高產(chǎn)γ-氨基丁酸酵母菌的篩選、鑒定及優(yōu)化

肖 婧，徐亞男，李 琦，張彥位，劉 研，史學(xué)偉*

（1.石河子大學(xué) 信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 石河子832000；2.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子832000）

高產(chǎn)γ-氨基丁酸酵母菌的篩選、鑒定及優(yōu)化

肖 婧1，徐亞男2，李 琦2，張彥位2，劉 研2，史學(xué)偉*2

（1.石河子大學(xué) 信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 石河子832000；2.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子832000）

從新疆特色食品中篩選出能產(chǎn)γ-氨基丁酸的酵母菌菌株，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。采用非釀酒酵母菌分離純化的方法分離出非釀酒酵母菌，再通過初篩、復(fù)篩及誘變挑選出高產(chǎn)γ-氨基丁酸的菌株，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)及26S rRNA基因分析，最后對(duì)菌株產(chǎn)γ-氨基丁酸的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)26S rRNA基因序列分析鑒定為葡萄汁有孢漢生酵母XYN019（H.uvarum XYN019）；通過紫外誘變產(chǎn)量提高了2.3倍，最佳誘變時(shí)間為30 s，誘變濃度為10-5；優(yōu)化后的理論發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度33.95℃，pH值5.01，培養(yǎng)時(shí)間49.17 h，接種量為體積分?jǐn)?shù)3.17%，其γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度達(dá)到4.926 g/L。以上結(jié)果表明，該菌株可作為γ-氨基丁酸產(chǎn)生菌，具有較好的γ-氨基丁酸生產(chǎn)潛力。

γ-氨基丁酸；分離篩選；鑒定；非釀酒酵母菌

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）又稱氨酪酸，是一種天然存在的非蛋白質(zhì)功能性氨基酸［1］，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)［2］。GABA具有多種生理功能，如參與抗心律失常、降血壓［3-4］、改善腦機(jī)能、抑制神經(jīng)遞質(zhì)［5］、調(diào)節(jié)心血管［6-7］、增強(qiáng)記憶、鎮(zhèn)靜安神［8］、活化肝腎。自然界中，GABA廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，但其在動(dòng)物和植物中含量較低，不容易被提取，因此微生物發(fā)酵是目前生產(chǎn)GABA的主要方式。其中產(chǎn)GABA的菌株主要有乳酸菌、大腸桿菌和酵母菌等。

雖然發(fā)酵γ-氨基丁酸所用菌種中最為常見的是大腸桿菌，但大腸桿菌在安全衛(wèi)生方面存在極大隱患，制約了γ-氨基丁酸的生產(chǎn)和開發(fā)。己有研究發(fā)現(xiàn)，一些高安全的微生物，如乳酸菌、酵母菌、曲霉等也具有GAD（谷氨酸脫羧酶）活性，可以進(jìn)行GAD的提取和GABA的生產(chǎn)，但均存在γ-氨基丁酸的產(chǎn)量不高等問題。酵母菌因其安全性較高，并且具有較高的營養(yǎng)價(jià)值而被廣泛應(yīng)用于食品等工業(yè)。酵母菌與食品工藝的關(guān)系密切，因此篩選高產(chǎn)GABA的酵母菌菌株具有較高的經(jīng)濟(jì)效益［9］。通過誘變的方法選育出高產(chǎn)γ-氨基丁酸的酵母菌株，進(jìn)行γ-氨基丁酸的發(fā)酵生產(chǎn)，具有重要的意義［10］。

本試驗(yàn)中通過紫外誘變的方法輔助篩選高產(chǎn)γ-氨基丁酸酵母菌產(chǎn)生菌株，確定其最優(yōu)化發(fā)酵條件。以便作為食品添加劑原料或直接應(yīng)用于生產(chǎn)當(dāng)中，為工業(yè)化生產(chǎn)γ-氨基丁酸提供了基礎(chǔ)條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 新疆石河子張?jiān)ＬO果園腐爛蘋果，新疆維吾爾族人自制奶酪，新疆石河子張?jiān)Ｆ咸褕@葡萄表皮及葡萄園土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基

