Src同源酪氨酸磷酸酶（Shp2）在雄性生殖調(diào)控的研究進展

郭凱敏劉凌云綜述 田潤輝審校

1. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院男科（吉林 130021）；2. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院心理科

Src同源酪氨酸磷酸酶（Shp2）在雄性生殖調(diào)控的研究進展

郭凱敏1劉凌云1綜述 田潤輝2審校

1. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院男科（吉林 130021）；2. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院心理科

S r c同源酪氨酸磷酸酶（S r c h o m o l o g y phosphotyrosyl phosphatase2， Shp2）是非受體蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase， PTP）家族成員之一，由蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型11（protein tyrosine phosphatase nonreceptor11，PTPN11）基因編碼并在人類細(xì)胞和組織中廣泛表達，參與細(xì)胞多種生物活動，包括細(xì)胞的增殖、分化、有絲分裂、器官發(fā)育、免疫反應(yīng)以及代謝過程。已有大量研究顯示Shp2參與多種疾病的發(fā)生，如全身系統(tǒng)腫瘤（胰腺癌［1］、肺癌［2］、肝癌［3］、乳腺癌［4］等），在介導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化過程中，Shp2是關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)調(diào)控因子，其作用已被廣泛揭示。而Shp2 在睪丸組織的表達以及調(diào)控精子方面的研究最近才成為熱點。本文就近些年Shp2在雄性生殖的調(diào)控方面做一綜述。

一、Shp2在睪丸細(xì)胞中的表達和定位

Shp2的結(jié)構(gòu)是由兩個SH2（N-SH2和C-SH2）結(jié)構(gòu)域、一個單一的PPT區(qū)以及一個含有磷酸化位點的C端親水尾部結(jié)構(gòu)組成。由于和區(qū)之間的親密互作，它表現(xiàn)為一個低的基礎(chǔ)催化活性，以保持磷酸酶處于一個自動抑制的封閉構(gòu)象。因此，它的催化活性需要通過釋放這些互作而打開，這個反應(yīng)發(fā)生在它的結(jié)構(gòu)域結(jié)合于在上游信號傳導(dǎo)搭檔上發(fā)現(xiàn)的特定磷酸酪氨酸基序［5］。目前普遍認(rèn)為Shp2在發(fā)育方面至關(guān)重要的作用離不開它在不同競爭物的應(yīng)答中促進Ras/MAPK通路激活，而且在許多雄性繁殖過程，包括精子發(fā)生、精子成熟、支持細(xì)胞和精原細(xì)胞粘附、以及血睪屏障的動態(tài)性改變中，Shp2發(fā)揮了正向調(diào)控作用。

Puri等［6］應(yīng)用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)Shp2在睪丸支持細(xì)胞細(xì)胞核和細(xì)胞漿中高表達，而且在位于血睪屏障周圍生精小管基底膜部的支持細(xì)胞表達更為顯著，同時其表達水平在睪丸全部發(fā)育過程中基本保持穩(wěn)定。在睪丸生殖細(xì)胞中，Shp2表達于大部分未成熟的單個A形精原干細(xì)胞（As）和鏈狀A(yù)形精原干細(xì)胞（A aligned）精原細(xì)胞細(xì)胞核、胞漿以及質(zhì)膜。質(zhì)膜的Shp2檢測水平與質(zhì)膜受體磷酸酶的相互作用相關(guān)。而分化的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞不表達Shp2，其調(diào)控精原細(xì)胞分化機制方面目前尚不清楚。

