小花棘豆對(duì)羊血漿中抗氧化指標(biāo)的影響

何 雯，王選東，陶大勇

（塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300）

研究簡(jiǎn)報(bào)

小花棘豆對(duì)羊血漿中抗氧化指標(biāo)的影響

何 雯，王選東，陶大勇

（塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300）

為了探討小花棘豆中苦馬豆素的中毒機(jī)理及其對(duì)羊體內(nèi)氧自由基代謝的影響，將12只卡拉庫(kù)爾羊隨機(jī)分為2組，即對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。采用紫外可見(jiàn)分光光度法分別測(cè)定了對(duì)照組和攻毒組羊血漿中超氧化物歧化酶（SOD）的活性、還原型谷胱甘肽（GSH）的活性、脂質(zhì)過(guò)氧化終末代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA）的含量、總巰基（TSH）、非蛋白巰基（NPSH）的含量及一氧化氮（NO）。結(jié)果表明：攻毒組羊血漿中SOD活性和GSH、TSH、NPSH含量在攻毒21 d之后均顯著或極顯著低于對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01），MDA含量和NO含量在攻毒21 d之后均極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。表明苦馬豆素能誘發(fā)機(jī)體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生，顯著降低機(jī)體主要器官和組織中某些抗氧化酶的活性，提高M(jìn)DA的含量；發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)而損傷機(jī)體主要組織器官，細(xì)胞發(fā)生空泡變性，可能是苦馬豆素引起中毒的原因之一。

小花棘豆；羊；抗氧化指標(biāo)

小花棘豆為豆科棘豆屬的多年生草本植物，主要成分為苦馬豆素（swainsonine，SW）。國(guó)內(nèi)外大量研究資料證實(shí)，SW能抑制溶酶體α-甘露糖苷酶、高爾基體α-甘露糖苷酶和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及胞質(zhì)α-甘露糖苷酶的活性，使細(xì)胞內(nèi)蛋白的N-糖基化合成、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)以及富含甘露糖的寡聚糖代謝等過(guò)程發(fā)生障礙，導(dǎo)致細(xì)胞表面膜黏附分子、細(xì)胞膜受體正常功能變化，出現(xiàn)生殖、內(nèi)分泌及免疫功能異常及細(xì)胞廣泛空泡變性，使家畜中樞神經(jīng)系統(tǒng)和實(shí)質(zhì)器官受到損害，造成細(xì)胞功能紊亂，尤其是神經(jīng)細(xì)胞功能紊亂，而使家畜表現(xiàn)出一系列神經(jīng)癥狀［1-2］。

小花棘豆中毒的主要組織病理學(xué)特征是腦、脊髓、各內(nèi)臟器官以及外周血液淋巴細(xì)胞的胞漿空泡變性，與氧自由基（oxygeli free radical，OFR）引起的空泡變性相似，可能是由于脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)而引起。因此，本研究通過(guò)對(duì)羊進(jìn)行小花棘豆攻毒，測(cè)定不同時(shí)期血漿中抗氧化指標(biāo)變化，進(jìn)而分析驗(yàn)證小花棘豆對(duì)羊的毒性作用，進(jìn)一步完善小花棘豆的中毒機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 材料

小花棘豆2013年7月采集于新疆策勒縣恰哈鄉(xiāng)，由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)學(xué)科組鑒定。取植株地上部分，陰干、保存?zhèn)溆?。新疆卡拉?kù)爾羊12只。

1.2 試劑與儀器

試劑：SOD測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所），GSH測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所），MDA測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所），GSH標(biāo)準(zhǔn)品，2-硝基苯甲酸（DTNB），乙二胺四乙酸二鈉，Tris緩沖液，磺基水楊酸，TCA溶液，甲醇，對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)液：用0.1mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH值10.14）將分析純的對(duì)硝基酚配成2mmol/L的母液，然后稀釋成濃度分別為100，200，300……1 500μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)硝基酚溶液以制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)-硝基苯基-α-D-甘露糖吡喃糖苷（Sigma公司），醋酸鹽緩沖液，0.1mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH值10.14）。