賴氨酸培養(yǎng)基（g/L）：賴氨酸5.6，葡萄糖10.0，KH2PO41.0，MgSO400.5，瓊脂 20.0，121℃滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基 （g/L）：酵母浸粉10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖20.0。

γ-氨基丁酸篩選培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸粉10.0，蛋白胨20.0，瓊脂20.0，葡萄糖20.0，溴甲酚綠0.001，乙醛酸0.02，琥珀酸0.02。

1.1.3 儀器 Seven Excellence S400型pH計(jì)，梅特勒托利儀器（上海）有限公司制造；SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼電熱蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠制造；Mini-14K高速離心機(jī)，上海昨非實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司制造；數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器，金壇市精達(dá)儀器制造廠制造；Power Cycler Gradient SL PCR儀，德國耶拿分析儀器股份公司制造；IEF-SYS瓊脂糖凝膠電泳儀，英國 Biochrom有限公司制造；LC98I-3A氨基酸分析儀，蘇州華美辰儀器設(shè)備有限公司制造。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化 樣品經(jīng)破碎后進(jìn)行自然發(fā)酵，發(fā)酵啟動(dòng)后在整個(gè)發(fā)酵過程中定期取樣，以不同濃度梯度涂布于賴氨酸培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h，劃線分離；重復(fù)多次直至得到單菌落后，接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h后，保存于-80℃冰箱。

1.2.2 菌株篩選 活化菌株按體積分?jǐn)?shù)5%接種量接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min搖床培養(yǎng) 48 h后涂布于篩選培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落顏色，能產(chǎn)生GABA菌株的菌落顯綠色，挑選綠色單菌落保存，備用。

1.2.3 菌株誘變 先開啟紫外燈，預(yù)熱20 min以穩(wěn)定光源。取5 mL不同稀釋度的菌懸液置于6 cm無菌空培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿放置于磁力攪拌器上，在18 W的紫外燈下，距離25 cm處，打開皿蓋，在攪拌狀態(tài)下分別照射不同時(shí)間。各取0.1 mL菌液于試管中，且試管立即放置在冰浴上 l～2 h，低溫條件下細(xì)胞內(nèi)參與突變的各種酶活性受到抑制，使修復(fù)難以進(jìn)行。取0.1 mL涂布于酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，28℃避光培養(yǎng)，3 d后統(tǒng)計(jì)菌落總數(shù)，取平均值，以未經(jīng)誘變的平板上的菌落數(shù)作為參照，計(jì)算致死率。

式 （1）中：D為致死率，Ta為被處理后的活菌數(shù)，Tn是未被處理的活菌數(shù)。

1）誘變時(shí)間的確定：稀釋后的菌液分別紫外照射0、5、10、15、20、25、30 s，取0.1 mL涂布于酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，計(jì)算致死率。

2）誘變濃度的確定：取0.1 mL照射后的菌液梯度稀釋，將10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7濃度的菌液0.1 mL用三角玻璃棒涂布于酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，然后置于28℃培養(yǎng)箱中保存3 d，計(jì)算致死率。

以最佳誘變時(shí)間和濃度對(duì)產(chǎn)GABA菌株進(jìn)行誘變，測定誘變前后γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度的變化。

1.2.4 定量定性分析

1）γ-氨基丁酸紙層析定性分析：小燒杯盛有約20 mL展開劑，置于倒置的層析缸中，用塑料薄膜密封，平衡30 min；取層析濾紙一張，在紙的下端距邊緣2 cm處用鉛筆劃一條直線，在此直線上每間隔2 cm作一記號(hào)；用微量注射器分別取2 μL菌懸液和γ-氨基丁酸標(biāo)液，分別點(diǎn)在標(biāo)記位置上，吹干后再點(diǎn)2次，用線將濾紙縫成筒狀。將盛有約20 mL展開劑的培養(yǎng)皿迅速置于密閉的層析缸中，將濾紙點(diǎn)樣端朝下直立于培養(yǎng)皿中。待溶劑上升15～20 cm時(shí)即取出濾紙，噴茚三酮顯色；用電吹風(fēng)吹干濾紙，使各層析斑點(diǎn)顯色，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

