實時熒光PCR法檢測食品中梅花鹿成分

齊春萌， 楊昕霆，薛晨玉，趙琳娜， 侯彩云*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.北京市食品安全監(jiān)控與風(fēng)險評估中心，北京 100083）

實時熒光PCR法檢測食品中梅花鹿成分

齊春萌1， 楊昕霆2，薛晨玉2，趙琳娜2， 侯彩云*1

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.北京市食品安全監(jiān)控與風(fēng)險評估中心，北京 100083）

采用實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測食品中梅花鹿成分。通過對梅花鹿基因序列對比分析，選取種間差異大、種內(nèi)差異小的線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ基因序列作為靶序列，利用Primer Express、Oligo和DNAMAN等軟件設(shè)計了梅花鹿特異性的引物和TaqMan探針，并用已知樣本對引物和TaqMan探針的物種特異性、檢測靈敏度進(jìn)行驗證和檢測。實驗結(jié)果表明，引物和探針對梅花鹿成分檢測的特異性良好，與其他物種DNA無非目標(biāo)擴(kuò)增，對梅花鹿DNA的擴(kuò)增效率為91.68%，該方法的檢測靈敏度達(dá)0.42 pg/反應(yīng)。

物種鑒定；梅花鹿；實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；線粒體COX1基因

鹿是我國重要的傳統(tǒng)藥用經(jīng)濟(jì)動物之一，具有極高的藥用、觀賞和食用價值?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)和臨床研究表明，鹿制品具有治療心悸、失眠、健忘、風(fēng)濕等功效。鹿肉具有較高的營養(yǎng)價值，具備蛋白質(zhì)、磷脂、維生素含量高，脂肪、膽固醇含量低的特點［1］。鹿肉味道鮮美，易于消化，是難得的保健肉品。隨著人們生活水平的提高，近年來肉鹿養(yǎng)殖業(yè)得到了迅速發(fā)展，鹿肉逐漸走上了普通百姓的餐桌［2］。

我國是世界三大鹿肉生產(chǎn)國之一，是世界上馴養(yǎng)梅花鹿最多的國家［3］。梅花鹿是主要的鹿肉來源，屬于國家一級保護(hù)野生動物，其飼養(yǎng)、售賣等具有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。在消費(fèi)市場上，鹿肉的價格遠(yuǎn)高于牛、羊肉的售價，這給鹿肉的非法售賣、摻假造假創(chuàng)造了巨大的利潤空間。非法售賣、摻假造假的行為，不僅違反了國家法律法規(guī)，而且侵害了消費(fèi)者的切身利益。市場上梅花鹿成分的鑒定對保護(hù)梅花鹿，預(yù)防、打擊、制止不正當(dāng)行為，規(guī)范肉制品市場有著重要意義。

食品中動物源性成分鑒定的方法通常有蛋白質(zhì)鑒定和分子鑒定兩類［4-5］。蛋白質(zhì)鑒定以蛋白質(zhì)的電泳特性、酶活性、免疫活性為基礎(chǔ)，因此不適用于蛋白質(zhì)失活或活性差異小的物種的鑒定［6］。而核酸具有種間差異大、保守性高、穩(wěn)定性強(qiáng)的特點，因此以PCR為基礎(chǔ)的分子鑒定方法具有特異性好、靈敏度高、適用性廣等特點，近年來成為研究的熱點［7］。常用的PCR物種鑒定方法包括物種特異性PCR、PCR測序、實時熒光PCR等。其中實時熒光PCR具有操作簡單、自動化程度高、污染小、分析快速等優(yōu)點，已經(jīng)在豬、牛、雞、鴨、火雞、馬等大宗肉制品鑒定上有了廣泛的應(yīng)用研究［8-18］，而在鹿源性成分鑒定方面還鮮有報道。作者通過設(shè)計梅花鹿特異性的引物和TaqMan探針，旨在建立肉制品中梅花鹿源性成分的實時熒光PCR鑒定方法，為保護(hù)梅花鹿、保障鹿肉制品食用安全、制定相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 梅花鹿肉、馬肉、鵪鶉肉、鴿子肉、貓肉、三文魚肉、水貂肉、兔子肉、雞肉、綿羊肉、山羊肉、豬肉、狗肉、牛肉、鵝肉、小鼠肉、駱駝肉、鴨肉、大鼠肉等動物材料，均為作者所在實驗室自存；20個市售抽檢樣品，購自北京市農(nóng)貿(mào)市場；無水乙醇（分析純），北京化學(xué)試劑公司經(jīng)銷；QIAamp DNA Mini Kit提取試劑盒，購自QIAGEN公司；TaqMan實時熒光PCR預(yù)混合液（Premix Ex Taq），購自寶生物工程（大連）有限公司；引物、TaqMan探針，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.2 儀器 3K18型冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司制造；Mili-Q純水器，美國 Milipore公司制造；Biomedical freezer超低溫冰箱 （-40℃），日本SANYO公司制造；QIA Cube核酸自動提取儀，美國QIA Gene公司制造；ABI Steponeplus實時熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司制造；Qubit 2.0 Fluorometer熒光計，美國LifeTechnologies公司制造。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本DNA的提取 用QIAGEN DNA Mini Kit提取樣本DNA，步驟：

