阿勒泰羊高繁性狀候選基因BMPR-IB、BMP15的研究

於建國，郝 耿，陳 童，托合塔森·皮達巴依，徐 東

（1.新疆畜牧科學院畜牧所，烏魯木齊830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站，烏魯木齊830000；3.新疆維吾爾自治區(qū)福?？h齊干吉迭鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，福海836400）

遺傳育種

阿勒泰羊高繁性狀候選基因BMPR-IB、BMP15的研究

於建國1，郝 耿1，陳 童1，托合塔森·皮達巴依2，徐 東3

（1.新疆畜牧科學院畜牧所，烏魯木齊830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站，烏魯木齊830000；3.新疆維吾爾自治區(qū)福?？h齊干吉迭鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，福海836400）

試驗以BMPR-IB的FecB位點，BMP15基因的B1、FecXG（B2）、FecXB（B4）3個位點為阿勒泰羊高繁性狀候選基因，采用PCR-RFLP、SSCP技術檢測了116只阿勒泰羊上述4個位點的單核苷酸多態(tài)性。結果表明：阿勒泰羊FecB、FecXG（B2）、FecXB（B4）位點只存在野生型，無多態(tài)性。B1位點檢測到AA、AB、BB三種基因型，其基因型頻率分別為0.63、0.29、0.08，等位基因A、B的頻率分別為0.78、0.22。

阿勒泰羊；FecB；BMP15；RFLP；SSCP

阿勒泰羊是新疆優(yōu)良的地方肉羊品種，在遺傳進化分類上屬于哈薩克羊的一個分支，在生物學分類上屬于脂臀型粗毛羊。阿勒泰羊主要集中在阿勒泰地區(qū)的福?？h、富蘊縣、青河縣等地，南北疆其他地區(qū)以及內(nèi)地部分省份近年來也先后引進阿勒泰羊進行養(yǎng)殖。

阿勒泰羊具有耐粗飼、抗寒性強、善跋涉、生長速度快、屠宰率高、肉質(zhì)好等優(yōu)良性狀。但其繁殖率相對較低，經(jīng)產(chǎn)母羊產(chǎn)羔率110%，初產(chǎn)母羊產(chǎn)羔率103%［1］。在生產(chǎn)實際中阿勒泰羊存在連續(xù)2～3胎產(chǎn)雙羔的個體，因此，如何建立具有高繁殖性能的阿勒泰羊群體，為地方肉羊良種羊建立具有高繁殖率的新類群是當前阿勒泰羊面臨的重大問題。本研究通過開展與綿羊高繁殖率性能相關的候選基因BMPR-IB、BMP15的研究，分析4個突變位點的多態(tài)性與阿勒泰羊高繁殖率性狀的相關性，為開展阿勒泰羊高繁殖率的新類群提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

阿勒泰羊血樣采自新疆福海縣齊干吉迭鄉(xiāng)阿勒泰雙羔羊繁育基地，用EDTA抗凝真空管進行頸靜脈采血，每只3mL，共采集116只母羊血樣，-20℃凍存，用酚氯仿抽提法提取基因組DNA，溶于TE中，4℃保存。

1.2 引物設計

BMPR-IB基因序列（FecB（A746G））擴增引物參照TheresaWilson等［2］發(fā)表的引物，BMP15基因B1、B2、B4序列擴增引物參照Hanrahan等［3］發(fā)表的引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列見表1。

表1 BMPR-IB和BMP15基因擴增區(qū)域引物序列與擴增片段長度

1.3 PCR擴增及酶切、SSCP分析

PCR擴增反應體系：20μL，其中10×緩沖液2μL，2.5mmol/L dNTP 1.5μL，DNA模板1μL，上下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶1U，滅菌ddH2O 12.5μL。PCR產(chǎn)物用12%聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳檢測或2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴增反應體系見表2。

表2 BMPR-IB和BMP15基因擴增區(qū)PCR反應體系

酶切反應：BMPR-IB FecB位點PCR擴增產(chǎn)物用AvaII內(nèi)切酶進行酶切；BMP15B2位點PCR擴增產(chǎn)物用Hinf I內(nèi)切酶進行酶切；BMP15B4位點PCR擴增產(chǎn)物用Dde I內(nèi)切酶進行酶切。37℃反應4 h，酶切產(chǎn)物用12% PAGE凝膠電泳檢測。

SSCP體系：7μL PCR擴增產(chǎn)物，7μL變性緩沖液（98甲酰胺、0.025%溴酚藍、0.025%二甲苯氰、pH=8的10mmol/LEDTA、10%甘油），0.2mL離心管混勻，98℃變性10min，迅速插入冰水，放置5min，4℃條件下，用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

