生甘草與炙甘草的抗氧化能力比較研究*

胡曉慧，代向東，李來來，閆海峰，王怡

（天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津　300193）

·中藥研究·

生甘草與炙甘草的抗氧化能力比較研究*

胡曉慧，代向東，李來來，閆海峰，王怡

（天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

［目的］對生甘草與炙甘草的抗氧化能力進(jìn)行比較。［方法］采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基法、鐵離子還原法、總抗氧化能力測試（ABTS法）以及福林試劑法測定藥物的抗氧化能力。［結(jié)果］生甘草與炙甘草均具有DPPH自由基清除能力、鐵離子還原能力和總抗氧化能力。［結(jié)論］生甘草與炙甘草均具有良好的體外抗氧化活性，實(shí)驗(yàn)表明炙甘草的抗氧化能力大于生甘草并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

生甘草；炙甘草；抗氧化活性

甘草為多年生草本植物，主要栽培在內(nèi)蒙古地區(qū)，來源于豆科（Leguminosae）甘草屬（Glycyrrhizin）植物烏拉爾甘草（Glycyrrhizauralensis Fisch.）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflate Bat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）的干燥根及根莖［1］。甘草的根和根莖主含三萜皂甙，其中60多種三萜類化合物，主要為甘草甜素，300多種黃酮素類化合物，多種香豆素類化合物，18種氨基酸，多種生物堿，多種有機(jī)酸和具網(wǎng)狀內(nèi)皮活性的甘草多糖等多種具免疫興奮作用的多糖［2］。依據(jù)《全國中藥飲片炮制規(guī)范》記載，先取原藥材，除去雜質(zhì)及蘆頭，大小條分開，浸泡至三四成熟，悶潤至透，切厚片，干燥。蜜甘草：取煉蜜用適量開水稀釋，加入甘草片拌勻，悶潤，至鍋內(nèi)，用文火加熱，炒至表面棕黃色，不黏手為度，取出放涼。在《中華人民共和國藥典》（2010版）中記載，甘草按照干燥品計(jì)算，甘草苷不得少于0.5%，甘草酸不得少于2%。炙甘草中甘草苷不得少于0.5%，甘草酸不得少于1%。甘草炮制后其化學(xué)成分發(fā)生變化，藥物的功效進(jìn)而改變，生甘草清熱解毒，炙甘草補(bǔ)脾益氣，生甘草多用于解毒、抗菌，炙甘草抗疲勞和抗氧化作用更明顯［3］。

自由基是指物質(zhì)分子在光或熱等外界條件影響下，共價(jià)鍵發(fā)生均裂，形成的含有不成對電子，它可以是原子、分子或者基團(tuán)，生物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除及氧化損傷與心血管疾病密切相關(guān)［4］。目前針對甘草抗氧化活性的報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)通過1，1-二苯基-2三硝基苯肼（DPPH）清除自由基能力、鐵子還原能力，總抗氧化能力和福林試劑法的測定，比較生甘草與炙甘草的抗氧化活性能力，為臨床使用提供理論依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。

1　儀器與試藥

1.1儀器多功能酶標(biāo)儀（Enpire，美國PerkinElmer公司），XW-80A微型漩渦混合儀（上海滬西儀器廠有限公司），微量移液器（Eppendorf），Costar-3599 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Costar公司）等。

1.2試藥

1.2.1試劑抗壞血酸（天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心，分析純20140910），DPPH（Sigma公司，101508320），三氯化鐵（天津市贏達(dá)希貴化學(xué)試劑廠，分析純20140929），鐵氰化鉀（天津市贏達(dá)希貴化學(xué)試劑廠，分析純20130318），三氯乙酸（天津市福晨化學(xué)試劑廠，分析純20150320），總抗氧化能力測試試劑盒（Solarbio公司，S0119），福林酚試劑（Solarbio公司），無水碳酸鈉（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司），沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品制品檢定所，純度大于98%，20140909），磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01mol/L，Solarbio，20131112），超純水（Milli-Q）其余試劑均為色譜純。

