張謙，劉志東，秦璐，顧星，馮光維

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程研究中心，天津　300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室一省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津　300193）

丹參酮Ⅰ固體脂質(zhì)納米粒的制備及評(píng)價(jià)*

張謙1，2，劉志東1，2，秦璐1，2，顧星1，2，馮光維1，2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程研究中心，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室一省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津300193）

［目的］制備丹參酮Ⅰ固體脂質(zhì)納米粒（TSⅠ-SLN）并對(duì)其性質(zhì)質(zhì)量進(jìn)行考察。［方法］TSⅠ-SLN的制備方法選用乳化固化法，并以制劑的粒徑、電位和包封率為考察指標(biāo)。對(duì)TSⅠ-SLN凍干品進(jìn)行差式掃描量熱法（DSC）檢測(cè)。［結(jié)果］TSⅠ-SLN的平均粒徑為（128±2.00）nm，電位為（-9.35±0.12）mV；TSⅠ的包封率為（74.03±1.32）%。DSC結(jié)果表明丹參酮Ⅰ包裹在納米粒中。［結(jié)論］采用乳化固化法安全可靠，簡(jiǎn)單易行；該方法下制備的SLN具有較小的粒徑和較高的包封率；且理化性質(zhì)穩(wěn)定，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)。

丹參酮Ⅰ；固體脂質(zhì)納米粒；制備；評(píng)價(jià)

據(jù)報(bào)道丹參酮具有極為廣泛的藥理作用，隨著不斷地研究深入，發(fā)現(xiàn)丹參酮具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用［1］，其中丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA等成分能夠抑制血液惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并且促進(jìn)其凋亡［2］；此外丹參酮亦具有較強(qiáng)的抗心肌缺血缺氧，改善微循環(huán)，增加血流量的作用［3］，此作用在臨床上得到廣泛應(yīng)用。丹參酮Ⅰ是丹參提取物中有效的脂溶性成分，不僅具有天然的抗氧化、抗菌消炎的作用，還具有較強(qiáng)的心血管作用［4］。由于丹參酮Ⅰ在水中難溶，不利于給藥吸收。曾有人將其制成固體分散物以提高療效，但事與愿違，實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不理想［5-6］。固體脂質(zhì)納米粒（SLN）作為一種新型的給藥系統(tǒng)載體，具有物理穩(wěn)定性好，藥物包封率高，無(wú)毒以及生物可降解等特性［7］。本次實(shí)驗(yàn)將丹參酮Ⅰ制備成為SLN，并考察其粒徑、電位，包封率等理化性質(zhì)，以確保制劑的質(zhì)量和安全性，保障下一步實(shí)驗(yàn)研究的順利進(jìn)行。

1　儀器與試劑

1.1儀器SPD-10Avp島津高效液相色譜儀（HPLC，日本Shimadzu）；磁力攪拌（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），低速臺(tái)式離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司），GM-0.33II型沸騰隔膜真空泵（天津Autoscience公司），C3860A超聲清洗器（天津Autoscience公司），AX205電子天平（Mettler Toledo，瑞士），激光粒徑測(cè)定儀（馬爾文，英國(guó)），Jade DSC差示掃描量熱儀（Perkin-Elmer，美國(guó)），冷凍干燥機(jī)（FDU-2100，日本），Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore，美國(guó)）。

1.2試劑丹參酮Ⅰ對(duì)照品（天津中新藥業(yè)，批號(hào)W13-0-1，含量≥98%），大豆卵磷脂（Lipoid S100，美國(guó)，批號(hào)79580-41/904），單硬脂酸甘油酯（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所），ATO888（Gattefosse，法國(guó)），Myrj52（南京威爾化工有限公司，批號(hào)20130706），甲醇（天津康科德科技有限公司），無(wú)水乙醇（天津康科德科技有限公司），三氯甲烷（天津康科德科技有限公司）、三氯甲烷、乙醇均為分析純，甲醇為色譜純。

2　方法與結(jié)果

2.1丹參酮Ⅰ-SLN的制備采用乳化固化法制備丹參酮Ⅰ-SLN。稱(chēng)取處方量的丹參酮Ⅰ、大豆卵磷脂和單硬酸甘油酯溶于適量的無(wú)水乙醇中，另稱(chēng)取ATO888適量，并加入少量的氯仿使之溶解，將無(wú)水乙醇和氯仿混合，攪拌加熱使之完全混合構(gòu)成油相。稱(chēng)取適量的Myrj52加入超純水，74℃水浴攪拌加熱至完全溶解，構(gòu)成水相。將水相放入在74℃水浴中磁力攪拌，緩緩加入油相，繼續(xù)攪拌直至體積濃縮至原來(lái)的1/3。放入4℃冰箱中冷藏2 h，過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，得到丹參酮Ⅰ固體脂質(zhì)納米粒混懸液［8］。制劑呈紅棕色，澄清半透明，并伴有乳樣光澤。

