香椿老葉中黃酮與皂苷的含量測(cè)定

趙艷霞，劉常金，宛紅穎

（1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，山東濟(jì)寧272067；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院天津300457）

香椿老葉中黃酮與皂苷的含量測(cè)定

趙艷霞1，劉常金2，宛紅穎2

（1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，山東濟(jì)寧272067；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院天津300457）

以香椿老葉為材料，以乙醇為提取溶劑，對(duì)提取物中的黃酮和皂苷含量進(jìn)行測(cè)定，使用HPLC方法對(duì)黃酮的種類(lèi)進(jìn)行了初步鑒定。結(jié)果表明，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，香椿老葉中黃酮和皂苷的百分含量分別為（6.615±0.02）%和（3.917±0.05）%。HPLC結(jié)果表明，香椿老葉中的黃酮主要有3種，并含有1種非黃酮類(lèi)的酚類(lèi)物質(zhì)，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，4種化合物的百分含量分別為：蘆?。?.55±0.01）%、槲皮素（2.27±0.05）%、山奈酚（1.31±0.01）%、沒(méi)食子酸（0.87±0.02）%。

香椿；黃酮；皂苷；酚類(lèi)物質(zhì)

香椿（Toona sinensis）是我國(guó)著名的傳統(tǒng)木本蔬菜，屬于楝科香椿屬多年生落葉喬木，其嫩芽具有獨(dú)特的香氣，富含多種營(yíng)養(yǎng)素，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。香椿的種子、根皮、葉片等部位可以作為中草藥進(jìn)行配伍，具有多種醫(yī)療保健作用，含有多種生物活性成分。陳鐵山等對(duì)香椿種子、葉片中主要的化學(xué)成分以及種子揮發(fā)油進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)香椿葉中含有黃酮、萜類(lèi)、蒽醌、內(nèi)酯、皂苷、鞣質(zhì)、生物堿等重要藥用成分，種子含有醛、酮、萜類(lèi)、皂苷、甾體、硫醇類(lèi)化合物、多元醇類(lèi)化合物、芳香族類(lèi)化合物等［1］。劉忠良等運(yùn)用GCMS分析了香椿籽油中的化學(xué)成分，分離并鑒定出39個(gè)組分，得到的主要化學(xué)成分為萜烯類(lèi)（多為倍半萜類(lèi)），其中含量較多的為反-石竹烯、白菖烯、γ-欖香烯、α-長(zhǎng)蒎烯等［2］。程傳格等采用正己烷回流萃取得到香椿籽油并進(jìn)行皂化-甲酯化，通過(guò)GC-MS方法鑒定出39種成分，包括22種為脂肪酸，占94.4%，其中亞油酸的含量最高達(dá)83.4%，其次是棕櫚酸和硬脂酸，17種為萜烯類(lèi)化合物，占4.0%［3］。谷月玲等采用GCMS對(duì)同步蒸餾萃取得到的香椿葉精油進(jìn)行了分析，共定性鑒定出55種化合物，其中含氧化合物38種，有酯14種、醇15種、醛和酮7種、含氮化合物2種，碳?xì)漕?lèi)化合物15種［4］。張仲平等發(fā)現(xiàn)香椿葉中含有豐富的小分子鞣質(zhì)、原花色苷、黃酮醇苷、皂苷、有機(jī)酸等，利用薄層色譜分析（TLC）得到香椿葉經(jīng)水解后的苷元主要是槲皮素、山萘酚；多酚中含黃酮類(lèi)苷和苷元、沒(méi)食子酸、沒(méi)食子兒茶素縮合鞣質(zhì)、沒(méi)食子鞣質(zhì)、單體原花青素等成分，其中香椿葉中黃酮含量經(jīng)過(guò)高效液相色譜法（HPLC）定量分析得出高于相同生長(zhǎng)期的銀杏葉1倍多［5］。李秀信等對(duì)香椿果殼、果實(shí)部位黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行了分析研究，結(jié)果表明，香椿果殼及果實(shí)中含有黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇等多種黃酮類(lèi)化合物［6］。由于產(chǎn)地不同和品種不同，香椿中的黃酮、酚類(lèi)及皂苷等物質(zhì)含量不同，對(duì)于中草藥的功效會(huì)產(chǎn)生一定的影響。王昌祿等對(duì)香椿的三萜皂苷含量進(jìn)行了分析測(cè)定，發(fā)現(xiàn)香椿中皂苷的含量較高［7］。劉常金等對(duì)于不同季節(jié)和產(chǎn)地的香椿黃酮和皂苷進(jìn)行了分析測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地和品種的香椿黃酮和皂苷存在明顯差異［8］。