1）取25 mg樣品，切碎置于2.0 mL的離心管中，加入180 μL Buffer ATL和20 μL蛋白酶K，混合均勻后56℃裂解30 min至溶液澄清；

2）短暫離心去除壁上液體，加入200 μL Buffer AL，混勻后70℃溫育10 min；

3）短暫離心，加入200 μL無水乙醇后充分混勻，將液體轉(zhuǎn)移至離心柱（置于收集管上），扣上蓋子8 000 r/min離心1 min，棄掉濾液，將離心柱置于新的收集管上；

4）向離心柱中加入500 μL Buffer AW1，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心1 min，棄掉濾液，將柱子置于新收集管上；

5）向離心柱中加入500 μL Buffer AW2，以轉(zhuǎn)速14 000 r/min離心3 min，棄掉濾液，離心柱室溫晾置5 min；

6）將離心柱置于干凈的1.5 mL的收集管上，加入200 μL Buffer AE，室溫靜置1 min，6 000 g離心1 min，得 到 樣 本 DNA溶 液 。 用 Qubit 2.0 Fluorometer熒光計 （Qubit dsDNA BR Assay Kit試劑盒）測定DNA濃度，并置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用上述方法分別提取梅花鹿肉、馬肉、鵪鶉肉、鴿子肉、貓肉、三文魚肉、水貂肉、兔子肉、雞肉、綿羊肉、山羊肉、豬肉、狗肉、牛肉、鵝肉、小鼠肉、駱駝肉、鴨肉、大鼠肉等及市售抽檢樣品的DNA。

1.2.2 引物和TaqMan探針的設(shè)計 根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫已注釋的梅花鹿（Cervus nippon）線粒體COX1序列 （Accession Number：NC_006993.1），用DNAMAN軟件比對分析梅花鹿和豬、牛、羊、雞、鴨、小鼠、鵪鶉、鴿子、貓、狗等常見物種和其他親緣性近的物種的序列，選擇鴕鳥序列中特異性較強(qiáng)的片段作為靶序列，用Primer Express設(shè)計擴(kuò)增片段在100 bp左右的引物和TaqMan探針。用DNAMAN比較探針與梅花鹿、陰性對照序列的結(jié)合自由能與退火溫度，選取與梅花鹿DNA結(jié)合能最小、退火溫度最高的COX1 396引物和探針作后續(xù)研究。

1.2.3 樣本的測序鑒定 用COⅠ通用引物L(fēng)CO1490（5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'）和 HCO2198（5'-TAAACTTCAGGGTGACCAA AAAATCA-3'）［19］擴(kuò)增樣本DNA，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在NCBI中Blast搜索，以確定陽性樣本及非目標(biāo)陰性樣本的物種。

1.2.4 實時熒光PCR反應(yīng)體系與循環(huán)參數(shù) 實時熒光PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括：Premix buffer（2×）10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，TaqMan探針（10 μmol/L）1 μL，DNA溶液1 μL，無菌水將體系補(bǔ)充至總體積20 μL。實時熒光PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃延伸30 s，共40個循環(huán)。實時記錄反應(yīng)體系的熒光值。