2.2粒徑、電位的測(cè)定取丹參酮Ⅰ-SLN 100 μL，并用超純水稀釋15倍。激光粒徑測(cè)定儀測(cè)定其粒徑、電位。得到丹參酮Ⅰ-SLN的平均粒徑為（128± 2.00）nm；電位為（-9.35±0.12）mV；PDI值為（0.16± 0.07）。粒徑、電位圖如圖1、圖2所示。

圖1　丹參酮Ⅰ-SLN粒徑分布圖

圖2　丹參酮Ⅰ-SLN電位分布圖

2.3分析方法確立

2.3.1色譜條件色譜柱：Diamond DIKMAODS C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（90∶10，V/V）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：244 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3.2專(zhuān)屬性考察分別取空白制劑、對(duì)照品溶液按照上述色譜條件進(jìn)樣，得到色譜圖。根據(jù)色譜圖可知，在丹參酮Ⅰ的出峰時(shí)間處空白制劑未出峰，說(shuō)明在此色譜條件下，制劑中各種輔料對(duì)丹參酮Ⅰ無(wú)干擾，此分析方法專(zhuān)屬性良好。

2.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱(chēng)取丹參酮Ⅰ對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋成濃度分別為0.532、2.660、6.384、10.640、15.960 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)供試液。按照上述色譜條件，進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，以樣品色譜峰面積A對(duì)濃度c（mg/L）進(jìn)行線性回歸。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為A=218 229c-11 222，r2= 0.999，表明丹參酮Ⅰ在0.532～15.960 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4精密度考察選取低、中、高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 d內(nèi)重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；連續(xù)測(cè)定3 d，求算日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%，精密度符合方法學(xué)要求。

表1　丹參酮Ⅰ的精密度結(jié)果（n=3）

2.4包封率的測(cè)定采用超濾離心法測(cè)量丹參酮Ⅰ-SLN的包封率。取制劑200 μL，加超純水稀釋15倍，渦旋混勻后置于超濾離心管內(nèi)，5 000 r/min，離心20 min，游離藥物存在于外管中。即取外管樣品進(jìn)樣檢測(cè)，即為W游；另取200 μL的納米粒加入甲醇2.8mL超聲10min破乳，5000r/min，離心20min，離心后取上清液進(jìn)樣，HPLC測(cè)定，即為W總。根據(jù)公式EE（%）=（W總-W游）/W總×100計(jì)算制劑中丹參酮Ⅰ的包封率。測(cè)得丹參酮Ⅰ的包封率為（74.03± 1.32）%。

2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)按照處方量制備3批丹參酮Ⅰ-SLN，并對(duì)其粒徑、電位和包封率測(cè)定評(píng)價(jià)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　不同批次的丹參酮Ⅰ-SLN評(píng)價(jià)結(jié)果（±s）

表2　不同批次的丹參酮Ⅰ-SLN評(píng)價(jià)結(jié)果（±s）

樣品n123Aver粒徑（nm）3126.10127.80130.10128±2.00電位（mV）3-9.23-9.35-9.47-9.35±0.12包封率（%）373.5775.5273.0074.03±1.32

由上述數(shù)據(jù)可知，制得的3批樣品粒徑均一，電位和包封率穩(wěn)定，說(shuō)明該處方制劑重復(fù)性良好。

2.6差式掃描量熱法（DSC）分析分別取丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品、丹參酮Ⅰ-SLN、空白固體脂質(zhì)納米粒以及物理混合物（空白納米?！玫⑼?3∶2）的凍干品，采用差式掃描熱量方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。以空鋁坩堝為對(duì)照，另取坩堝放入5～10 mg的樣品，設(shè)定升溫速率為25℃/min，掃描范圍為30～300℃。得到各個(gè)樣品的DSC如圖3。

從圖3中可以看出，A中顯示丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品在234℃處出現(xiàn)熔融吸熱峰；B、C中該峰消失，但在46℃和155℃時(shí)出現(xiàn)較強(qiáng)的熔融吸熱峰，說(shuō)明這倆個(gè)峰為制劑的特征峰；在丹參酮Ⅰ與空白SLN的物理混合物D中也明顯見(jiàn)到234℃的吸熱峰的出現(xiàn)，并具有制劑特征峰。物理混合物中可見(jiàn)制劑的特征吸熱峰，并在234℃出現(xiàn)了丹參酮Ⅰ的特征峰。與文獻(xiàn)中保持一致，由此可以說(shuō)明丹參酮Ⅰ在制備成納米粒后被包裹于其中，丹參酮Ⅰ在納米粒中不是以晶體的形態(tài)存在，而是以分子分散狀態(tài)存在［9］。

