羔羊腹瀉病原菌常規(guī)分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

湯繼順，惠文巧，朱德建，陳 勝，蘇世廣

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，合肥 230031）

疾病防制

羔羊腹瀉病原菌常規(guī)分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

湯繼順，惠文巧，朱德建，陳 勝，蘇世廣

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，合肥 230031）

從安微省合肥、滁州地區(qū)的肉羊養(yǎng)殖場中共采集到羔羊腹瀉糞樣11份，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)與鏡檢，將分離的細(xì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)，并進(jìn)行生化鑒定、藥敏試驗(yàn)和小鼠攻毒致病性檢驗(yàn)。結(jié)果顯示：在檢測的11份糞樣中，共檢測出大腸桿菌11株、奇異變形桿菌7株；致病性試驗(yàn)顯示大腸桿菌和奇異變形桿菌均對(duì)小鼠有致病力，但奇異變形桿菌致病性弱于大腸桿菌；藥敏試驗(yàn)顯示分離菌株對(duì)恩諾沙星、氟苯尼考、卡那霉素、丁胺卡那霉素、菌必治、復(fù)方新諾明、丙氟哌酸、頭孢唑啉等敏感，對(duì)慶大霉素、氟哌酸等常規(guī)藥物均表現(xiàn)出一定的耐藥性，對(duì)青霉素、鏈霉素、克拉霉素、紅霉素和強(qiáng)力霉素等完全耐藥。結(jié)果表明，大腸桿菌和奇異變形桿菌都有一定的致病性，上述地區(qū)羔羊腹瀉是由混合感染引起，且混合感染致病性更強(qiáng)。

羔羊腹瀉；大腸桿菌；奇異變形桿菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

在動(dòng)物臨床診斷技術(shù)日益發(fā)展的今天，越來越多的先進(jìn)實(shí)驗(yàn)診斷方法不斷涌現(xiàn)，為疾病確診提供了更多的選擇，但常規(guī)的實(shí)驗(yàn)操作和診斷方法不需要較高的實(shí)驗(yàn)操作技能和昂貴的設(shè)備，仍存在一定應(yīng)用價(jià)值，可供臨床診斷選擇。在疾病初發(fā)期，如羔羊腹瀉，往往可以采用此種診斷技術(shù)來進(jìn)行病原菌確診，進(jìn)而快速篩選敏感藥物。羔羊腹瀉是指吮乳羔羊所發(fā)生的腹瀉，是嚴(yán)重影響羔羊成活和生長的主要疾病之一［1］，其病因復(fù)雜，除了日常飼養(yǎng)管理外，疾病因素不容忽視，目前國內(nèi)外關(guān)于羔羊腹瀉的研究很多，治療藥物也多種多樣。在走訪安徽省部分地區(qū)時(shí)發(fā)現(xiàn)，每個(gè)肉羊場都會(huì)出現(xiàn)羔羊腹瀉現(xiàn)象，依據(jù)飼養(yǎng)場的環(huán)境狀況，發(fā)病率有所不同，羔羊甚至出現(xiàn)反復(fù)發(fā)病，生長停滯，給養(yǎng)殖造成不小的經(jīng)濟(jì)損失。筆者等根據(jù)腹瀉羔羊表現(xiàn)的臨床癥狀，采集腹瀉糞樣，分離病原，采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)診斷方法進(jìn)行生化鑒定和藥敏試驗(yàn)，并依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果提出治療方案，以期為羔羊腹瀉病的病原檢測和防治提供方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

分別在安徽合肥、滁州兩個(gè)地區(qū)幾個(gè)規(guī)模化養(yǎng)羊場，選取腹瀉且未經(jīng)治療的羔羊，用無菌棉球棒直腸取糞樣，置于滅菌的2mL試管中保存。共采集羔羊腹瀉糞樣11份，其中合肥地區(qū)羊場5份，滁州地區(qū)羊場6份。

1.2 試驗(yàn)試劑與接種動(dòng)物

試驗(yàn)試劑：麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、血瓊脂、SS瓊脂、三糖鐵瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，生化鑒定管與藥敏片（恩諾沙星、氟苯尼考、氨芐青霉素、氟哌酸、卡那霉素、青霉素、鏈霉素、丁胺卡那、多粘菌素B、慶大霉素、痢特靈、菌必治、復(fù)方新諾明、丙氟哌酸、頭孢唑啉、新霉素、克拉霉素、阿奇霉素、紅霉素、強(qiáng)力霉素共20種）購自杭州微生物試劑有限公司。