圖1 BMPR-IB基因FecB位點PCR擴增產(chǎn)物

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

FecB位點PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，BMP15B1、B2、B4三個位點PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測，結果見圖1～4。BMPR-IB FecB位點擴增產(chǎn)物為140bp，BMP15B1位點PCR擴增產(chǎn)物為234bp、B2位點PCR擴增產(chǎn)物為141 bp、B4位點PCR擴增產(chǎn)物為153 bp，4個突變位點PCR擴增產(chǎn)物長度均與預期結果一致。

圖2 BMP15基因B1位點PCR擴增產(chǎn)物

圖3 BMP15基因B2位點PCR擴增產(chǎn)物

圖4 BMP15基因B4位點PCR擴增產(chǎn)物

2.2 PCR產(chǎn)物SSCP多態(tài)性

BMP15B1位點PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)SSCP檢測分析，發(fā)現(xiàn)該片段存在多態(tài)性，分別定義為：AA、AB和BB。如圖5所示，電泳結果從左至右泳道基因型分別為：AA、AA、AB、AA、BB、AA、BB、AA和BB。等位基因A、B的頻率分別為0.78、0.22，AA、AB和BB基因型頻率分別為0.63、0.29、0.08，結果見表3。

圖5 BMP15基因B1位點PCR擴增產(chǎn)物SSCP分析結果

表3 FecB、B1、B2、B4位點基因頻率和基因型頻率（n=116）

2.3 PCR產(chǎn)物酶切結果

BMPR-IB FecB位點PCR擴增產(chǎn)物用AvaII內(nèi)切酶進行酶切，酶切產(chǎn)物電泳后PCR擴增產(chǎn)物仍為1條帶，未出現(xiàn)條帶切開現(xiàn)象，表明所有個體在該位點上均為野生型，無多態(tài)性。BMP15B2位點PCR擴增產(chǎn)物用Hinf I內(nèi)切酶進行酶切后得到2條片段（111 bp，30 bp），無多態(tài)性。BMP15 B4位點PCR擴增產(chǎn)物用Dde I內(nèi)切酶進行酶切后得到2條片段（122 bp，31 bp），無多態(tài)性。3個位點PCR產(chǎn)物酶切結果表明，樣本羊在該3個位點上均為野生型，結果見圖6～8。

圖6 BMPR-IB基因FecB位點PCR擴增產(chǎn)物酶切結果

圖7 BMP15基因B2位點PCR擴增產(chǎn)物酶切結果

圖8 BMP15基因B4位點PCR擴增產(chǎn)物酶切結果

3 討論

BMPR-IB基因編碼區(qū)746位點上發(fā)生A-G突變，導致對應位點上氨基酸由谷氨酰胺變成了精氨酸，該位點于1980年在Booroola羊上首次發(fā)現(xiàn)，并命名為FecB。FecB突變位點在我國的小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、多浪羊等綿羊品種中也先后被發(fā)現(xiàn)。韓穎潔等［4］通過檢測小尾寒羊BMPR-IB基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)該基因存在BB、B+ 和++三種基因型，基因型頻率分別為0.067、0.360和0.573，平均產(chǎn)羔數(shù)分別為2.55、2.35和1.28只。吳麗麗等［5］在湖羊中開展BMPR-IB基因多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)只存在BB、B+兩種基因型，未檢測到++基因型個體，其結果與王根林等［6］、管峰等［7］研究結果相一致，認為BMPR-IB基因是影響湖羊高繁殖力的一個主效基因。馬海玉等［8］檢測到吐魯番黑羊BMPR-IB基因只存在1種基因型，沒有多態(tài)性。哈薩克羊和策勒黑羊群體中的BMPR-IB基因具有多態(tài)性，存在3種基因型：++、B+和BB，其中BB基因型個體的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于++基因型個體（P＜ 0.05）。邵勇鋼等［9］在策勒黑羊中檢測到BMPR-IB基因存在多態(tài)性，BB、B+基因型間產(chǎn)羔數(shù)極顯著高于++基因型（P＜0.01），但BB、B+基因型間產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著（P＞0.05），認為在策勒黑羊中B等位基因可用于對策勒黑羊產(chǎn)羔數(shù)的選擇。本研究結果顯示，在組建的阿勒泰羊多胎群體中未檢測到BMPR-IB基因在FecB位點存在多態(tài)性，無突變基因B，初步認為，BMPR-IB基因FecB突變位點不是引起阿勒泰羊多羔群體產(chǎn)羔數(shù)增加的主效基因。