儀器：美的2110電磁爐，Analyst800型原子吸收分光光度計(jì)（Perkin Elmer公司），自動(dòng)超純水系統(tǒng)（美國(guó)密理博），F(xiàn)A1004N電光分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），恒溫水浴鍋，酶標(biāo)儀（美國(guó)伯樂(lè)公司），等等。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的初步處理 對(duì)12只實(shí)驗(yàn)羊用驅(qū)蟲凈進(jìn)行前期驅(qū)蟲處理，隨機(jī)分為2組，每組6只。對(duì)照組羊飼喂青干草和少量精料，實(shí)驗(yàn)組羊每天按照10 g/kg體重的劑量飼喂小花棘豆干粉，待采食完畢后，再添加青干草和精料（飼養(yǎng)量同對(duì)照組）。自由飲水。在實(shí)驗(yàn)開始和實(shí)驗(yàn)終止時(shí)稱重，每天飼喂時(shí)進(jìn)行臨床癥狀觀察。

1.3.2 樣品采集和處理 實(shí)驗(yàn)開始和實(shí)驗(yàn)終止時(shí)于卡拉庫(kù)爾羊頸靜脈采血5 mL，裝于肝素鈉抗凝管中，做好標(biāo)記，3 000 r/min離心20 min，分離血漿，4℃冷藏保存，備用。

1.3.3 SOD活性測(cè)定 采用紫外分光光度法測(cè)定。

1.3.4 GSH活性測(cè)定 采用DTNB直接法測(cè)定。

1.3.5 MDA含量測(cè)定 采用硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)比色法測(cè)定。

以上方法均按各試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 采用Excel2007進(jìn)行初步處理，用統(tǒng)計(jì)軟件SAS9.2中的ANOVA進(jìn)行單因素分析，若差異顯著時(shí)用Dunan氏法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

通過(guò)羊的攻毒試驗(yàn)，每一周分別采取對(duì)照組和攻毒組羊的全血，分離血清，對(duì)抗氧化指標(biāo)SOD活性及GSH、MDA、TSH、NPSH、NO等含量進(jìn)行測(cè)定（見(jiàn)表1）。對(duì)照組羊隨時(shí)間的增加，抗氧化指標(biāo)GSH、TSH含量呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，而MDA含量和NO含量呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，SOD活性和NPSH含量變化不明顯；攻毒組羊隨攻毒時(shí)間的增加，抗氧化指標(biāo)SOD活性、GSH、TSH、NPSH含量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，而MDA含量和NO含量呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，攻毒組羊隨著攻毒時(shí)間的增加，SOD含量在連續(xù)攻毒15 d時(shí)表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05），攻毒到21 d至實(shí)驗(yàn)終止表現(xiàn)差異極顯著（P＜0.01）；GSH含量在連續(xù)攻毒8 d時(shí)表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05），攻毒到15 d至實(shí)驗(yàn)終止表現(xiàn)差異極顯著（P＜0.01）；MDA含量在連續(xù)攻毒8 d時(shí)表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05），攻毒到15 d至實(shí)驗(yàn)終止表現(xiàn)差異極顯著（P＜0.01）；TSH含量在連續(xù)攻毒21 d時(shí)表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05），攻毒到28 d至實(shí)驗(yàn)終止表現(xiàn)差異極顯著（P＜0.01）；NPSH含量在連續(xù)攻毒21 d時(shí)表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05），攻毒到28 d至實(shí)驗(yàn)終止均表現(xiàn)差異極顯著（P＜0.01）；隨著實(shí)驗(yàn)組羊SW在體內(nèi)積累的增多，NO含量呈現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，在攻毒21 d至實(shí)驗(yàn)終止均表現(xiàn)差異極顯著（P＜0.01）。

