博落回中綠霉病抑菌物質(zhì)的提取工藝及抑菌穩(wěn)定性研究

丁仁惠，何小娥，王文龍，石浩，2，*

（1.湖南應用技術(shù)學院農(nóng)林科技學院，湖南常德415100；2.湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，湖南長沙410128）

柑橘是我國南方重要的水果之一，具有豐富的營養(yǎng)價值，含有大量的VC、有機酸、礦物質(zhì)、黃酮類、檸檬苦素等物質(zhì)[1-2]。但柑桔果實在貯藏期間因爛果造成的損失每年在15%～30%，嚴重時可達以40%上，大量鮮桔因無法及時處理而霉爛，造成巨大的經(jīng)濟損失。柑橘侵染性病害以真菌性病害侵染最為嚴重，常見的真菌為綠霉屬（Penicilium digitatum）、青霉屬（Penicilium italicum）、炭疽桿菌（Colletotrichum gloeosporiorides Penz）等[3-4]，近年來研究發(fā)現(xiàn)，我國柑橘采后腐爛約80%是由綠霉（指狀青霉，P.digitatum）引起[5]。柑橘鮮果腐敗嚴重，藏期太短，貨架期不長，這些問題不僅造成了巨大的經(jīng)濟損失，還威脅到了消費者的健康，因此必須找到高效安全的解決辦法。通過采后對柑橘進行及時的藥劑處理可以較大程度地延長保鮮期限，是保證柑橘大規(guī)模貯藏能夠成功的最主要前提之一[6]。由于植物源殺菌劑有著高效低毒，低殘留，對環(huán)境影響小，不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，因此，開發(fā)植物源殺菌劑不僅可以有效地控制植物病害，而且能緩解大量化學合成農(nóng)藥帶來的環(huán)境壓力[7-9]。博落回（Macleaya cordata（Willd.）R.Br.）是粟科，博落回屬多年生直立草本植物，在我國南方地區(qū)分布及種植較為廣泛[10]。博落回中主要次生代謝物質(zhì)有生物堿類、酚類、酯類、醌類、酮類、皂素類、揮發(fā)油類等，博落回具有殺菌、散瘀、祛風、解毒、止痛、殺蟲的功效[11-12]。關(guān)于博落回在柑橘采后病害抑菌方面已有相關(guān)的研究，但抑菌提取物多為溶劑粗提物，抑菌效果不是很好，且容易造成植物及提取溶劑的大量浪費，總體抑菌效率低[13-14]。試驗以博落回提取物對指狀青霉抑菌效果為指標，探討博落回提取物的最佳提取工藝，同時對提取物進行抑菌穩(wěn)定性研究，以期得到提取物的最佳抑菌效果，提高抑菌效率，進而為博落回抑菌提取物的工業(yè)化生產(chǎn)及柑橘的大規(guī)模高效商業(yè)化綠色保藏提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

指狀青霉：實驗室（國家柑橘中心長沙分中心）自行分離鑒定所得；博落回：國家中藥材生產(chǎn)（湖南）技術(shù)中心；葡萄糖、瓊脂粉、吐溫、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉，氯化鎂、石油醚、氯化銅、氯化鐵、氯化鈉、硝酸銀（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；有機試劑均為分析純。

THZ-92B 可調(diào)速控溫搖床：上海浦東物理儀器廠；SB-3200D 超聲波儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；DR-1001 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；ZW1105051705 紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；G16 臺式高速離心機：長沙英泰儀器有限責任公司；滅菌鍋HVA-85 全自動高壓蒸汽滅菌鍋：天津永大化學試劑有限公司；PHS-25 酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；DHG-9246A 電熱恒溫干燥箱：上海精宏試驗設(shè)備有限公司；DSZ2000X 倒置生物顯微鏡：北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司；DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物提取液的制備

精確稱取博落回植物樣品粉末50 g 于1 L 潔凈燒杯中，加入1 L 提取溶劑，將燒杯放入超聲儀中，在60 ℃溫度下經(jīng)500 W 超聲波提取2.0 h，然后將提取液進行抽濾，濾液經(jīng)濃縮至浸膏狀，丙酮溶解，倒入50 mL 容量瓶中定容。配成活性物質(zhì)提取物，質(zhì)量濃度1.0 g/mL，以上重復3 次，對提取物母液進行編號，置于4 ℃冰箱中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液的制備