2）定量分析：將篩選出的菌株發(fā)酵液離心后去上清液，加三氯乙酸終止反應(yīng)后，離心取上清液1 mL，用氨基酸自動(dòng)分析儀精確測定 γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度。

1.2.5 菌株的分子生物學(xué)鑒定 采用酵母基因組DNA提取試劑盒提取試驗(yàn)菌株DNA，以所得DNA基因組為模板，利用ITS1和ITS4為引物擴(kuò)增ITS區(qū)的基因，PCR反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)［11］，將擴(kuò)增產(chǎn)物送到北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序；將ITS序列輸入NCBI（美國國家生物信息中心）的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，分析序列同源性，確定該菌株的分類地位。

1.2.6 高產(chǎn)γ-氨基丁酸酵母菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

1）溫度對(duì)酵母菌產(chǎn)GABA的影響：分別在培養(yǎng)溫度為20、25、30、35、40、45℃下培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液中GABA含量，確定最佳培養(yǎng)溫度。

2）pH對(duì)酵母菌產(chǎn)GABA的影響：分別在pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5下培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液中GABA含量，確定最佳pH值。

3）接種量對(duì)酵母產(chǎn)GABA的影響：分別在接種量為體積分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%、5%，測定發(fā)酵液中GABA含量，確定最佳接種量。

4）培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酵母菌產(chǎn)GABA的影響：分別在培養(yǎng)時(shí)間為12、24、36、48、60、72 h，測定發(fā)酵液中GABA質(zhì)量濃度，確定最佳培育時(shí)間。

5）響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件：在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以pH、溫度、培養(yǎng)時(shí)間和接種量為考察因素，以酵母菌產(chǎn)GABA質(zhì)量濃度為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，確定最適培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

樣品經(jīng)處理后利用非釀酒酵母菌篩選培養(yǎng)基（賴氨酸培養(yǎng)基），分離出78株非釀酒酵母菌，經(jīng)篩選培養(yǎng)基及紙層析定性分析，得到4株產(chǎn)γ-氨基丁酸酵母菌株。結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株誘變篩選結(jié)果（菌落顏色）Fig.1 Screening results γ-aminobutyric acid producing strain mutation

圖2 γ-氨基丁酸紙層析分析結(jié)果Fig.2 Chromatography paper of GABA

2.2 菌株誘變選育

表1 菌株誘變選育對(duì)GABA產(chǎn)量的影響Table 1 Effect of mutation on GABA

經(jīng)紫外誘變處理后A3、Y16、N3、N8四株菌株的GABA含量明顯升高，其中N8菌株含量升高最明顯，由此可見，紫外誘變對(duì)于菌株GABA產(chǎn)量的增加有明顯促進(jìn)作用。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 溫度對(duì)酵母菌產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響 發(fā)酵條件為：250 mL的搖瓶裝液量25 mL，接種量體積分?jǐn)?shù)3%，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，pH 7.0。在此條件下將搖瓶分別放在20、25、30、35、40、45℃5個(gè)溫度梯度下培養(yǎng)72 h。測定發(fā)酵液中γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度，結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對(duì)GABA產(chǎn)量的影響Fig.3 Influence of temperature in GABA

由圖3可知，隨著培養(yǎng)溫度的增加，GABA質(zhì)量濃度先增加后降低，培養(yǎng)溫度為35℃時(shí)，GABA質(zhì)量濃度達(dá)到最高值3.17 g/L，菌株最佳發(fā)酵溫度為35℃。

2.3.2 pH值對(duì)酵母產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響 發(fā)酵條件為：250 mL的搖瓶裝液量25 mL，接種體積分?jǐn)?shù)3%，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，調(diào)節(jié)搖瓶中的起始pH值，分別在pH值4、4.5、5、5.5、6、6.5環(huán)境下培養(yǎng)72 h。測定發(fā)酵液中γ-氨基丁酸含量，結(jié)果見圖4。