二、Shp2維持精子生成

有研究顯示，Noonan 綜合征和Leopard綜合征都與Shp2的編碼基因PTPN11點突變有關(guān)，而這兩種先天性疾病均表現(xiàn)為男性不育［7，8］。Yoon等［9］發(fā)現(xiàn)Noonan 綜合征PTPN11點突變多達47種。Shp2完全缺失能引起胚胎原腸腔神經(jīng)節(jié)、脊索和脊索后延伸缺陷，造成胚胎發(fā)育停滯［10］。在維持成年小鼠精子生成方面，Puri等［6］通過哺育PTPN11floxed小鼠，將他莫昔芬結(jié)合蛋白結(jié)合域和泛素啟動子融合到Cre重組酶，構(gòu)建了條件性基因敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)敲除29d后小鼠生精小管精原細(xì)胞和精母細(xì)胞缺失，敲除43d后除部分成熟的長型精子細(xì)胞外，其余睪丸各級生精細(xì)胞均缺失。同時，發(fā)現(xiàn)殘存的精子細(xì)胞分布散亂，個別細(xì)胞頂體部位變異。在敲除63d后，生精小管各級生精細(xì)胞均缺失。這提示Shp2 基因敲除可以影響未分化精原細(xì)胞的產(chǎn)生，而并不直接影響分化精原細(xì)胞和成熟精子細(xì)胞的存活。另外，Puri［6］將PTPN11floxed小鼠與 Vasa Cre 小鼠交配 建立了生殖母細(xì)胞特異性Shp2 基因敲除模型（GCPTPN11KO），此時胚胎發(fā)育15d，精原干細(xì)胞（SSC）未形成，3～4周時敲除小鼠生殖細(xì)胞進行性減少，8周后生殖細(xì)胞全部消失，從而認(rèn)為Shp2 對出生后小鼠睪丸精子形成起重要作用。

小鼠出生后5d睪丸中可以存在兩種生殖母細(xì)胞，一種形成SSC ，負(fù)責(zé)后續(xù)精子的產(chǎn)生。另一類的生殖母細(xì)胞可以一次性繞過SSC和未分化精母細(xì)胞階段，這類細(xì)胞直接分化形成A1型精母細(xì)胞，進而分化產(chǎn)生精子，稱為第一階段精子形成［11］。因此，研究發(fā)現(xiàn)GCPTPN11KO 小鼠可以正常形成第一階段精子，這與未分化精母細(xì)胞未檢測到Shp2表達一致［6］。這提示Shp2可能在維持A1分化精原細(xì)胞與和后續(xù)生殖細(xì)胞產(chǎn)生方面作用局限，而其重要作用表現(xiàn)在SSC增殖以及精子持續(xù)生成方面。與之相比，Shp2敲除小鼠出生后5d SSC和未分化精原細(xì)胞增加50%，而出生后7d由于細(xì)胞凋亡造成這些細(xì)胞下降60%?？梢奡hp2對SSC增殖和精子持續(xù)生成至關(guān)重要。已有研究顯示Shp2條件性基因敲除小鼠可以抑制多種類型細(xì)胞（如神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞（HSC）、心臟祖細(xì)胞和T細(xì)胞）增殖［12］。Shp2抑制因子能夠通過SSC增殖啟動子bFGF和GDNF調(diào)控，進而抑制ERK信號激活，在體外抑制SSC增殖。

三、Shp2在SSC自我更新及分化中的作用

已有大量研究證實Shp2 在造血干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞更新分化中的作用［13-15］，而其在SSC的研究較少。SSC的自我更新主要由細(xì)胞因子GDNF、bFGF、集落刺激因子（CSF-1）、以及趨化因子配體（CXCL12）調(diào)控［16］。這些因子在SSC更新盡管沒有詳細(xì)的描述，然而GDFN和bFGF 在富集培養(yǎng)SSC中激活的AKT，介導(dǎo)的ERK磷酸化發(fā)揮作用已被廣泛認(rèn)可［17］。ERK和AKT激活產(chǎn)生的活性氧ROS刺激GFRA1和FGFR受體后可以促進SSCs自我更新和增殖［18］。Shp2參與體細(xì)胞GDNF和bFGF介導(dǎo)的信號通路，以及在體外SSC中Shp2活性是GDFN和bFGF誘導(dǎo)ERK磷酸化的必要條件。目前尚不清楚是否在SSC中Shp2可以通過GDNF和bFGF調(diào)控AKT激活。因此，仍然需要進一步研究證實Shp2是否能夠引起激活不同的AKT或ERK通路從而決定細(xì)胞自我更新或分化。