指狀青霉菌種經(jīng)活化后接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA）試管斜面培養(yǎng)，28 ℃避光培養(yǎng)3 d，用加有吐溫的無菌生理鹽水約4 mL 沖洗，攪拌打散、離心、放入離心管過濾菌絲。采用比濁法測定菌懸液濃度，菌液濃度控制在106cfu/mL～107cfu/mL 之間，4 ℃貯藏備用。

1.2.3 提取液抑菌活性的測定

先倒入約12 mL 底層培養(yǎng)基，待其凝固后，將35 ℃左右已融化的培養(yǎng)基9 mL 與1 mL 菌懸液混合、充分搖勻，控制菌液濃度在105cfu/mL～106cfu/mL 之間，并倒于平板內(nèi)。待上層培養(yǎng)基快凝固時，取經(jīng)滅菌的牛津杯置于上層培養(yǎng)基內(nèi)，每個培養(yǎng)皿放置4 個牛津杯，各杯中加入100 μL 博落回提取液（經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾除菌），將培養(yǎng)皿用封口膜封口后放置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，每個處理做3 個重復，培養(yǎng)72 h 后用游標卡尺測量抑菌圈直徑（十字交叉法）。

1.2.4 抑菌活性物質(zhì)的單因素提取工藝

以菌體抑制直徑作為參考指標。改變其中的某一個單因素條件，其它條件同1.2.1，每次單因素取1 g 植物粉末樣品進行超聲提取，評價各因素條件下的提取物對指狀青霉抑制效果的影響。單因素試驗因素水平見表1。

表1 單因素試驗因素水平Table 1 Single factor experimental factors and levels

1.2.5 響應曲面試驗設(shè)計

其采用更為合理的試驗設(shè)計，能夠快速有效的確定多因素水平的最優(yōu)試驗條件[15]。在單因素試驗的基礎(chǔ)上分別選擇料液比（g/mL）、提取溫度（℃）、提取時間（h）、超聲功率（W）4 個主要因素分別選擇3 個水平，以菌抑制直徑（Y）為考察指標，進行進行Box-Behnken試驗設(shè)計，優(yōu)化博落回中抑菌物質(zhì)提取工藝的條件。

因素水平表見表2。

表2 Box-Behnken響應曲面設(shè)計試驗因素水平和編碼Table 2 Response surface experimental design of Box-Behnken of factor levels and code

1.2.6 提取液抑菌性質(zhì)的測定

1.2.6.1 光及紫外光照射對提取液抑菌活性的影響

將1.2.1 中提取物取0.5 mL 6 份，分別置于6 支透明的玻璃試管中編號，分別在15 W、相距40 cm 的日光燈以及紫外燈下照射5、7、12、24、36、48 h。參照上述方法，每個牛津杯中放入100 μL 提取物溶液，置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每組測定3 次平行。用游標卡尺量取抑菌圈上下、左右的直徑，取平均值確定抑菌效果。

1.2.6.2 溫度對提取液抑菌活性的影響

將提取物分成6 份，分別放在玻璃試管中編號，同時分別放置于-20、4、20 ℃條件下處理3 d，70、80、100 ℃水浴條件下處理8 h，用杯碟法測定抑菌效果，平行測定3 次。

1.2.6.3 pH 值對提取液抑菌活性的影響

將提取物分成6 份，用氧氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH值，分別配置3、4、6、7、8、12 的抑菌液。平衡24 h 后，用杯碟法測定抑菌效果，平行測定3 次。

1.2.6.4 提取液貯藏性能的影響

提取物分別在4 ℃和20 ℃下保存，每隔20 d 測定一次抑菌活性，供測6 次，以指狀青霉作為指示菌測定抑菌效果。用杯碟法測定抑菌效果，平行測定3 次。以了解博落回提取液在不同溫度下的貯藏性能。

1.2.6.5 金屬離子對提取物抑菌活性的影響

將提取物水溶液分成6 份，在提取液中分別加入其最終濃度為10、50、100、150、180、200 mmol/L 的氯化鈉、氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和硝酸銀。用杯碟法測定各溶液對菌的抑菌效果，平行測定3 次。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析及圖形制作

采用WPS 軟件進行數(shù)據(jù)處理及圖形的制作。采用SPSS18.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素提取工藝

2.1.1 提取溶劑對提取液抑菌活性的影響

不同提取溶劑對抑菌活性的影響見圖1。

圖1 不同提取溶劑對抑菌活性的影響Fig.1 Effect of different extraction solvents on antibacterial activity