接種動(dòng)物：70只健康雄性昆明系小鼠，體重20 g左右，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 病原菌的分離培養(yǎng) 將采集的糞樣按常規(guī)方法接種于麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基和SS瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌在各種瓊脂平板上的生長情況。用無菌接種環(huán)分別挑取麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落，接種普通營養(yǎng)瓊脂斜面，37℃純培養(yǎng)24 h，將純培養(yǎng)物接種營養(yǎng)肉湯和三糖鐵瓊脂。

1.3.2 形態(tài)學(xué)鑒定 對(duì)純培養(yǎng)物涂片，革蘭氏染色，固定，鏡檢。

1.3.3 生化鑒定 挑取純培養(yǎng)物接種于三糖鐵瓊脂、糖微量發(fā)酵管（葡萄糖、木糖、棉子糖）、半固體瓊脂、氨基酸生化管（賴氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸）、尿素分解管、硫化氫、蛋白胨水、山梨醇、側(cè)金盞花醇、枸椽酸鹽管，并進(jìn)行甲基紅（MR）試驗(yàn)、VP試驗(yàn)等，37℃培養(yǎng)24～72 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.3.4 致病性檢測 根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，挑取純培養(yǎng)的菌落，接種于營養(yǎng)肉湯中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，營養(yǎng)肉湯均勻渾濁，取營養(yǎng)肉湯菌液培養(yǎng)基，備用。取健康小鼠，根據(jù)不同地區(qū)和分離細(xì)菌種類分組，并設(shè)對(duì)照組，每組10只。將上述制備的待測菌液腹腔接種于試驗(yàn)組小鼠（0.3mL/只），對(duì)照組小鼠注射等量營養(yǎng)肉湯，觀察48 h，記錄癥狀。如有死亡，剖檢死亡小鼠，無菌采集心臟血、肝臟和脾臟，涂片、革蘭氏染色、鏡檢。同時(shí)蘸取少量腹水在麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上均勻涂抹，37℃培養(yǎng)18～24 h后，觀察結(jié)果。

1.3.5 藥敏試驗(yàn) 將純培養(yǎng)的細(xì)菌菌液滴入普通營養(yǎng)瓊脂平皿上，用涂抹器涂抹均勻或接種環(huán)劃線，用無菌鑷子將20種藥敏紙片分別貼于培養(yǎng)基表面，每塊平皿上貼4～5片，各片之間距離相等，37℃培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果。根據(jù)藥物紙片有無抑菌圈及其大小來判斷待測菌對(duì)各種藥物的敏感程度，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)［2］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌培養(yǎng)特性及形態(tài)特征

由表1可知，在采集的11份羔羊腹瀉糞樣中，可得到兩種不同形態(tài)特征菌落，記為C菌與M菌，其中C菌共培養(yǎng)11株（合肥地區(qū)記為HC菌，共5株；滁州地區(qū)記為CC菌，共6株），M菌共培養(yǎng)7株（合肥地區(qū)記為HM菌，共3株；滁州地區(qū)記為CM菌，共4株）。C菌和M菌在這幾種瓊脂培養(yǎng)基中均能生長，但菌落顏色、生長方式不盡相同，C菌在血瓊脂培養(yǎng)基中有β溶血現(xiàn)象，M菌在營養(yǎng)瓊脂中有腐臭味。

表1 分離菌的培養(yǎng)特性及形態(tài)特征

2.2鏡檢結(jié)果

將C菌和M菌中每個(gè)菌落純培養(yǎng)物涂片后，革蘭氏染色為陰性，在顯微鏡下觀察，C菌為短桿菌，兩端鈍圓，大多單個(gè)存在，有的成對(duì)存在，不形成芽孢和莢膜；M菌兩端鈍圓，形態(tài)多樣，有桿狀、球狀等，無莢膜，不形成芽孢。根據(jù)羔羊腹瀉糞便中分離得到的細(xì)菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)特征，可初步判定其為腸道桿菌。

2.3 分離菌生化鑒定結(jié)果

分離菌生化特性試驗(yàn)結(jié)果見表2。C菌能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、產(chǎn)酸又產(chǎn)氣。葡磷胨水（VP-MR）試驗(yàn)陰性，產(chǎn)生靛基質(zhì)（吲哚），不分解尿素酶，不產(chǎn)生硫化氫，有運(yùn)動(dòng)力，不能利用枸椽酸鹽。M菌發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵乳糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇；尿素酶、硫化氫試驗(yàn)陽性；靛基質(zhì)陰性；有運(yùn)動(dòng)力。從分離菌的生化特性，結(jié)合培養(yǎng)特性和形態(tài)特征，判定C菌為大腸埃希菌，M菌為奇異變形桿菌。