STAT3是一種促進SSC分化和抑制自我更新的轉(zhuǎn)錄因子，由它調(diào)控的信號旁路可能是Shp2 介導(dǎo)的SSC分化的潛在靶點［19］。Shp2通過STATS3磷酸化將其激活［20，21］， STAT3激活后可以刺激SALL4表達，后者可以隔離ZBTB16基因，從而表達轉(zhuǎn)膜受體c-kit，最終促進精原細(xì)胞分化［22］。STAT3 也可以誘導(dǎo)NGN3轉(zhuǎn)錄因子生成，后者再與E-box轉(zhuǎn)錄因子相互作用，引起促進SSC分化基因的表達［23］。可見，Shp2介導(dǎo)的STAT3和NGN3下調(diào)是阻滯SSC分化的機制之一。SSC中Shp2的下游靶點ETV5和BCL6B也是SSC自我更新的重要轉(zhuǎn)錄因子［24］。而這些因子接受bFGF 和 GDNF通過PTPN11依賴的MAPK通路正向調(diào)控［25］（如圖1）。

圖1　Shp2激活SSC增殖、自我更新、分化的細(xì)胞通路

研究顯示，敲除生殖細(xì)胞Shp2基因能夠通過抑制SSC增殖而誘導(dǎo)生精阻滯，而敲除支持細(xì)胞Shp2基因可以干擾旁分泌因子的表達，促進SSC過度分化［27］。后者基因敲除引起SSC來源的未分化精母細(xì)胞從出生后第二周開始迅速減少，以及分化成熟的精母細(xì)胞過早出現(xiàn)，同時Shp2可以很大程度上修復(fù)支持細(xì)胞細(xì)胞連接以及SSC克隆形成。早幼粒細(xì)胞白血病鋅指蛋白（PLZF）是SSC和未分化精母細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，基因敲除小鼠以及Shp2loxp/loxp小鼠中，PLZF陽性的細(xì)胞數(shù)只在出生后一周內(nèi)數(shù)量保持相同，隨著小鼠增齡數(shù)量急劇下降，支持細(xì)胞Shp2基因敲除引起SSC維持受損。此外，盡管目前尚不能明確促進SSC自我更新基因表達的改變是否與Shp2基因敲除有關(guān)，但是Shp2缺陷的支持細(xì)胞中編碼分化促進因子基因上調(diào)。這些研究提示支持細(xì)胞Shp2基因缺失破壞SSC維持自我更新和分化間的平衡，通過誘導(dǎo)SSC分化而阻止生殖細(xì)胞的補充儲備［27］?？梢?，支持細(xì)胞正常表達的Shp2是保持SSC自我更新和分化之間相互平衡的必要條件，也是維持精子持續(xù)生成和生育力的重要因素。

四、Shp2調(diào)控血睪屏障的完整性和SSC的附著

血睪屏障（BTB）是睪丸中毛細(xì)血管和支持細(xì)胞之間的緊密連接形成，將生精小管分為基底部和頂部，它為精原細(xì)胞提供營養(yǎng)。血睪屏障破壞可以造成睪丸生精細(xì)胞脫落以及分化、發(fā)育阻滯［28］。血睪屏障周期性結(jié)構(gòu)更新可以促進精原細(xì)胞從生精小管基底部向管腔部轉(zhuǎn)運，其中激酶介導(dǎo)的信號級聯(lián)反應(yīng)在血睪屏障維持和重塑中起關(guān)鍵作用。Puri等［6］研究發(fā)現(xiàn)組成性激活Shp2突變體SHP2Q79R的表達可以減小支持細(xì)胞跨膜電阻，從而破壞體外支持細(xì)胞之間的黏附。在生精周期一些特定階段，支持細(xì)胞和生精細(xì)胞會分泌一系列細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)BTB的開閉以及精子的形成［29］。肝細(xì)胞生長因子（HGF）是個調(diào)節(jié)血睪屏障重要的生長因子，它可以刺激體外支持細(xì)胞增加SRC和ERK活性，減低細(xì)胞跨膜電阻，是Shp2的上游調(diào)控因子。Shp2可同HGF 受體（c-Met）銜接蛋白（Gab1）相互作用從而負(fù)調(diào)節(jié)MAPK通路激活［30］。