博落回不同溶劑提取物的抑菌效果具有較大的差別，如圖1可知，水提物、氯仿提取物、石油醚提取物的抑菌圈直徑都較小，均低于15 mm，其中石油醚提取物組抑菌圈直徑僅為9.63 mm；而乙醇、丙酮、乙酸乙酯提取物的抑菌圈直徑均都比較大，均在20 mm 以上，尤其是乙醇提取物組的抑菌圈直徑達到了24.46 mm。其中不難看出，極性過大的水和極性較小的氯仿、石油醚提取物抑菌能力較小，可能是因為3 種提取物本身抑菌能力很弱，或者是有效物的提取量較少所致[16]；另外3 組提取物抑菌效果較好，尤其是乙醇提取物組，同時乙醇無毒、便于回收，因此選擇乙醇作為博落回抑菌物質(zhì)的提取溶劑。

2.1.2 溶劑濃度對提取液抑菌活性的影響

不同溶劑濃度對抑菌活性的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對抑菌活性的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on antimicrobial activity

博落回不同乙醇濃度提取物的抑菌效果具有較大的差別，由圖2可知，在乙醇濃度為20%時，抑菌圈直徑僅為15.22 mm，隨著提取液乙醇濃度的增加，抑菌圈直徑呈現(xiàn)增大趨勢，乙醇濃度為80%時，抑菌圈直徑達到了24.19 mm（P＜0.05），說明較高濃度乙醇作為提取溶劑時，提取物具有較強的抑菌活性，可能此時抑菌有效物質(zhì)和80%乙醇極性相似[17]；當乙醇濃度超過80%以后，抑菌效果趨于平緩，出于節(jié)約試驗成本的考慮，選擇80%的乙醇作為抑菌物質(zhì)的提取溶劑，抑菌效果較佳。

2.1.3 溶劑倍數(shù)對提取液抑菌活性的影響

不同料液比對博落回提取物抑菌效果的影響見圖3。

圖3 溶劑倍數(shù)對抑菌活性的影響Fig.3 Effect of solvent multiple on antimicrobial activity

如圖3所示，采用80%的乙醇作為提取溶劑，隨著提取溶劑倍數(shù)的增加，提取物抑菌效果有所增強，當提取料液比為1∶15（g/mL）時，抑菌圈直徑僅為16.17 mm，說明有效物的提取量較低，當提取物料液比為1∶30（g/mL），抑菌圈直徑增加了40.30%，但隨著溶劑倍數(shù)的繼續(xù)增加，抑菌效果增加不明顯，不具有顯著性差異（P＞0.05），可能此時抑菌有效物基本上以完全溶出，因此選擇30 倍的提取溶劑較為合適。

2.1.4 提取溫度對提取液抑菌活性旳影響

不同提取溫度對抑菌活性的影響見圖4。

圖4 提取溫度對抑菌活性的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on antimicrobial activity

不同溫度下博落回提物的抑菌效果同樣具有一定的差異，如圖4可知，提取溫度為20 ℃時，提取物的溶出量較低，抑菌效果較差，此時抑菌圈直徑僅為14.03 mm，隨著提取溫度的增加，抑菌物質(zhì)的溶出量逐漸增加，抑菌圈直徑逐漸增大，抑菌效果增強。當提取溫度達到70 ℃時，抑菌效果效果得到了顯著的提高（P＜0.05），相對于20 ℃時，抑菌圈直徑提高了67.07%。但當提取溫度達到100 ℃時，提取物抑菌直徑有所減小，可能是因為過高的提取溫度不利于提取物的抑菌活性[18]。

2.1.5 提取時間對提取液抑菌活性的影響

不同提取時間對博落回提取物抑菌效果的影響見圖5。

由圖5可知，隨著提取時間的增加，提取物溶出量逐漸增加，抑菌活性逐漸增強，提取時間為1h 時，抑菌圈直徑為17.57 mm，說明超聲提取效率較高，當提取時間達到2.5 h 時，抑菌圈直徑達到了22.70 mm，隨后隨著提取時間的繼續(xù)增加，抑菌圈直徑大小改變較?。≒＞0.05），說明超聲提取2.5 h 時，抑菌有效物的溶出量以接近最大值[19]，因此可選取2.5 h 左右作為較適宜的超聲提取時間。