表2 分離菌株的生化特性

2.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果

由表3可見，菌液注射后8 h，試驗(yàn)組小鼠開始出現(xiàn)精神萎靡，食欲、飲水下降，打堆，活動(dòng)減少，大部分小白鼠尿色變深，尾根部出現(xiàn)稀糞附著；24 h后出現(xiàn)死亡和腹瀉，發(fā)病小鼠蜷縮不動(dòng)；36 h后，死亡率下降；48 h后，基本沒有死亡。混合菌感染組小鼠發(fā)病率達(dá)100%，死亡率高達(dá)90%以上。剖檢死亡小鼠，發(fā)現(xiàn)所有死亡小鼠的腹腔內(nèi)均有漿液滲出，脾臟壞死，肝臟邊緣壞死，大腸臌氣，暗紅，腸道充滿黃色液體。從死亡小鼠的肝臟、心臟及腸液中回收細(xì)菌，經(jīng)染色鏡檢并進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和生化試驗(yàn)，結(jié)果與接種菌一致。對(duì)照組小鼠全部成活。

表3 分離菌的致病性檢驗(yàn)

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表4可見，對(duì)大腸桿菌（C菌）敏感的藥物有恩諾沙星、氟苯尼考、卡那霉素、丁胺卡那霉素、痢特靈、菌必治、復(fù)方新諾明、丙氟哌酸、頭孢唑啉和阿奇霉素；對(duì)奇異變形桿菌（M菌）敏感的藥物有恩諾沙星、氟苯尼考、卡那霉素、丁胺卡那霉素、菌必治、復(fù)方新諾明、丙氟哌酸、頭孢唑啉；兩種菌對(duì)氟哌酸、慶大霉素和新霉素等藥物均為中等敏感，對(duì)青霉素、鏈霉素、克拉霉素、紅霉素和強(qiáng)力霉素等完全耐藥。

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

3.1 羊場調(diào)研情況

在羊場實(shí)際調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，羔羊腹瀉造成較高的死亡率，這是因?yàn)楹芏嘌驁鲲曫B(yǎng)環(huán)境差，糞污無法及時(shí)處理，圈舍內(nèi)氨氣濃度高。羔羊免疫力低下，抗病力弱，吮乳時(shí)容易造成細(xì)菌感染，發(fā)生羔羊腹瀉。急性腹瀉能導(dǎo)致羔羊很快死亡，通過藥物治療后，病情得到一定控制，轉(zhuǎn)為慢性腹瀉，但羔羊生長受阻或生長停滯。在調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生狀況是羔羊腹瀉的主要誘因，有些養(yǎng)殖場羔羊腹瀉的發(fā)病率為30%～100%，嚴(yán)重影響肉羊生產(chǎn)。另外羊場負(fù)責(zé)人只重視數(shù)量，忽視飼養(yǎng)管理和疾病防治，造成3月齡以內(nèi)的羔羊腹瀉反復(fù)發(fā)生，嚴(yán)重影響羔羊的生長發(fā)育和成年后的生產(chǎn)性能，且該現(xiàn)象在各個(gè)養(yǎng)殖場普遍存在。

3.2 分離菌的致病性

本試驗(yàn)從腹瀉羔羊糞樣中共分離出11株大腸桿菌和7株奇異變形桿菌，采用常規(guī)方法對(duì)細(xì)菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性進(jìn)行鑒定，最終鑒定為大腸桿菌與奇異變形桿菌的混合感染，檢測方法簡單易行，不需高端儀器，在一般養(yǎng)殖場借助簡單設(shè)備即可操作，但具有一定的主觀因素，目前細(xì)菌鑒定的最好方法是PCR［3-5］。這兩種菌均為條件性致病菌，即在一定的條件下能夠致使羔羊發(fā)病，文獻(xiàn)中對(duì)羔羊大腸桿菌性腹瀉研究很透徹［6-7］，但對(duì)由奇異變形桿菌引起羔羊腹瀉的報(bào)道不多。大腸桿菌分為非致病性和致病性兩類，非致病性大腸桿菌是動(dòng)物腸道正常菌，而致病性大腸桿菌能導(dǎo)致動(dòng)物腹瀉甚至死亡，鑒于試驗(yàn)條件，本次未做大腸桿菌血清型鑒定。奇異變形桿菌屬于腸桿菌科變形桿菌屬，為無莢膜、無芽孢的革蘭氏陰性桿菌，該菌在自然界分布廣泛，能存在于糞便、污水、土壤中，在一定條件下可引起多種動(dòng)物感染，導(dǎo)致動(dòng)物死亡［8］。