1.2.2藥材生甘草浸膏（中新藥業(yè)），炙甘草浸膏（中新藥業(yè)）。

實(shí)驗(yàn)使用的生甘草浸膏和炙甘草浸膏均為水提物，藥廠提供生甘草與炙甘草浸膏，生甘草生藥的濃度與炙甘草生藥的濃度一致，生甘草出膏率為28.65%，炙甘草出膏率為30.03%，通過甘草浸膏和生藥材的折換率計(jì)算得知，生甘草浸膏濃度為243.525 g/L，炙甘草浸膏濃度為255.255 g/L，通過實(shí)驗(yàn)性溶解最終確定生甘草和炙甘草浸膏的最大溶解度為250 g/L，由于浸膏折算生藥后的濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為比較生甘草與炙甘草的體外抗氧化活性，實(shí)驗(yàn)選用生甘草浸膏和炙甘草浸膏的濃度為250 g/L。

2　方法

2.1配制生甘草浸膏與炙甘草浸膏溶液精密稱取生甘草和炙甘草浸膏750 mg，置于15 mg離心管中，加入超純水3 mL，配制濃度為250 g/L的生甘草和炙甘草溶液，先經(jīng)超聲30 min，使用頻率100 Hz，之后使用離心機(jī)以3 500 r/min離心5 min，取上清液用于實(shí)驗(yàn)。

2.2生甘草與炙甘草對DPPH自由基清除能力的測定將樣品溶液以每孔100 μL依次加到96孔板中，以每孔100 μL加入濃度為0.16 g/L的DPPH溶液；將100 μL甲醇與100 μL樣品溶液混勻，作為空白對照組；最后將100 μL甲醇與100 μL的DPPH溶液均勻混合，以每孔200 μL依次加入，作為陰性對照組；使用濃度為0.2 g/L的維生素C作為母液，稀釋8個(gè)梯度，按上文步驟測定。在37℃下充分反應(yīng)50 min，在517 nm波長下測定A值，平行操作3次。清除率計(jì)算公式K=［1-（A1-A2）/A0］×100%，其中A1是測定樣品組對應(yīng)的A值，A2是測定空白對照組對應(yīng)的A值，A0是陰性對照組對應(yīng)的A值［5］。

2.3生甘草與炙甘草對鐵離子還原能力的測定

2.3.1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取沒食子酸（GAE）標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制10個(gè)濃度的樣品溶液。分別取不同濃度的樣品0.2 mL，分別加入1 mL PBS（pH 7.2）和1 mL鐵氰化鉀（1%，w/v），混合均勻后在50℃水浴鍋中加熱20 min。后加入1 mL三氯乙酸（10%，w/v）均勻混合后，取上清液1 mL加入1 mL超純水，加入0.2 mL的氯化鐵溶液（0.1%，w/v），室溫靜置30 min，在700 nm波長下測定吸光度，以甲醇-水代替沒食子酸作為空白組，以沒食子酸的濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，根據(jù)Y= 0.0055X+0.0739（r2=0.998）繪制沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2沒食子酸當(dāng)量的計(jì)算分別取生炙甘草溶液20 μL，加入980 μL甲醇配制成1 mL溶液，分別取0.2 mL，實(shí)驗(yàn)步驟同沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制備，樣品制備3份且3次平行實(shí)驗(yàn)。在700 nm下測定其吸光度，利用回歸方程求出供試品溶液中折合沒食子酸的濃度，即沒食子酸當(dāng)量?？瞻讓φ战M：最后步驟不加0.2 mL的氯化鐵溶液，用200 μL超純水代替［6］。

2.4生甘草與炙甘草總抗氧化能力的測試

2.4.1ABTS工作液的配制用移液器精密取200μL的ABTS溶液和200 μL氧化劑溶液，配制ABTS工作母液。室溫避光存放12～16 h后使用，在3 d內(nèi)穩(wěn)定。在使用前，把ABTS母液用PBS稀釋30倍即ABTS工作液。