2.1.6 超聲功率對提取液抑菌活性的影響

不同超聲提取功率對博落回提取物抑菌效果的影響見圖6。

圖5 提取時間對抑菌活性的影響Fig.5 Effect of extraction time on antimicrobial activity

圖6 超聲功率對抑菌活性的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on antimicrobial activity

由圖6可知，超聲功率在300 W 時，提取物溶出量較低，抑菌圈直徑為15.89 mm，當超聲功率達到700 W時，抑菌有效物質(zhì)溶出量得到較大的提高（P＜0.05），此時抑菌圈直徑相對于300 W 超聲時提高了45.56%，說明較大的提取功率可使植物有效成分的快速溶出[20]，增大提取物的抑菌效果，隨著超聲功率的繼續(xù)加強，提取物抑菌效果有略微的提高，但不明顯，因此選取700 W 左右的超聲功率較為合適。

2.2 響應面工藝回歸模型的建立及方差分析

在原有單因素試驗的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計進行了29 組試驗，其中5 組中心點重復試驗，試驗結(jié)果見表3，回歸模型的方差分析見表4。

由軟件design expert 8.0 對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得到試驗條件與抑菌圈直徑之間的二次多項式方程為：Y=28.18+0.65A+3.74B+0.90C+1.58D+1.50AB+0.05AC-0.60AD+0.05BC+0.22BD+3.80CD-0.74A2-1.87B2-0.39C2-3.67D2。從F 值可知單因素的影響順序為B＞D＞C＞A，即提取溫度＞超聲功率＞超聲時間＞料液比。方差分析結(jié)果顯示，AC、BC、BD顯著，CD極顯著，這表明他們之間對菌抑制具有明顯的交叉作用，B2顯著（P＜0.05），D2極顯著（P＜0.01）。其中模型決定系數(shù)R2值為0.962，說明該模型能夠解釋96.2%響應值的變化。

表3 響應曲面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and result of response surface test

表4 試驗結(jié)果回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model of experimental results

續(xù)表4 試驗結(jié)果回歸模型的方差分析Continue table 4 Variance analysis of regression model of experimental results

圖7 液料比、提取溫度、超聲時間和超聲功率對菌抑制影響的響應面圖Fig.7 The corresponding surface of liquid-solid ratio，extraction temperature，ultrasonic time and ultrasonic power to Inhibitory bacteria

2.1.3 驗證試驗

由軟件計算得到提取物的最佳工藝條件為：提取溫度72.50 ℃、超聲時間2.50 h、超聲功率850 W、料液比1∶27.50（g/mL），此條件下（其它條件同1.2.1）菌抑制直徑的理論值為29.98 mm。實際測得試驗結(jié)菌抑制直徑為30.02 mm（SD=0.04），與理論預測值相比，其相對誤差僅為0.04，而且重復性也很好，說明該模型可以較好地預測抑菌圈直徑大小與各試驗條件之間的關(guān)系，具有一定的實用價值。

2.2 抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性研究

2.2.1 光照對提取液抑菌活性的影響

提取物分別采用紫外光和日照光處理不同的時間后抑菌效果如圖8所示。

圖8 光照時間對提取物活性的影響Fig.8 Effect of light time on the activity of extracts

由圖8可知，日照光照處理36 h 內(nèi)抑菌活性幾乎沒有變化，處理48 h 后抑菌活性有略微的降低；提取物在紫外光處理24 h 后，抑菌活性開始略微的降低，在處理48 h，抑菌活性減小較為明顯（P＜0.05）。說明兩種光對提取物的抑菌穩(wěn)定性均具有一定的影響，且紫外光影響效果更強，可能是因為紫外光可破壞有效物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而影響其活性[21]。因此，當提取物需要長時間用于抑菌試驗時最好進行避光保藏。

2.3.2 溫度對提取液抑菌活性的影響

提取物不同溫度處理后抑菌效果如圖9所示。

圖9 溫度對提取物活性的影響Fig.9 Effect of temperature on the activity of extracts

由圖9可知，在20 ℃內(nèi)處理3 d 以及在80 ℃內(nèi)處理8 h 時抑菌圈直徑幾乎沒有減?。≒＞0.05），抑菌圈直徑均在24 mm 以上，當采用100 ℃處理8 h 后，提取物的抑菌能力明顯的減弱，說明高溫可以影響提取物的活性，這可能是因為高溫破壞了提取物的結(jié)構(gòu)所致[22]，因此在對博落回進行抑菌有效物質(zhì)提取時，提取溫度盡量不能太高，且最好得低于100 ℃。