本研究以山東省曲阜市產(chǎn)的香椿老葉為材料，測(cè)定了其中的黃酮與皂苷含量，并對(duì)黃酮的主要單體物質(zhì)進(jìn)行了初步鑒定，目的是為香椿功效成分研究和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1　儀器及材料

1.1材料

香椿老葉2014年秋季采自山東省曲阜市香椿基地，采收后自然晾曬，干燥后粉碎成60目粉末，冰箱中保存。

1.2試劑

人參皂苷、蘆丁、沒(méi)食子酸、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品：均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品研究所；氫氧化鈉：天津北方天醫(yī)試劑廠(chǎng)；高氯酸：天津北方天醫(yī)試劑廠(chǎng)；香草醛：上海靜融生物科技有限公司；乙醇：天津化學(xué)試劑一廠(chǎng)。

1.3試驗(yàn)儀器

TE214S電子天平：賽多科斯科學(xué)儀器有限公司；SHB-3型循環(huán)水式多用真空泵、R-1001N旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；HL-1S恒流泵、BS-100A自動(dòng)部分收集器：上海瀘西分析儀器廠(chǎng)有限公司；Venusil MP-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm）：天津博納艾杰爾科技有限公司；ZF-C型三用紫外分析儀：上海長(zhǎng)明光學(xué)電子儀器廠(chǎng)；HPLC 2489型：WATERS公司。

2　試驗(yàn)方法

2.1提取方法

將香椿老葉置于烘箱內(nèi)（55℃）充分烘干24 h，將干燥后的香椿葉用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，然后過(guò)60目篩，香椿老葉粉在冰箱存放備用。

稱(chēng)取1 kg香椿葉粉，采用事先優(yōu)化的最佳提取工藝進(jìn)行浸提，用15 L體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇60℃水浴震蕩提取2 h后抽濾，濾渣加入15 L體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇60℃再次水浴振蕩提取2 h，合并兩次提取液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，減壓濃縮，得到香椿黃酮和皂苷的粗提液。

2.2總黃酮的測(cè)定

2.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

采用NaNO2-Al（NO3）3比色法測(cè)定總黃酮的含量，準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶解，最后用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇定容至100 mL，裝入棕色瓶中置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?zhǔn)確吸取1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液定容至50 mL，搖勻得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣液，分別吸取0、12、15、18、21、24、27、30 mL于50 mL容量瓶，然后加入1.5 mL 5%NaNO2溶液后搖勻，6 min后加入1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al（NO3）3溶液，搖勻，放置6 min后加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4% NaOH的溶液，混勻后用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇定容到刻度，搖勻，15 min后，以第一支試管溶液為空白，在510 nm的條件下測(cè)定吸光值，以蘆丁添加量（mg）為橫坐標(biāo)，以吸光值A(chǔ)作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.2.2提取液中總黃酮的含量測(cè)定

取香椿提取液過(guò)濾，將濾液置于容量瓶并定容至100 mL作為待測(cè)液，取1 mL待測(cè)液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方法測(cè)其吸光度。根據(jù)以下公式計(jì)算提取液中總黃酮的含量，計(jì)算公式：

式中：W為香椿老葉子中總黃酮的含量，mg/g；m1為由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)換算得的總黃酮質(zhì)量，mg；m2為稱(chēng)取香椿老葉子的質(zhì)量，g；V為添加待測(cè)提取液的體積，mL。

2.3總皂苷的測(cè)定

2.3.1人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

采用香草醛-冰乙酸比色法測(cè)定總皂苷含量。準(zhǔn)確稱(chēng)取人參皂苷20 mg，加入到10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度，得到質(zhì)量濃度為2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液25、50、75、100、125 μL于刻度試管，揮發(fā)干溶劑，冷卻后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL，再加入高氯酸0.8 mL，充分混勻，蓋塞后密封，60℃條件下水浴15 min，冷至室溫加冰乙酸5 mL，搖勻后于560 nm的條件下比色測(cè)定吸光值，以人參皂苷添加量（mg）為橫坐標(biāo)，以吸光值A(chǔ)作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.3.2提取液中總皂苷的含量測(cè)定

取香椿提取液過(guò)濾，將濾液置于容量瓶并定容至100 mL作為待測(cè)液，準(zhǔn)確吸取待測(cè)液100 μL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相同的測(cè)定方法測(cè)吸光度。根據(jù)以下公式計(jì)算提取液中總皂苷的含量，計(jì)算公式：