2.4.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線使用PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，把10 mmol/L Trolox溶液稀釋成0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L。在96孔板的每個(gè)檢測孔中加入200 μL的ABTS工作液?？瞻讓φ湛准?0 μL的PBS溶液；標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測孔內(nèi)加入10 μL的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液；樣品檢測孔內(nèi)加入10 μL各種樣品，輕輕混勻［7］。室溫孵育6 min后測定其A值，測定波長為734 nm。

2.5生甘草與炙甘草的抗氧化能力

2.5.1福利試劑實(shí)驗(yàn)中沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別取沒食子酸溶液，用甲醇稀釋到濃度為10個(gè)濃度，分別取100 μL沒食子酸溶液加入500 μL福林顯色試劑，均勻渦旋30 s，加入400 μL的碳酸鈉溶液，在30℃下反應(yīng)90min，使用96孔板進(jìn)行檢測，每孔加入200μL混合液體，每個(gè)濃度平行測試3組，波長765 nm，以待測液的溶劑為空白對照組［8］。

2.5.2藥物的含量測定精密取生甘草浸膏溶液和炙甘草浸膏溶液各100 μL加入500 μL福林試劑，均勻渦旋30 s，加入碳酸鈉溶液400 μL，30℃條件下反應(yīng)90 min，用移液器取200 μL于96孔板中，藥物制備3份且平行實(shí)驗(yàn)3次。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法的波長測定其吸光度。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 17.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以P＜0.05為顯著性差異，繪圖軟件使用Graphpad Prism Version5.0。

3　結(jié)果

3.1生甘草與炙甘草清除DPPH自由基能力的比較實(shí)驗(yàn)采用體外清除DPPH自由基法［1］，通過SPSS 17.0分析軟件分析IC50作為指標(biāo)，結(jié)果見表1。

3.2生甘草與炙甘草對鐵離子的還原能力測定通過實(shí)驗(yàn)比較生甘草與炙甘草對鐵離子的還原能力，結(jié)果見表2。

表1　3種樣品對DPPH自由基清除能力的結(jié)果（±s）

表1　3種樣品對DPPH自由基清除能力的結(jié)果（±s）

注：與維生素C比較，**P＜0.01，與生甘草比較，##P＜0.01。

樣品nIC50生甘草浸膏溶液90.673 5±0.063 9**炙甘草浸膏溶液90.538 9±0.064 9**##維生素C溶液90.006 9±0.000 2

表2　生甘草和炙甘草的沒食子酸當(dāng)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果（±s）

表2　生甘草和炙甘草的沒食子酸當(dāng)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果（±s）

注：與生甘草比較，**P＜0.01。

樣品生甘草浸膏炙甘草浸膏n99沒食子酸當(dāng)量（GAE）（mg/L）0.571±0.001 0.641±0.002**

3.3生甘草與炙甘草總抗氧化能力的測試實(shí)驗(yàn)以Trolox的濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制Trolox溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。Y =-0.685 8X+ 1.059 5（r2=0.999 1）。見圖1。

圖1　不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品總抗氧化能力測試的標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過ABTS方法比較生甘草與炙甘草對自由基的清除能力，經(jīng)過SPSS17.0分析軟件分析，根據(jù)Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線，比較炙甘草與生甘草的體外抗氧化能力，炙甘草總抗氧化能力強(qiáng)于生甘草（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

3.4生甘草與炙甘草福林試劑法比較其抗氧化活性用沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.004 3X+0.098 6（r2=0.992 3），在1～500 mg/L圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。沒食子酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見圖3。

實(shí)驗(yàn)采用福林試劑法，對生甘草和炙甘草的總酚酸含量進(jìn)行了測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4，經(jīng)SPSS 17.0分析軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，雖然生甘草與炙甘草沒有顯著性差異但炙甘草的總酚酸含量高于生甘草的含量。