體外大鼠睪丸支持細(xì)胞的研究表明，組成性激活Shp2通過降低樁蛋白的磷酸化，引起負(fù)調(diào)節(jié)因子SRC與CSK解離，從而激活ERK，導(dǎo)致表達SHP2Q79R的支持細(xì)胞間粘附調(diào)節(jié)因子FAK 失活，穩(wěn)定細(xì)胞間黏附的細(xì)胞骨架破壞［31］。最終，組成性激活的Shp2改變引起緊密連接蛋白ZO-1，銜接蛋白β-catenin和轉(zhuǎn)膜蛋白N-cadherin從質(zhì)膜細(xì)胞粘附部位與支持細(xì)胞胞漿發(fā)生定位改變。這些表明Shp2對于維持SSC之間和SSC和支持細(xì)胞間黏附有重要意義。

五、Shp2調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞睪酮生成

睪酮是重要的雄性激素和合成代謝類固醇，在雄性中主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。促卵泡激素刺激間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生cAMP增加，激活蛋白激酶A，通過上調(diào)轉(zhuǎn)運體急性調(diào)節(jié)蛋白（STAR）促進膽固醇轉(zhuǎn)運至線粒體，從而刺激激素合成通路合成類固醇。?；o酶A合成酶（ACSL4）和?；o酶A硫解酶（ACOT2）可以調(diào)控花生四烯脂氧化和環(huán)氧化代謝產(chǎn)物產(chǎn)生，進而增強STAR表達［32］。最近研究發(fā)現(xiàn)［33］Shp2是間質(zhì)細(xì)胞ACSL4 表達的重要調(diào)控因子，用Shp2的抑制劑NSC87877可以在體外抑制間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生睪酮。此外，shRNA調(diào)控的Shp2基因敲除引起的睪酮含量減少與ACSL4 和STAR蛋白含量減低相關(guān)。而Shp2過表達可以提高ACSL4和STAR蛋白以及睪酮的含量。Shp2能夠通過胞漿MAPK和PI4K-Akt通路調(diào)控FSH以及睪酮的產(chǎn)生。此外，Shp2基因敲除能夠抑制線粒體融合這一重要的睪酮產(chǎn)生過程［34］。

國內(nèi)學(xué)者蔡曉黎等發(fā)現(xiàn)，出生后小鼠Shp2連續(xù)性表達以及在特定發(fā)育階段表達量的明顯波動，預(yù)示Shp2參與小鼠出生后睪丸發(fā)育的全過程，此外檢測小鼠血清中睪酮水平，發(fā)現(xiàn)Shp2在全部睪丸發(fā)育過程中的表達模式與小鼠血液中睪酮水平趨勢變化基本吻合［35］?？梢?，Shp2對睪丸發(fā)育和睪酮生成持續(xù)發(fā)生作用。

綜上所述，Shp2在精子生成、精原細(xì)胞自身更新分化以及雄激素的生成方面起重要作用。目前Shp2研究還停留在動物水平，在男性不育人群中的未見報道，對其深入研究有利于揭示男性不育癥的發(fā)病機理，同時也可能為不育的治療提供理論依據(jù)，Shp2抑制劑可能代替?zhèn)鹘y(tǒng)的手術(shù)結(jié)扎成為控制雄性生育的方法之一?？傊?，Shp2 能否應(yīng)用于實踐仍需要大量研究。