圖4 pH值對(duì)GABA產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of pH on GABA

由圖4可知，隨著pH的升高，GABA質(zhì)量濃度先升高后降低［11］，說明pH值的高低對(duì)于菌株產(chǎn)GABA有一定影響。在pH為5時(shí)，GABA質(zhì)量濃度達(dá)到最高值，菌株最適pH值為5.0。

2.3.3 接種量對(duì)酵母產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響 在溫度為30℃，250 mL的搖瓶裝液量25 mL，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，pH 7.0條件下，在搖瓶中加入接種量分別為體積分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%、5%的菌液，培養(yǎng)72 h后，測定發(fā)酵液中γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度。由圖5可知，隨著接種量的增加，GABA質(zhì)量濃度先增加后降低，接種量達(dá)到4%和5%時(shí)，GABA質(zhì)量濃度變化不大，說明接種量超過體積分?jǐn)?shù)4%之后，對(duì)于GABA產(chǎn)量影響不大，菌株最適接種量均為體積分?jǐn)?shù)3%。

圖5 接種量對(duì)GABA產(chǎn)量的影響Fig.5 Influence of medium volume in GABA

2.3.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酵母產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響 在溫度為30℃、250 mL的搖瓶裝液量25 mL、接種量體積分?jǐn)?shù)3%、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、pH 7.0條件下，分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h，測定發(fā)酵液中γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度。由圖6可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液中GABA的產(chǎn)量不斷增加，在48 h前產(chǎn)量增加幅度較大，但48 h后繼續(xù)培養(yǎng)則GABA的產(chǎn)量小幅下降?？紤]到發(fā)酵時(shí)間延長，生產(chǎn)的周期也相應(yīng)延長，勢(shì)必增加生產(chǎn)成本，因此實(shí)驗(yàn)確定48 h作為生產(chǎn)GABA的最佳發(fā)酵周期［12］。

圖6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)GABA產(chǎn)量的影響Fig.6 Influence of Incubation time on GABA

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件

通過測定GABA含量，確定了GABA產(chǎn)量較高的菌株N8，通過單因素試驗(yàn)確定了試驗(yàn)菌株的最適溫度為35℃，最適pH值為5，最適接種量為體積分?jǐn)?shù)3%，最適培養(yǎng)時(shí)間為48 h。由此確定四因素三水平試驗(yàn)表，對(duì)高產(chǎn)GABA菌株進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，確定最適培養(yǎng)條件。

2.4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)模型方差分析 設(shè)計(jì)的因素水平編碼見表2。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)每個(gè)組合重復(fù)試驗(yàn)3次，GABA產(chǎn)量結(jié)果取其平均值，采用Design-Expert 8.0.0軟件分析試驗(yàn)結(jié)果。由表3回歸模型方差分析結(jié)果可以看出，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)模型P＜0.000 1，極度顯著，表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠；失擬項(xiàng)P=0.544 1＞0.05，不顯著，表明所建立的二次回歸模型成立，試驗(yàn)點(diǎn)均能用模型描述。

表2 GABA產(chǎn)量Box-Behnken設(shè)計(jì)因素及水平編碼Table 2 Coding and the level of GABA content in Box-Behnken design factors

表3 回歸模型的方差分析和回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 3 Analysis of variance for the established regression model and significance test of each regress ion coefficient

根據(jù)表3回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，A、C、D、A2、B2、C2、D2對(duì)GABA產(chǎn)量的影響極顯著，AB、AD、BD對(duì)GABA產(chǎn)量的影響顯著，B、AC、BC、CD對(duì)GABA產(chǎn)量的影響不顯著。GABA產(chǎn)量影響因素依次為D＞C＞A＞B，即接種量＞培養(yǎng)時(shí)間＞溫度＞pH。

2.4.2 響應(yīng)面圖形分析 由圖7溫度與pH值的交互作用可以看出，溫度為34℃時(shí)，隨著pH的升高GABA的含量先增加后降低，溫度為34℃，pH為5.0時(shí)GABA產(chǎn)量達(dá)到最高點(diǎn)，此時(shí)GABA質(zhì)量濃度達(dá)到4.25 g/L。