式中：W為香椿老葉子中總皂苷的含量，mg/g；m1為由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)換算得的總皂苷質(zhì)量，mg；m2為稱(chēng)取香椿老葉子的質(zhì)量，g；V為添加待測(cè)液的體積，mL。

2.4香椿中黃酮各組分的HPLC分析

2.4.1高效液相色譜條件

泵：二元梯度泵，流速為1.0 mL/min；色譜柱：C18柱（250 mm×5 mm，5 μm），柱溫40℃；流動(dòng)相A：100%純甲醇；流動(dòng)相B：0.1%磷酸水溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)：255nm。梯度洗脫的時(shí)間和洗脫液配比見(jiàn)表1。

表1　梯度洗脫的時(shí)間和洗脫液配比Table 1　Gradient elution and solution A and solution B ratio

2.4.2線(xiàn)性條件

精確稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品10.00 mg置于10 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇溶解并定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為1.000 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

精確稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品0.9700mg置于10mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇溶解并定容到刻度，得到質(zhì)量濃度為0.097 00 mg/mL的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液。

精確稱(chēng)取槲皮素對(duì)照品10.00 mg置于10 mL容量瓶中，用80%甲醇溶解并定容到刻度，得到質(zhì)量濃度為1.000 mg/mL的槲皮素對(duì)照品溶液。

精確稱(chēng)取山奈酚對(duì)照品1.020 mg置于10 mL容量瓶中，用80%甲醇溶解并定容到刻度，得到質(zhì)量濃度為0.1020 mg/mL的山奈酚對(duì)照品溶液。

精確吸取上述配制好的蘆丁對(duì)照品溶液0.48 mL、沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液2.8mL、槲皮素對(duì)照品溶液0.70mL、山奈酚對(duì)照品溶液2.1 mL于10 mL容量瓶中混勻，然后用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液定容，得到混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。然后將混合標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋為1/8、2/8、4/8和6/8的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確按2.4.1的色譜條件，對(duì)配制好的不同濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL，每個(gè)濃度測(cè)定5次取其平均值，以峰面積為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程。

3　結(jié)果與分析

3.1香椿總黃酮與總皂苷的含量測(cè)定

3.1.1香椿總黃酮的含量測(cè)定

3.1.1.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)分光光度法制定黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以蘆丁的含量為（mg）橫坐標(biāo)X，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得到蘆丁添加量X與吸光度Y關(guān)系曲線(xiàn)的回歸方程為：y=0.254 7x+0.001 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4（如圖1），線(xiàn)性范圍為：0～3.0 mg。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1　The standard curve of rutin reference

3.1.1.2提取液中總黃酮的含量

按照方法中的提取方法，對(duì)3份香椿老葉進(jìn)行提取，分別測(cè)定3份香椿中黃酮的含量，每份平均測(cè)定3次，最后取其平均值，經(jīng)過(guò)換算得到香椿老葉中總黃酮的百分含量為（6.615±0.02）%。

3.1.2香椿總皂苷的含量測(cè)定

3.1.2.1人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

以人參皂苷為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛法制定總皂苷測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以人參皂苷的量為（mg）橫坐標(biāo)x，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得到人參皂苷添加量X與吸光度值Y關(guān)系曲線(xiàn)的回歸方程為：y= 3.798 7x-0.012 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2（如圖2），線(xiàn)性范圍0～0.22 mg。

圖2　人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2　The standard curve of ginsenoside reference

3.1.2.2提取液中總皂苷的含量

按照與黃酮提取相同的方法分別處理3份香椿老葉，分別測(cè)定3份香椿中總皂苷的含量，每份平均測(cè)定3次，最后取其平均值，經(jīng)過(guò)換算得到香椿干葉中總皂苷的百分含量為（3.917±0.05）%。

3.2香椿黃酮中的各組分的高效液相色譜分析

3.2.1香椿黃酮中的各組分的液相色譜圖

采用蘆丁、槲皮素、山奈酚、沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC分析，同時(shí)分析香椿提取液及酸解后的主要黃酮苷元和酚類(lèi)物質(zhì)，結(jié)果如圖3所示。

圖3　蘆丁、槲皮素、山奈酚、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜Fig.3　HPLC graph of standard including rutin，quercetin，kaempferol and gallic acid

3.2.2精密度試驗(yàn)