1.2.5 引物和探針特異性的驗證 以梅花鹿DNA樣品為陽性對照，馬、鵪鶉、鴿子、貓、三文魚、水貂、兔子、雞、綿羊、山羊、豬、狗、牛、鵝、小鼠、駱駝、鴨、大鼠等非目標(biāo)物種DNA為陰性對照，以水代替DNA模板作為空白對照，每組做3個平行，進(jìn)行多次驗證。所有DNA模板的質(zhì)量濃度均稀釋至10 ng/μL。根據(jù)各反應(yīng)體系的Ct值考察引物與探針特異性。

1.2.6 擴(kuò)增效率與靈敏度的檢測 將梅花鹿DNA溶液稀釋至1、10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL，每個質(zhì)量濃度8個平行，設(shè)置空白對照進(jìn)行擴(kuò)增效率檢測實驗。根據(jù)各梯度的擴(kuò)增曲線的Ct值，建立Ct—lg［DNA］標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)擴(kuò)增效率計算公式

式（1）中，E為擴(kuò)增效率，s為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。得到PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率。以Ct值35為判斷標(biāo)準(zhǔn)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出Ct值為35時的DNA質(zhì)量濃度，作為該反應(yīng)體系的檢測靈敏度。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣本的測序鑒定

陽性樣本條形碼擴(kuò)增后進(jìn)行測序，將序列在NCBI進(jìn)行Blast搜索，結(jié)果見圖1。樣本序列與Cervus nippon線粒體DNA中序列的相似度大于99%，從而確定該陽性樣本為梅花鹿肉。陰性樣本的條形碼鑒定結(jié)果表明，陰性樣本與所標(biāo)物種一致。

圖1 梅花鹿DNA條形碼擴(kuò)增產(chǎn)物在NCBI中Blast搜索比對結(jié)果Fig.1 Sequence alignment of sika deer DNA amplification product

2.2 引物和探針的特異性驗證

用梅花鹿特異性引物和TaqMan探針對鹿和馬、鵪鶉、鴿子、貓、三文魚、水貂、兔子、雞、綿羊、山羊、豬、狗、牛、鵝、小鼠、駱駝、鴨、大鼠等陰性物種DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，鹿的擴(kuò)增曲線良好，陰性物種擴(kuò)增曲線的Ct值均大于35。此外，對狍子、三文魚、虹鱒魚、鱸魚、草魚等其他非目標(biāo)物種DNA的PCR實驗也未出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線，說明梅花鹿COX1 396引物和TaqMan探針的特異性良好。

圖2 梅花鹿引物探針實時熒光PCR的特異性檢測結(jié)果Fig.2 Specific detection of primers and TaqMan probe for sika deer DNA

2.3 擴(kuò)增效率與靈敏度測定

圖3 Ct—lg［DNA］標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve showing Ctvalues in relation to the concentration of initial DNA

按1.2.6中方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得Ct值進(jìn)行線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。線性相關(guān)度良好，由斜率s=-3.538 9得到PCR擴(kuò)增效率為91.68%。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得Ct值為35時的梅花鹿DNA質(zhì)量濃度為0.42 pg/μL，則該實時熒光PCR體系的靈敏度為0.42 pg/反應(yīng)。

3 結(jié)語

建立了對食品中梅花鹿源性成分的實時熒光PCR檢測方法。通過分析線粒體基因序列，以種內(nèi)保守、種間特異為基本要求，選取了COX1基因序列作為熒光PCR擴(kuò)增的靶序列，設(shè)計了特異性的引物和探針。對大量非目標(biāo)物種DNA進(jìn)行擴(kuò)增檢測，結(jié)果表明研究所采用的引物與探針僅對梅花鹿DNA特異，降低了其在實際應(yīng)用中出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險。建立的實時熒光PCR體系的靈敏度為0.42 pg/反應(yīng)，能夠?qū)哿康拿坊钩煞诌M(jìn)行檢測，同時有利于對加工制品及其他含梅花鹿成分的物質(zhì)進(jìn)行檢測鑒定。

研究結(jié)果表明，鹿COX1 390特異性引物和TaqMan探針對梅花鹿成分鑒定具有特異性好、靈敏度高的特點，該熒光PCR鑒定方法穩(wěn)定性高、實用性強(qiáng)，可為食品安全檢測、打擊造假等提供技術(shù)支持。通過對市場上梅花鹿肉進(jìn)行分析檢測，與標(biāo)準(zhǔn)方法相比，研究所得方法更快捷、準(zhǔn)確、便利，可作為食品中梅花鹿成分的快速檢測鑒定方法。