BMP15基因由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成，位于X染色體上，編碼序列全長1 179 bp。BMP15在卵母細胞發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，研究已發(fā)現(xiàn)，綿羊BMP15基因具有FecXI，F(xiàn)ecXH，F(xiàn)ecXL，B1，F(xiàn)ecXG（B2），B3，F(xiàn)ecXB（B4）共7個不同突變。Hanrahan等研究Cambridge和Belclare綿羊BMP15基因發(fā)現(xiàn)，在編碼區(qū)有4個單核苷酸多態(tài)，第28～30位的堿基CTT缺失，導致編碼區(qū)第10個氨基酸殘基亮氨酸缺失，形成B1突變體，但該突變并不改變BMP15的功能；第718位的堿基C突變?yōu)門，導致了編碼區(qū)239號氨基酸殘基谷氨酰胺被一個早熟終止密碼子代替，形成B2突變體，該突變可能導致了BMP15功能的徹底喪失；第1 100位的堿基G突變?yōu)門，導致了編碼區(qū)367號氨基酸殘基絲氨酸變?yōu)楫惲涟彼?，形成B4突變體，該突變改變了BMP15的功能。楊晶等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在小尾寒羊和陶賽特羊中均檢測到B1突變位點，但含突變基因的個體與野生型個體產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著（P＞0.05），BMP15基因B1突變位點不能作為小尾寒羊高繁殖率的主效基因。劉永斌等［11］在蒙古羊中發(fā)現(xiàn)B1突變位點，但含突變基因的個體與野生型個體產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著（P＞0.05），BMP15基因B1突變位點不能作為蒙古羊多胎群體高繁殖率的主效基因。本研究對阿勒泰羊BMP15基因上的B1、B2和B4突變位點進行檢測分析發(fā)現(xiàn)，B2和B4突變位點沒有多態(tài)性，只有B1突變位點具有多態(tài)性。B1突變位點等位基因A、B的頻率分別為0.78、0.22，AA、AB和BB基因型頻率分別為0.63、0.29、0.08，但含突變基因的個體與野生型個體產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著（P＞0.05），初步認為B1不能作為阿勒泰羊多胎群體高繁殖率的主效基因。

［1］阿勒泰羊［S］.NY/T 1816—2009.

［2］Theresa Wilson.Highly prolific Booroola sheep have a mutation in the intracellular kinase domain of bone morphogenetic protein IB receptor （ALK-6）that is expressed in both oocytes and granulose cells［J］.Biology of Reproduction，2001，64：1225-1235.

［3］Hanrahan J P，Gregan SM，Mulsant P，et a1.Mutations in the genes for oocyte-derived growth factors GDF9 and BMP15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belclare sheep（Ovisaries）［J］.Biology of Reproduction，2004，70（4）：900-909.

［4］韓穎潔，劉月琴，張英杰.小尾寒羊BMPR-IB基因多態(tài)性研究［J］.中國草食動物科學，2014，34（增刊）：90-92.

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［6］王根林，毛鑫智，George HDavis，等.DNA分析發(fā)現(xiàn)我國湖羊和小尾寒羊存在Booroola（FecB）多胎基因［J］.南京農(nóng)業(yè)大學學報，2003，26（1）：104-106．

［7］管峰，艾君濤，劉守仁，等.BMPR-IB和BMP15基因作為湖羊多胎性候選基因的研究［J］.家畜生態(tài)學報，2005，26（3）：9-12．

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［10］楊晶.小尾寒羊GDF9基因和BMP15基因多態(tài)性及其與高繁殖力關系的研究［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2006.

［11］劉永斌，何小龍，王峰.蒙古羊BMP15基因外顯子1位點多態(tài)性與產(chǎn)羔性能關系分析［J］.華北農(nóng)學報，2008，23（5）：30-34.

Study on BMPR-IB，BMP15 asCandidate Genes for Prolific Traits of Altay Sheep

Yu Jianguo，Hao Geng，Chen Tong，et al
（Xinjiang Academy of Animal Sciences，Urumqi830000，China）

In this study，the single nucleotide polymorphism of four loci（FecB of BMPR-IB，B1，F(xiàn)ecXGand FecXBof BMP15）from 116 Altay sheep were detected using PRC-RFLP，SSCP technique.The results showed that there were no polymorphism in the loci of FecB，F(xiàn)ecXGand FecXB，only wild type loci；there were three genotypes（AA，AB，BB）in the loci of B1，their frequencies were 0.63，0.29，0.08 respectively，the frequencies of allele gene A and B were 0.78 and 0.22 respectively.

Altay sheep；FecB；BMP15；RFLP；SSCP

S826.2

A

2095-3887（2016）04-0001-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.04.001

2016-04-22

新疆自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務費項目（KY2015010）

於建國（1977-），男，助理研究員。研究方向：動物遺傳育種。