圖3　丹參酮Ⅰ及丹參酮Ⅰ-SLN的DSC圖

3　討論

固體脂質(zhì)納米粒的常用制備方法有高壓乳勻法、微乳法、乳化固化法和超聲分散法［10］。本次實(shí)驗(yàn)采用乳化固化法制備丹參酮Ⅰ固體脂質(zhì)納米粒，該制備方法具有操作簡(jiǎn)便，制備快速，對(duì)儀器的要求低等特點(diǎn)。在此方法下制備出的納米粒，外觀良好，粒徑適中，重現(xiàn)性好。前期處方優(yōu)化過(guò)程發(fā)現(xiàn)表面活性劑的性質(zhì)和用量，脂質(zhì)材料的性質(zhì)及用量，投藥量均能對(duì)制劑的粒徑、電位和包封率產(chǎn)生顯著影響。脂質(zhì)材料的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)，可混合性以及藥物在熔融脂質(zhì)中的溶解度均為選擇脂質(zhì)材料時(shí)所需考慮的因素［11］。處方中選用的ATO888符合實(shí)驗(yàn)要求。實(shí)驗(yàn)中曾用無(wú)水乙醇溶解ATO888，但效果不佳，僅在加熱時(shí)能夠勉強(qiáng)溶解。在此狀態(tài)下制備而成的納米粒較為渾濁，粒徑較大，且分布不均。山崳酸甘油酯在氯仿中有較好的溶解性［12］，故選用氯仿作為溶解劑?？紤]到氯仿有毒性，因此氯仿用量較小，以能夠充分溶解處方量的ATO888為宜。并且在制備過(guò)程中，氯仿會(huì)隨之蒸發(fā)，使得納米粒中的氯仿無(wú)殘留。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，用氯仿溶解ATO888后制得的納米粒澄清透明，并伴有乳樣光澤。由于無(wú)水乙醇毒性較低，故選擇無(wú)水乙醇溶解丹參酮Ⅰ和大豆卵磷脂。

固體脂質(zhì)納米粒是一種多相分散體系，在儲(chǔ)存過(guò)程中存在藥物降解或是粒徑增大等問(wèn)題。通過(guò)對(duì)Zeta電位的測(cè)定評(píng)價(jià)膠體分散體系的穩(wěn)定性。一般來(lái)說(shuō)，較高的Zeta電位可通過(guò)粒子間電荷斥力降低粒子之間的凝聚［13］。本次實(shí)驗(yàn)，測(cè)得丹參酮Ⅰ-SLN的電位為（-9.35±0.12）mV，由于電荷間相互影響，相同的負(fù)電荷存在較強(qiáng)的排斥作用，使得帶電粒子存在較好的穩(wěn)定性［14］。

丹參酮Ⅰ作為丹參脂溶性有效成分中的代表成分，具有眾多的藥理作用，能夠預(yù)防肝細(xì)胞損傷及誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡［15］。眾多報(bào)道中丹參酮ⅡA的抗腫瘤作用已被證實(shí)，認(rèn)可。但在治療卵巢癌和前列腺癌上，丹參酮Ⅰ的抑制生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的作用要強(qiáng)于丹參酮ⅡA［16］。因而，對(duì)丹參酮Ⅰ的研究有待于提高，需開(kāi)發(fā)其更多的藥理作用，尋找更優(yōu)劑型，推動(dòng)新藥發(fā)展。

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Preparation and evaluation of TanshinoneⅠsolid lipid nanoparticles

ZHANG Qian1，2，LIU Zhi-dong1，2，QIN Lu1，2，GU Xing1，2，F(xiàn)ENG Guang-wei1，2
（1.Engineering Research Center of Modern Chinese Medicine Discovery and Preparation Technique，Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China；2.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China）

［Objective］To prepare TanshinoneⅠsolid lipid nanoparticles（TSⅠ-SLN）and investigate the physicochemical properties.［Methods］TSⅠ-SLN were prepared by using emulsion evaporation-solidification method，and the particle size，Zeta potential and encapsulation efficiency（EE）were determined.And the solid-state characterization ofthe TSⅠ-SLN was analyzed by DSC.［Results］The results showed that the TSⅠ-SLN had average particle size of（128±2.00）nm，zeta potential of（-9.35±0.12）mV and the encapsulation efficiency of（74.03±1.32）%，respectively.DSC results indicated that the drug wrapped in nanoparticles completely.［Conclusion］In this paper，emulsion evaporation-solidification method has chosen for the preparation.The TSⅠ-SLN has superior physical and chemical properties

TanshinoneⅠ；solid lipid nanoparticles；preparation；evaluation

R285.5

A

1673-9043（2016）02-0118-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.02.12

新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃（NCET-12-1068）。作者簡(jiǎn)介：張謙（1990-），女，碩士研究生，從事中藥制劑的研究。

劉志東，E-mail：lonerlizd@163.com。

（2015-11-18）