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科技信息

衛(wèi)計委批準(zhǔn)聚（12-羥基硬脂酸）硬脂酸酯等23種物質(zhì)用于食品接觸材料及制品

2016年5月31日，國家衛(wèi)生計生委食品安全標(biāo)準(zhǔn)與監(jiān)測評估司發(fā)布2016年第7號、關(guān)于聚（12-羥基硬脂酸）硬脂酸酯等23種食品相關(guān)產(chǎn)品新品種的公告。根據(jù)《食品安全法》規(guī)定，審評機(jī)構(gòu)組織專家對聚（12-羥基硬脂酸）硬脂酸酯等23種食品相關(guān)產(chǎn)品新品種的安全性評估材料審查并通過。

在本次公告中規(guī)定了對這23種物質(zhì)的使用范圍、最大使用量、特定遷移限量（SML）和最大殘留量（QM）等要求，主要有以下要點：

1.批準(zhǔn)聚（12-羥基硬脂酸）硬脂酸酯等12種物質(zhì)用作食品接觸材料及制品用添加劑 ；

2.擴(kuò)大氧化鎂等5種食品接觸材料及制品用添加劑的使用范圍或使用量 ；

3.批準(zhǔn)丙烯腈與1，1-二氯乙烯的聚合物等6種物質(zhì)用作食品接觸材料及制品用樹脂。

此外，需要注意的是，利用5-降冰片烯-2，3-二羧酸酐、間苯二甲酸與氮雜環(huán)十三烷-2-酮和3，3’-二甲基-4，4’-二氨基二環(huán)己基甲烷的聚合物 、聚丙烯酰胺、磷酸-α-十三烷基-ω-羥基-聚（氧-1，2-亞乙基）酯幾種物質(zhì)生產(chǎn)的材料和制品在接觸或盛裝的食品種類方面有嚴(yán)格要求，而利用氧化鎂、丙烯腈與1，1-二氯乙烯的聚合物、2-甲基-2-丙烯酸甲酯與1，1-二氯乙烯的聚合物、2-甲基-2-丙烯酸甲酯與1，1-二氯乙烯和2-甲基-2-丙烯腈的聚合物、2-甲基-2-丙烯酸與苯乙烯的聚合物幾種物質(zhì)生產(chǎn)的材料和制品需控制與食品的接觸溫度和接觸時間。

［信息來源］WTO檢驗檢疫信息網(wǎng).衛(wèi)計委批準(zhǔn)聚 （12-羥基硬脂酸）硬脂酸酯等23種物質(zhì)用于食品接觸材料及制品［EB/OL］.（2016-6-16）.http://www.wtociq.gov.cn/newsinfo

Detection for Sika Deer-Origin Ingredients in Foods by Fluorescent Real-Time PCR Method

QI Chunmeng1，YANG Xinting2，XUE Chenyu2，ZHAO Linna2，HOU Caiyun*1
（1.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；2.Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment，Beijing 100041，China）

A method based on fluorescent real-time polymerase chain reaction was developed to detect sika deer-ingredient in food products.By comparative analysis of sika deer gene sequences，sensitive primers and TaqMan probe were designed on a conserved region of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I sequence，using the Primer Express，Oligo and DNAMAN software. Furthermore，the species specificity and detection sensitivity were tested and validated by using standard samples.Results indicated that primers and TaqMan probe have a high sensitivity for sika deer without non-targeted amplification for other species DNA.Sensitivity of detection was confirmed to be 0.42 pg per reaction with a 91.68%amplification efficiency.Real-time PCR method was applied to detect sika deer meat in the market.Compared with the standard method，this method was more rapid，accurate and convenient，which was suitable for fast authentication of sika deer-origin ingredients.

species identification，sika deer，fluorescent real-time polymerase chain reaction，mitochondrial COX1 gene

R 817.93；TS 207

A

1673—1689（2016）010—1088—05

2015-01-02

北京市科技計劃項目（Z131100005613005）。

*通信作者：侯彩云（1963—），女，北京人，工學(xué)博士，教授，主要從事食品科學(xué)與加工技術(shù)研究。E-mail：cyhou@cau.edu.cn