致謝：本文受吉林省財政廳科研專項資助（項目卡編號3D5157343428）基金項目資助

含SH2域蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶類； 精子發(fā)生； 雄激素類

1 Zheng J， Huang S， Huang Y， et al. Tumour Biol 2016；37（6）： 7853-7859

2 Chen CL， Chiang TH， Tseng PC， et al. Biochem Biophys Res Commun 2015； 466（3）：578-584

3 Han T， Xiang DM， Sun W， et al. J Hepatol 2015； 63（3）：651-660

4 Li J， Kang Y， Wei L， et al. PLoS One 2014； 9（7）： e102847

5 Bertotti A， Comoglio PM， Trusolino L. J Cell Biol 2006；175（6）： 993-1003

6 Puri P， Phillips BT， Suzuki H， et al. Stem Cells 2014；32（3）： 741-753

7 Tajan M， de Rocca Serra A， Valet P， et al. Eur J Med Genet 2015； 58（10）： 509-525

8 Grossmann KS， Rosario M， Birchmeier C， et al. Adv Cancer Res 2010； 106： 53-89

9 Yoon SR， Choi SK， Eboreime J， et al. Am J Hum Genet 2013； 92（6）： 917-926

10 Saxton TM， Henkemeyer M， Gasca S， et al. EMBO J 1997； 16（9）： 2352-2364

11 Yoshida S， Sukeno M， Nakagawa T， et al. Development 2006； 133（8）： 1495-1505

12 Langdon YG， Goetz SC， Berg AE. Development 2007；134（22）： 4119-4130

13 Chan G， Cheung LS， Yang W， et al. Blood 2011； 117（16）：4253-4261

14 Zhu HH， Ji K， Alderson N， et al. Blood 2011； 117（20）：5350-5361

15 Ke Y， Zhang EE， Hagihara K， et al. Mol Cell Biol 2007；27（19）： 6706-6717

16 Chen SR， Liu YX. Reproduction 2015； 149（4）：R159-R167

17 Ishii K， Kanatsu-Shinohara M， Toyokuni S， et al. Development 2012； 139（10）： 1734-1743

18 Morimoto H， Iwata K， Ogonuki N， et al. Cell Stem Cell 2013； 12（6）： 774-786

19 Oatley JM， Kaucher AV， Avarbock MR， et al. Biol Reprod 2010； 83（3）： 427-433

20 Yang Y， Jiang B， Huo Y， et al. Virology 2011； 409（2）：204-210

21 Kim DJ， Tremblay ML， Digiovanni J. PLoS One 2010；5（4）： e10290

22 Hobbs RM， Fagoonee S， Papa A， et al. Cell Stem Cell 2012； 10（3）： 284-298

23 Kaucher AV， Oatley MJ， Oatley JM. Biol Reprod 2012；86（5）： 164， 1-11

24 Catizone A， Ricci G， Caruso M， et al. Mol Cell Endocrinol 2012； 348（1）： 135-146

25 Tyagi G， Carnes K， Morrow C， et al. Biol Reprod 2009；81（2）： 258-266

26 Puri P， Walker WH. Semin Cell Dev Biol 2016； pii：S1084-9521（16）30020-30029

27 Hu X， Tang Z， Li Y， et al. Sci Rep 2015； 5： 12982

28 Wong CH， Cheng CY. Curr Top Dev Biol 2005； 71： 263-296

29 秦茂， 張秀平， 劉保興. 中國男科學(xué)雜志 2014； （10）： 65-67

30 Schaeper U， Gehring NH， Fuchs KP， et al. J Cell Biol 2000； 149（7）： 1419-1432

31 Puri P， Walker WH. Biol Reprod 2013； 88（3）： 59

32 Duarte A， Castillo AF， Castilla R， et al. FEBS Lett 2007；581（21）： 4023-4028

33 Cooke M， Orlando U， Maloberti P， et al. J Lipid Res 2011；52（11）：1936-1948

34 Duarte A， Poderoso C， Cooke M， et al. PLoS One 2012；7（9）： e45829

35 蔡曉黎， 耿果霞， 劉亞偉， 等. 中國畜牧獸醫(yī) 2013；40（11）： 143-147

（2016-05-05收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.07.016

R 698.2