圖7 溫度和pH兩因素及其交互作用響應(yīng)面和等高線Fig.7 Response surface and contour plots showing the effects of three process parameters on the extraction rate of safflower seed meal protein

由圖8溫度與接種量的交互作用可以看出，溫度為34℃時(shí)，隨著接種量的增加GABA的產(chǎn)量先增加后降低，但是下降幅度不大；溫度為34℃，接種量為體積分?jǐn)?shù)3%時(shí)GABA產(chǎn)量達(dá)到最高點(diǎn)，此時(shí)GABA質(zhì)量濃度達(dá)到4.25 g/L。

由圖9 pH與接種量的交互作用可以看出，pH為5.0時(shí)，隨著接種量的增加GABA的產(chǎn)量先增加后降低，接種量從體積分?jǐn)?shù)2%到3%上升幅度較大，pH為5.0，接種量為體積分?jǐn)?shù)3%時(shí)GABA產(chǎn)量達(dá)到最高點(diǎn)，此時(shí)GABA質(zhì)量濃度達(dá)到4.25 g/L。

圖8 溫度和接種量兩因素及其交互作用響應(yīng)面和等高線Fig.8 Response surface and contour plots showing the effects of three process parameters on the extraction rate of safflower seed meal protein

圖9 pH值與接種量兩因素及其交互作用響應(yīng)面和等高線Fig.9 Response surface and contour plots showing the effects of three process parameters on the extraction rate of safflower seed meal protein

2.4.3 模型驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)模型的響應(yīng)面圖和等高線圖可以直觀地分析出各自變量之間的關(guān)系及顯著性，模型分析最佳條件為培養(yǎng)溫度 33.95℃，pH值5.01，培養(yǎng)時(shí)間 49.17 h，接種量為體積分?jǐn)?shù)3.17%。將N8菌株分別接入經(jīng)過優(yōu)化后的最佳條件培養(yǎng)基中，采用比色法測定GABA產(chǎn)量。優(yōu)化后的GABA產(chǎn)量為 4.926 g/L，試驗(yàn)值與模型計(jì)算值相差+2%，模型對(duì)實(shí)際發(fā)酵的情況可以較好地預(yù)測，證明響應(yīng)面分析法對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化是可行有效的。

3 討論

目前國內(nèi)外對(duì)于乳酸菌產(chǎn)γ-氨基丁酸的研究較多，但對(duì)于酵母菌的研究較少，誘變選育研究則更是少。通過初篩、復(fù)篩及誘變挑選出高產(chǎn)γ-氨基丁酸的菌株，其中最佳誘變劑量為：最佳誘變時(shí)間為30 s，誘變濃度為10-5。經(jīng)過多次篩選測定菌株γ-氨基丁酸含量，篩選出高產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株N8（Hanseniaspora.sp），其γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度高達(dá)4.55 g/L，比誘變前產(chǎn)量提高了2.3倍，說明本次試驗(yàn)方法有效。通過單因素和四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化菌株最適發(fā)酵條件，利用Design-Expert軟件對(duì)Box-Behnken設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到理論結(jié)果：培養(yǎng)溫度 33.95℃，pH值5.01，培養(yǎng)時(shí)間 49.17 h，接種量為體積分?jǐn)?shù)3.17%，優(yōu)化后的γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度也達(dá)到了4.926 g/L，與預(yù)測值相差不大，表明優(yōu)化條件符合要求。比胡超［10］等報(bào)道的酵母產(chǎn)GABA量2.588 g/L提高很多。