2.3.3 pH 值對提取液抑菌活性的影響

提取物進行不同條件下的pH 值處理后抑菌效果如圖10所示。

圖10 pH值對提取物活性的影響Fig.10 Effect of pH value on the activity of extracts

由圖10可知，當提取物pH 值處于中性或弱堿性的條件下抑菌活性最強，在弱酸性（pH 4～7）條件下抑菌活性有略微的減少（P＞0.05），當pH 值為4 時，只減少了7.55%。在堿性條件下，提取物抑菌活性的減小較為明顯（P＜0.05），當pH 值為12 時，減少了26.84%，可能是較強堿性環(huán)境破壞抑菌物質(zhì)結(jié)構(gòu)所致[23]。因此，在進行抑菌試驗時，抑菌處理環(huán)境的pH 值最好處于中性或弱減性條件下進行。

2.3.4 提取液貯藏時間對其抑菌活性的影響

提取物分別在4、20 ℃條件下處理20 d～120 d，其抑菌效果如圖11所示。

圖11 貯藏時間對提取物活性的影響Fig.11 Effect of storage time on the activity of extracts

由圖11可知，提取物在4 ℃貯藏80 d 內(nèi)抑菌活性幾乎沒有減小，處理100 d 后開始略微的減小，處理120 d 后有一定的減?。≒＜0.05）。提取物在20 ℃貯藏80 d 時抑菌活性開始緩慢減小，在貯藏100 d 以后提取物的抑菌活性降低明顯，且具有顯著性差異（P＜0.05），在貯藏120 d 后，抑菌圈直徑減小了19.01%。因此，提取物在4 ℃條件下貯藏最好不要超過100 d，20 ℃條件下貯藏最好不要超過80 d。

2.3.5 陽離子對提取液抑菌活性的影響

提取物不同金屬離子處理后抑菌效果如圖12所示。

圖12 金屬離子對提取物活性的影響Fig.12 Effect of metal ion on the activity of extracts

由圖12可知，隨著金屬離子濃度的增加，提取物抑菌活性均有一定量的減少，但不同離子間差別較大。Na+、Mg2+在200 mmol/L 范圍內(nèi)對提取物抑菌影響效果不大（P＞0.05），Cu2+、Fe3+對提取物的影響相對較大，在濃度為150 mmol/L 時抑菌活性便有一定量的減少，Ag+相對于前4 種離子抑菌活性減小量最為明顯，濃度為100 mmol/L 時抑菌活性便有一定量的減少，200 mmol/L 時抑菌圈直徑相對于10 mmol/L 時減小了20.24%。可能是重金屬鹽具有過大的氧化性，或者易與提取物結(jié)合成絡合物，從而降低活性[24]?？芍顫娊饘冫}影響抑菌活性較小，重金屬鹽影響較大，盡量避免重金屬污染。

3 結(jié)論

試驗以柑橘綠霉病原菌（指狀青霉菌）抑菌圈為指標，對博落回抑菌物質(zhì)提取工藝及提取物抑菌穩(wěn)定性研究。得到單因素的影響順序為提取溫度＞超聲功率＞超聲時間＞料液比，最佳提取工藝條件為提取溫度72.50 ℃、超聲時間2.50 h、超聲功率850 W、料液比1∶27.5（g/mL），此條件下菌抑制直徑的理論值為29.98 mm。實際測得試驗結(jié)菌抑制直徑為30.02 mm（SD=0.04），與理論預測值相比，其相對誤差僅為0.04%，且重復性也很好。當提取物需要長時間用于抑菌試驗時最好進行避光保藏，提取物提取溫度盡量不能太高，且最好得低于100 ℃，提取物抑菌處理環(huán)境的pH值最好處于中性或弱減性條件下進行，提取物在4 ℃條件下貯藏最好不要超過100 d，20 ℃條件下貯藏最好不要超過80 d，活潑金屬鹽影響提取物抑菌活性較小，重金屬鹽影響較大，提取物盡量避免重金屬鹽污染。博落回提取物作為一種柑橘果實的新型植物源保鮮劑，具有高效、綠色、環(huán)保貯藏的特點、具有一定實際生產(chǎn)意義。試驗中博落回提取物屬于80%乙醇提取的一種粗提物，純度不是很高，不能確定其主要物質(zhì)結(jié)構(gòu)，在后期的研究過程中，可有待對提取物進一步純化，確定結(jié)構(gòu)，探討其抑菌機理。