＜0.01）.The above indexes in groupD and group E were slightly elevated compared with group A，the change in group E was smaller than that of group D.There was no significantdifference between the two groups（P＞0.05）.The above indexes change in group D and group E were lighter than those in group C（P＜0.05）.Conclu?sion rHuPON1K192 hasa protective effecton liverinjury induced by chlorpyrifospoisoning.

SD rat；chlorpyrifos；rHuPON1K192；liver injury

R575.5

A

0258-4646（2016）02-0101-06

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.02.002

國(guó)家自然科學(xué)基金（81171793）；盛京自由研究者計(jì)劃

張帆（1989-），女，醫(yī)師，碩士研究生.

趙敏，E-mail：zhaom@sj-hospital.org

2015-10-20

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