表1 攻毒組與對(duì)照組羊攻毒期間血清SOD、GSH、MDA、TSH、NPSH、NO含量對(duì)比

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在前期對(duì)羊的臨床癥狀、剖檢、組織學(xué)及血清學(xué)進(jìn)行了觀察及測(cè)定，進(jìn)而對(duì)抗氧化指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，驗(yàn)證SW對(duì)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的影響，進(jìn)一步完善了SW中毒機(jī)制。SOD是機(jī)體內(nèi)一種具有特定生物催化功能的蛋白質(zhì)，主要分布于胞液和線粒體基質(zhì)中。SOD能與O2·-發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，消除O2·-過(guò)程中產(chǎn)生了H2O2，對(duì)機(jī)體同樣造成損害［3］。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，給羊飼喂一段時(shí)間苦馬豆素后，SOD活性在羊的血漿和腦組織中均顯著降低。表明苦馬豆素對(duì)羊SOD活性的影響是很嚴(yán)重的，而SOD活性的顯著降低，說(shuō)明機(jī)體抗氧化能力顯著減弱，機(jī)體清除氧自由基的能力嚴(yán)重降低，自由基代謝發(fā)生障礙，使得機(jī)體組織器官受到損傷，而腦組織損傷最為嚴(yán)重。說(shuō)明小花棘豆中毒引起的神經(jīng)系統(tǒng)的損傷與機(jī)體血漿和腦組織中SOD活性的降低有關(guān)。

還原型谷胱甘肽（GSH）是機(jī)體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物，具多種重要的生理功能，是一種能夠清除多種氧化物的小分子清除劑，而GSH含量的多少是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)［4］。SW能顯著降低血漿中GSH的含量，使得機(jī)體合成GSH-PX和GSH-ST的量減少，不能足夠地分解氫過(guò)氧化物，造成血紅蛋白及其他輔因子受氧化損傷，脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)，引起動(dòng)物機(jī)體組織器官發(fā)生病變，出現(xiàn)小花棘豆中毒后的組織病理學(xué)變化。梁剛等［5］研究表明，在氟中毒后，引起大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)，抗氧化能力降低，在這種情況下口服GSH，發(fā)現(xiàn)氟中毒引起的脂質(zhì)過(guò)氧化作用顯著降低，使得抗氧化能力增強(qiáng)。說(shuō)明GSH能夠作用于脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，也為治療小花棘豆中毒引起的脂質(zhì)過(guò)氧化作用提供了研究方向。

MDA作為反映氧化損傷的指標(biāo)之一，其生成量與氧自由基生成量成正相關(guān)［6］。通過(guò)對(duì)MDA含量測(cè)定，機(jī)體能夠正確快速地反映出受到自由基影響的程度及脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，進(jìn)而評(píng)估出機(jī)體損傷的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)中，血漿及腦組織MDA含量都隨著SW含量的積累而升高，說(shuō)明SW中毒時(shí)，機(jī)體自由基大量產(chǎn)生，細(xì)胞損傷嚴(yán)重。

巰基水平的降低可增強(qiáng)自由基的氧化損傷作用。研究表明［7］，巰基含量的降低可加重氧自由基的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷作用，主要起著內(nèi)源性抗氧化損傷作用，在一定程度上，NPSH含量變化比較敏感。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)組羊攻毒至21 d時(shí)，其血漿中TSH和NPSH含量與對(duì)照組相比明顯下降，表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05）。表明當(dāng)羊采食一定量的小花棘豆后，總巰基、非蛋白巰基的含量會(huì)出現(xiàn)下降，使得體內(nèi)組織中多余的氧自由基不能有效清除，加重了氧自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，對(duì)組織和細(xì)胞造成嚴(yán)重的損傷。NO具有舒張血管的作用，能調(diào)節(jié)組織器官的血流量，又是血管內(nèi)皮細(xì)胞、腦細(xì)胞及吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種較穩(wěn)定的自由基［8］。NO在體內(nèi)具有復(fù)雜的病理生理作用。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)血漿中抗氧化指標(biāo)含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)小花棘豆苦馬豆素對(duì)血漿中的指標(biāo)都有影響，影響隨中毒量的變化而改變，使得機(jī)體抗氧化能力減弱，清除氧自由基能力降低，引起自由基代謝發(fā)生障礙，組織器官發(fā)生病理性損傷，引起疾病的發(fā)生。這些變化也是引起小花棘豆苦馬豆素中毒后的組織器官病理學(xué)變化重要指標(biāo)。

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S826.1

A

2095-3887（2016）04-0062-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.04.017

2016-05-26

國(guó)家自然科學(xué)基金（31160520）；校級(jí)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（TDGR1201504）

何雯（1989-），女，碩士研究生。

陶大勇（1967-），男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)及中草藥學(xué)研究。