在本次試驗(yàn)中，用細(xì)菌培養(yǎng)液進(jìn)行小鼠攻毒試驗(yàn)，結(jié)果表明，兩種細(xì)菌均有致病性，奇異變形桿菌致病性弱于大腸桿菌，但混合感染致病性更高。從本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，過去不太引起人們重視的細(xì)菌性疾病和條件致病菌感染，隨著時(shí)間的推移和抗生素的濫用，其耐藥性會(huì)在同一種屬甚至在不同種屬內(nèi)進(jìn)行傳播和擴(kuò)散，給臨床治療帶來極大困難，如常用的氟哌酸、慶大霉素等藥基本上屬于中敏藥物，甚至無效。因此，對(duì)其流行情況進(jìn)行檢測和耐藥分析，可減少臨床用藥浪費(fèi)，對(duì)指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物非常有必要。

3.3 防治措施

加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、消除誘因。對(duì)妊娠后期的母羊要供應(yīng)充足的蛋白質(zhì)和維生素飼料，對(duì)新生羔羊應(yīng)及時(shí)飼喂初乳，以盡早獲得母源抗體；助產(chǎn)時(shí)應(yīng)加強(qiáng)消毒衛(wèi)生，臍帶用5%～10%碘酊浸泡，羊床要注意消毒。對(duì)發(fā)生過大腸桿菌病的養(yǎng)殖場可從本場分離致病菌，制作成自家大腸桿菌疫苗，結(jié)合本場情況制定合理的免疫程序，按時(shí)使用疫苗預(yù)防接種，可獲得較好的防治效果。一旦發(fā)生羔羊細(xì)菌性腹瀉，可在藥敏試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇高敏藥物進(jìn)行治療，既能收到理想的治療效果，又可降低生產(chǎn)成本，獲取較高的經(jīng)濟(jì)效益；同時(shí)還可避免或減少耐藥菌株的產(chǎn)生。在治療時(shí)，以消除病因?yàn)橹?，輔以促消化，抗菌消炎，防止酸中毒，制止胃腸發(fā)酵和腐敗，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力。

［1］安俊卿，任志宏，劉曉倩，等．致羔羊腹瀉大腸埃希菌的分離鑒定及防治［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2013，32（1）:8-10.

［2］中華人民共和國衛(wèi)生部.WS/T125—1999紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2000.

［3］于超，郭海勇，魏嘉良，等.16S～23S rRNA基因序列在細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（2）：57-60.

［4］羅兆飛，張為宇，楊得勝.動(dòng)物性食品中奇異變形桿菌PCR檢測方法的研究［J］.福建畜牧獸醫(yī)，2008（1）：1-3.

［5］王豪舉，倪莉，楊紅軍，等.山羊奇異變形桿菌的分離鑒定及16S rDNA和ZapA基因的PCR-RFLP分析［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，31（11）：1594-1598.

［6］雷延慧，華洛加.羔羊腹瀉的調(diào)查及綜合防制［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2009，36（6）：175-177.

［7］喻華英，底麗娜.新疆羔羊腹瀉病病原菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)［J］.中國獸醫(yī)雜志，2012，48（5）：41-43.

［8］孫化露，盧艷，彭大新，等.3株鴿源奇異變形桿菌的分離與鑒定［J］.畜牧與獸醫(yī)，2012，44（1）：68-70.

Isolation，Identification of Lam b Diarrhea Pathogens and the Screening of Sensitive Drugs

Tang Jishun，Hui Wenqiao，Chen Sheng，et al
（Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Anhui Academy of Agricultural Science，Hefei230031，China）

In order to isolate and identify the pathogens using conventional methods as well as select the useful drug treatment for lamb diarrhea，the 11 fecal samples from lambs with diarrhea were collected from the mutton sheep/goat farms in Hefei and Chuzhou city.11 samples of E.coli and 7 samples of Proteus mirabilis in the 11 fecal samples were detected，then the separated bacteria was purely cultured，biochemically identified，the drug sensitive test and the toxic pathogenic experiments in mice were carried out.The pathogenicity test showed that E.coli and Proteus mirabilis were virulent to mice，but the pathogenicity of Proteus mirabilis was weaker than that of the E.coli.The drug sensitivity test showed that enrofloxacin，florfenicol，kanamycin，amikacin，ceftriaxone，cotrimoxazole，norfloxacin propionate and cefazolin were effective to the seperated bacteria；gentamicin and norfloxacin a little effective，penicillin，streptomycin，clarithromycin and doxycycline ineffective.It is concluded that E.coli and Proteus mirabilis have certain pathogenicity，lamb diarrhea in these regions is caused by the mixed infection，and which is more pathogenic.

lamb diarrhea；E.coli；Proteus mirabilis；isolation and identification；drug sensitive test

S858.26

A

2095-3887（2016）04-0042-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.04.012

2016-05-28

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目（15b0415）

湯繼順（1979-），男，助理研究員，主要從事肉羊繁育和疾病防治研究。

陳勝（1974-），男，副研究員，主要從事草食動(dòng)物遺傳育種與繁殖工作。