4 結(jié)語

酵母菌是重要的微生物資源［11］，在釀造、食品、醫(yī)藥等工業(yè)占有重要的地位。各種以酵母為原料或載體的食品和添加劑都得到了很好的推廣，其中既有酵母本身的有利條件，也說明了社會(huì)對(duì)酵母菌這種微生物的認(rèn)可［12］。隨著GABA的生理功能研究不斷深入，對(duì)GABA的研究開發(fā)已經(jīng)成為新的熱點(diǎn)。利用微生物自然資源，分離篩選新功能的酵母菌，生產(chǎn)GABA功能性食品配料，是一種新的嘗試，也有利于微生物資源的開發(fā)和利用［13］。在現(xiàn)今社會(huì)，人們對(duì)日常的保健和飲食的要求越來越高，必將導(dǎo)致保健食品消費(fèi)的熱潮，因此高產(chǎn)GABA的酵母菌株的開發(fā)應(yīng)用將有良好的前景［14］。

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科技信息

美國規(guī)定2016年6月起嬰兒奶粉須含硒

美國食品及藥物管理局（FDA）于2015年6月通過一項(xiàng)最終規(guī)則，修訂關(guān)于嬰兒配方奶粉營養(yǎng)規(guī)格及標(biāo)簽的規(guī)例，要求必須把硒加入所需營養(yǎng)清單，并訂立嬰兒配方奶粉最低及最高的硒含量。該項(xiàng)最終規(guī)則的生效日期已確定為2016年6月22日?！睹绹称?、藥品及化妝品法》規(guī)定嬰兒配方奶粉必須含有29種指定營養(yǎng)，并為各種營養(yǎng)訂立最低含量水平，也為其中9種營養(yǎng)訂立最高含量水平。FDA最初為嬰兒配方奶粉訂立營養(yǎng)規(guī)格時(shí)，未有把硒列為必要營養(yǎng)。其后，硒被認(rèn)定為一種必要營養(yǎng)，遂于今年6月決定把硒列入所需營養(yǎng)清單，并規(guī)定嬰兒配方奶粉須標(biāo)明每100千卡的硒含量。同時(shí)要求嬰兒配方奶粉的最低及最高硒含量分別為2.0微克/100千卡和7.0微克/100千卡。

［信息來源］國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.美國規(guī)定2016年6月起嬰兒奶粉須含硒 ［EB/OL］.（2016-6-22）.http:// www.aqsiq.gov.cn/xxgk_13386/tzdt/gzdt/201606/t20160622_468802.htm

Screening，Identification and Optimizing of γ-Aminobutyric Acid Production in Yeast

XIAO Jing1，XU Yanan2，LI Qi2，ZHANG Yanwei2，LIU Yan2，SHI Xuewei*2

（1.College of Information Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832000，China；2.College of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000，China）

A strain with capability of producing γ-aminobutyric acid was isolated from the traditional food in Xinjiang and the fermentation conditions were optimized.Non-Saccharomyce yeast were isolated and further used to screen the strain with high yield of γ-aminobutyric acid.The isolated strain was identified as Hanseniaspora uvarum XYN019 by morphology and phylogenetic analysis based on the 26S rRNA sequence.The activity of amino acid production was 2.3 times higher as compared with the original one by UV mutagenesis.The optimum mutagenesis conditions are with 30s irradiation and 10-5concentration.The better transformation conditions as follows：initial pH 5.01，culture temperature 33.95℃，inoculum size 3.17%and culture time 49.17 h.In this condition，the yielding capacity of GABA by the mutant was 4.926 g/L.These results suggested that the strain can be used to produceγ-aminobutyric acid and has a higher converting capability of GABA.

γ-aminobutyric acid，screening，identification，non-Saccharomyce

TQ 925.6

A

1673—1689（2016）08—1093—07

2015-03-03

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)科技攻關(guān)項(xiàng)目（P20136500002-1146，2015AB016，2016AB009）；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)青年科技創(chuàng)新資金項(xiàng)目（DEC_PGUEIK_893341）；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)科技攻關(guān)與成果轉(zhuǎn)化計(jì)劃項(xiàng)目（2016AD024）。

肖 婧（1982—），女，甘肅會(huì)寧人，工學(xué)碩士，講師，主要從事生物信息學(xué)研究。E-mail：463091503@qq.com

*通信作者：史學(xué)偉（1980—），男，甘肅會(huì)寧人，工學(xué)博士，副教授，主要從事酵母菌種遺傳研究。E-mail：1549730027@qq.com