圖4　香椿提取液酸解前的HPLC圖譜Fig.4　HPLC graph of TS extract before acid hydrolysis

圖5　香椿提取液酸解后的HPLC圖譜Fig.5　HPLC graph of TS extract after acid hydrolysis

蘆丁、沒(méi)食子酸、槲皮素、山奈酚的質(zhì)量濃度分別為48、27、70、21 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，計(jì)算相應(yīng)的RSD值分別為：0.313%、0.92%、0.316%、1.013%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

蘆丁、沒(méi)食子酸、槲皮素、山奈酚質(zhì)量濃度分別為48、27、70、21 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液在配制0、2、4、8、10、24 h后分別重復(fù)進(jìn)樣5次，根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，計(jì)算相應(yīng)的RSD值分別為：0.34%、1.125%、0.335%、1.176%，結(jié)果表明，供試樣品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.4香椿提取液中黃酮各組分的含量測(cè)定

提取液樣品中蘆丁、沒(méi)食子酸、槲皮素、山奈酚的含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　香椿老葉中主要酚類(lèi)物質(zhì)含量Table 2　The main phenolics of TS old leaves

4　結(jié)論

1）利用酒精浸提法，料液比為1∶15（kg/L），60℃振蕩提取2 h后得到香椿的粗提取液。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2-Al（NO3）3比色法測(cè)定得到香椿老葉中總黃酮的百分含量為（6.615±0.02）%；以人參皂苷為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛-冰醋酸的方法測(cè)定得到香椿干葉中總皂苷的百分含量為（3.917±0.05）%。

2）通過(guò)對(duì)香椿提取液中各組分HPLC分析，得出香椿提取物中蘆丁、槲皮素、山奈酚、沒(méi)食子酸的百分含量分別為（1.55±0.01）%、（2.27±0.05）%、（1.31±0.01）%、（0.87±0.02）%。

本研究表明，曲阜生產(chǎn)的香椿老葉中含有豐富的抗氧化活性物質(zhì)黃酮、酚類(lèi)物質(zhì)及皂苷等，適合作為生產(chǎn)抗氧化天然產(chǎn)物的提取原料，為開(kāi)發(fā)保健品和天然抗氧化劑提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

［1］陳鐵山，羅忠萍，崔宏安，等．香椿化學(xué)成分的初步研究［J］．陜西林業(yè)科技，2000（2）：1－2

［2］劉忠良，馬天波，孫立明.香椿籽揮發(fā)油的GC－MS［J］．中國(guó)藥學(xué)雜志，2002，37（2）：94－96

［3］程傳格，王曉，江婷，等．香椿籽油成分的GC－MS分析［J］．分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2001，20（4）：74－76

［4］谷月玲，胡耿源，傅水玉．香椿葉精油成分的研究（2）香椿葉精油的GC/MS定性分析［J］．質(zhì)譜學(xué)報(bào)，1994，17（4）：57－59

［5］張仲平，孫英，牛超，等．香椿多酚類(lèi)化介物的提取、分離和薄層研究［J］．中國(guó)野生植物資源，2002，21（4）：52－53

［6］李秀信，張?jiān)好瘢瑒⑶嗬?，等．香椿葉中黃酮成分的分析鑒定［J］．西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，16（增）：86－88

［7］王昌祿，欒穎，陳志強(qiáng)，等．薄層分離－分光光度法測(cè)定楝科植物中三萜皂苷含量［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（14）：5708－5712

［8］劉常金，江慎華，王昌祿，等.不同季節(jié)與產(chǎn)地香椿黃酮與皂苷的含量變化［J］.天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，21（1）：18-20

Determination of Flavonoids and Saponins in Old Leaves of Toona sinensis

ZHAO Yan-xia1，LIU Chang-jin2，WAN Hong-ying2
（1.Institute of Forensic Medicine and Laboratory Medicine，Jining Medical University，Jining 272067，Shandong，China；2.School of Food Science and Technology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The contents of flavonoids and saponins in Toona sinensis（TS）old leaves were determined with alcoholic solution as extracting solvents，and the detailed components of flavonoids of TS were analyzed with HPLC method.The results showed that the percentage contents of flavonoids and saponins in TS old leaves amounted to（6.615±0.02）%and（3.917±0.05）%，respectively.There were three kinds of flavonoids and one polyphenols in extracts with HPLC analysis，and the content was as following，rutin（1.55±0.01）%，quercetin（2.27±0.05）%and kaempferol（1.31±0.01）%，gallic acid（0.87±0.02）%，respectively.

Toona sinensis；flavonoids；saponins；phenolics

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.031

趙艷霞（1969—），女（漢），高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。

2015-12-14