4　討論

研究表明外環(huán)境和內(nèi)環(huán)境中某些化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后參與代謝過程，產(chǎn)生大量活性氧自由基、內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)減少甚至耗竭，導(dǎo)致脂類、蛋白質(zhì)等生物大分子的改變，進(jìn)而引發(fā)疾病，抗氧化劑在體外實(shí)驗(yàn)中均有清除自由基的作用［9］?？寡趸瘎┛梢种苹钚匝踝杂苫a(chǎn)生或清除體內(nèi)有害的自由基，減少腫瘤、炎癥和心血管疾病等退行性疾病?？寡趸芰Φ脑u價(jià)需要一定條件，如自由基近似于生物體體系，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性強(qiáng)，進(jìn)行常規(guī)質(zhì)量控制等［10］。有學(xué)者提出自由基反應(yīng)是人體衰老的內(nèi)在機(jī)制之一，通過抑制自由基的過氧化反應(yīng)，可提升人體的抗氧化能力，對中藥的抗氧化研究也將成為心血管領(lǐng)域的切入點(diǎn)［11］。甘草味甘，其主要化學(xué)成分為三萜皂苷類、黃酮類和多糖類化合物，作為補(bǔ)益的方藥多體現(xiàn)在對氣血陰陽的調(diào)節(jié)作用［12］。

圖2　總抗氧化能力測試結(jié)果

圖3　沒食子酸溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4　福林試劑法測試結(jié)果

DPPH是一種以氮為中心的穩(wěn)定的自由基，加入抗氧化劑時(shí)DPPH的單電子被配對，溶液顏色與配對電子數(shù)呈劑量相關(guān)性［13］，鐵離子還原法中藥物的還原能力與普魯士藍(lán)生成量成正比［14］，ABTS+·是一種穩(wěn)定的自由基，在抗氧化劑的作用下形成綠色的ABTS，最大吸收峰在734 nm，Trolox當(dāng)量與藥物的抗氧化能力成反比［15］。福林試劑在堿性條件下可被酚類化合物還原呈現(xiàn)藍(lán)色，在765 nm波長處有最大吸收峰，實(shí)驗(yàn)以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品折算總酚酸含量比較其抗氧化能力［16］，本實(shí)驗(yàn)中炙甘草的抗氧化能力大于生甘草。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)說明炙甘草的抗氧化作用大于生甘草，甘草經(jīng)過炮制其抗氧化作用有所增強(qiáng)，其他藥理作用可進(jìn)一步研究。

在國際市場中甘草的市場份額和出口需求將逐年增長［17］，中藥的抗氧化作用的開發(fā)利用在醫(yī)療衛(wèi)生和護(hù)膚美容等方面均有應(yīng)用，但其化學(xué)成分和物質(zhì)基礎(chǔ)的研究還需進(jìn)一步深入［18］。

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Comparative study of antioxidant capacity between Shenggancao and Zhigancao

HU Xiao-hui，DAI Xiang-dong，LI Lai-lai，YAN Hai-feng，WANG Yi（Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To compare antioxidant capacity between Shenggancao and Zhigancao.［Methods］Using the DPPH free radical，Iron ions reduction method，total antioxidant capacity test，Welfare reagent method to determine the antioxidant capacity of drugs.［Result］Shenggancao and Zhigancao all has DPPH radical scavenging capacity，ferric ion reducing power and the total antioxidant capacity.［Conclusion］Shenggancao and Zhigancao all has good antioxidant activity in vitro，experiments show that antioxidant capacity of Zhigancao better than Shenggancao，it has significant difference（P＜0.01）.

Shenggancao；Zhigancao；antioxidant activity

R285.5

A

1673-9043（2016）02-0114-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.02.11

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2012CB518404）。作者簡介：胡曉慧（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榉絼W(xué)。

王怡，E-mail：13212268020@126.com

（2015-11-10）